当不采用子读点时,为终点法,采用最大时间吸光度和空白吸光度进行计算。
说实话,真不知道这个方法是做什么项目的,中文没有解释,英文的解释很少,也没发现实例。
图7CRP固定点法示意图
IMA反应方法:
也就是免疫比浊法。
是采用最小二乘法计算的速率法。
对于R1的加入量太少,无法进行E2计算时,这个方法就变得有用了。
也就是说,在很多免疫比浊项目里,R1的加入量往往小于R2的量,所以引发了一系列的计算和判别上的困难,IMA就是为了解决这个难题的。
样本和第一试剂加入量太少,就无法进行E2的计算,没有E2就无法进行前带监测和底物耗尽的监测,所以在IMA方法中R2之后插入监测点CheckD.P.I,用于弥补R1和S的不足。
采用IMA方法设置检查点后,系统自动计算limitvalues值(设备默认0.003),此法对浑浊样本的处理很有成效,所以用在免疫比浊项目上。
图8IMA免疫比浊法示意图
图9IMA应用示意图
IMA的其它使用方法与速率法一样,仅限于R1+S低于反应杯最小容量的测试项目里。
如果不存在这样的项目,那么即便是免疫比浊项目,也应该采用常规速率法或终点法。
定标方法:
因数定标、线性定标和非线性定标;
在参数界面里的Calcmthd,也就是计算方式里,有ABS和STD/MSTD选择,表示吸光度和单点定标/多点定标计算。
在ADVIA的所有机型里,定标中的零浓度点用试剂空白替代,所以在定标之前要做试剂空白,如果不做试剂空白,仪器会认为试剂空白就是原点。
注意这个差别,与奥林巴斯的不同。
奥林巴斯的试剂空白和零浓度校准点是两个概念,而在adiva里合二为一。
参数界面里的Formula,也就是公式才是选择定标方法的地方。
因数定标:
如果在Calcmthd里选择ABS,那就意味着你要采用因数定标,那么在Formula里只有一个可以选择,那就是Linear,因数定标只能用于线性定标。
因数定标也就是直线方程里的Y=KX+B中的K,所以也叫K值定标法。
而B的确定则需要试剂空白,所以因数定标法必须做试剂空白,然后结合给出的K值进行定标曲线的绘制,然后依据这个曲线进行浓度计算。
在Advia中,K值的给出是在参数界面的Standardssetting中的FV中。
线性定标:
线性定标需要两个点才能决定一条直线,我们一般给出一个零浓度点,一个带有浓度的标准点,这样仪器就会自动进行计算。
而Advia中零浓度点在试剂空白里给出了,所以对于两点线性定标来说,只需要在给出一个校准点就可以了。
所以在Advia的手册里,线性定标叫做一点线性。
而且Advia的所有校准点,无论是线性还是非线性,零浓度点都不计算在内,只数带有浓度的校准点,比如5点定标,加上零浓度点其实就是6点;而6点定标,加上零浓度点就是7点。
不过,要指出的是,Advia的试剂空白并不是强制性的,这一点与奥林巴斯不同。
不进行试剂空白检查的项目,默认试剂空白也就是零浓度点的值是通过原点的。
下面给出两张图,一张做过试剂空白的线性定标,一张是没有做过试剂空白的线性定标。
图10没有做试剂空白的线性定标
由于假设所有没有做过试剂空白的线性定标的零浓度点都通过原点,所以图中的蓝线则是默认的校准曲线,但实际上并非如此。
如果提前没有做试剂空白,仪器也会自动做上,这样就会出现两个点,图中的两个红点就是。
左下角是零浓度点,右上角是标准店。
但蓝色的定标曲线却是右上角的红点和原点的连接,而不是与零浓度点连接。
这样的结果我们都知道会有错误,因为真正计算的是按照蓝色直线计算,而红色的我自己画上去的示意线条才是真正的计算直线。
要解决这个问题,只有重测试剂空白重新执行定标才行。
下图是做过试剂空白的线性定标图例
图11做过试剂空白的线性定标示意图
而在statisticalData里的FV就不是因数了,而是定标点的浓度。
上面两张图很清楚的告诉我们,一点线性定标,有一个Blank试剂空白,FV为0.00,而STD值只有一个,就是标准点的值。
图12Advia一点线性定标示意图
在线性定标中也有多点定标,例如同工酶法。
在Advia中,线性多点定标多是用来拟合一元三
(二)次直线方程。
对此有三种方法,由于很少使用,所以仅仅图示,不做解释。
图13无变换一元三次直线方程定标
图14对数线性变换的一元三次线性方程定标
图15对数变换的一元三次线性方程定标
同时,Advia还提供一元二次线性方程定标。
非线性定标:
Advia的非线性定标有Logit-Log1、Logit-Log2、Logit-Log3和Spline样条曲线、Iinegraph折线五种。
图16Logit-Log1非线性定标示意图
图17Logit-Log2非线性定标示意图
图18Logit-Log3非线性定标示意图
图19Iinegraph折线非定标曲线示意图
图20Spline样条非定标曲线示意图
在多点定标中,由于试剂随着使用时间的推移性能会发生改变,其中包括颜色的改变。
所以每天开机画面中会提供简单定标(Simplifiedcalibration)这个选项,原理是根据前后试剂空白修正整条定标曲线。
图21Simplifiedcalibration简单定标示意图
在图11中,左侧是定标细则的选项,其中,Calc.mthd表示计算方法,有ABS(因数法)、1-Point(1点定标)和Multi-Point(多点定标)三个选项;
在AxisConv.轴线变换中,有NoConv.(不变换)、Log.-Linear(对数线性)和Log.-Log.(对数)三种选择;
在MultipointFormula(多点公式)中,有Linear(线性定标)、quadratic(一元二次直线方程定标)、Cubic(一元三次直线方程定标)、Spline(样条曲线)、LineGraph(折线)、Logit-Log1、Logit-Log2和Logit-Log3等8种方式;
在#calStds里,要填写包括试剂空白在内的校准点数量。
图22多点非线性定标示意图
从图中我们看到,四个校准品的数值成梯度倍比关系,但无法做出满意的样条曲线,是否需要改为对数曲线还需要观察。
图23原厂试剂多点非线性定标示意图
这是原厂的IgM定标曲线,没有做试剂空白。
定标浓度并非梯度倍比稀释,但只有这样才能保证Logit-Log3曲线的完美。
好像国外很少使用样条曲线定标。
而这个项目恰恰是样条曲线。
如果用最高浓度倍比梯度稀释,就会得到一幅漂亮的样条曲线。
三、读点前移:
前面说过,Advia的读点前移技术是为了应对底物耗尽的速率反应,采用样本吸光度限制Sampleu/d和试剂空白限制Blanku/d来进行计算和判断。
要知道是,底物耗尽有时并不是因为样本的浓度或活性太高导致的,试剂污染或失效也有可能。
所以读点前移技术和底物耗尽判断,从另一个方面讲,也是对试剂性能的一个监测。
由于底物耗尽仅仅存在于速率法的反应当中,所以这里描述的均为速率法。
下面两张图就是超过Sampleu/d限制后的底物耗尽图例:
图24间接或相反反应超过Sampled限制的底物耗尽反应图示
图25直接反应超过Sampleu限制的底物耗尽反应图示
注意图25中27点出现的拐点,这已经是不明显的底物耗尽的表现。
下图是极端情况下的试剂空白限制的图例
图26试剂空白图例
通过试剂空白计算出来的Blanku/d值与样本测试时主读点区主波长吸光度值进行比较,如果超出这个范围将会用U/D来标示结果,以提示操作人员该结果不可靠。
在直接反应中,也就是单试剂项目里:
在间接反应中,也就是双试剂项目里:
这就是结果里“U/u/D/d”这四种旗标的来历。
下面举例说明读点前移技术的使用:
图27读点前移举例1
图27中的三个曲线:
红色是试剂空白,蓝色是正常样本曲线,绿色是异常样本曲线。
图中有两天竖线,一个E2,一个是checkD.P.I,那么根据图示可以得到以下数据:
E2吸光度值试剂空白修正E2(E2-试剂空白)
试剂空白0.10-
正常样本0.500.40
异常样本0.600.50
那么经过体积修正过的E2是要计算修正系数的,而修正系数=(R1+S)/(R1+S+R2)。
这里假设R1是80,S是16,R2也是16,这样修正系数就是0.875。
那么经过体积修正过的正常样本E2就是0.343,异常样本E2就是0.429。
根据试剂空白的原则,Blanku应该是0.40,Blankd应该是0.05。
图28读点前移举例2
图28的例子里,红色为试剂空白,绿色为异常标本2,蓝色为异常标本1。
很明显,异常标本1是典型的底物耗尽反应,而异常标本2貌似没有问题,但R2加入之前就过高了。
E2吸光度值试剂空白修正E2(E2-试剂空白)
试剂空白-0.0041-
正常样本2.61192.6160
异常样本1.71541.7195
经过体积修正后的E2分别是:
异常样本1为2.242,异常样本2为1.474;
Blanku值设为0.20,Blankd值设置为0.01。
异常样本1的差值0.224大于Blanku的0.20,又是间接反应,所以结果报告U;
异常样本2的差值-0.007,小于Blankd的0.01,又是间接反应,所以结果报告d。
而在参数设置里,Blanku/d往往被设置成±
样本吸光度限制Sampleu/d在底物耗尽中的用途呢?
其与试剂空白Blanku/d可以同时,也可以单独使用,监测底物耗尽依然有一定的作用。
图29样本吸光度限制Sampleu/d在底物耗尽判断中的示意图
图29的上图是选择点吸光度值大于Sampleu,下图是选择点吸光度值小于Sampled,所以都被判断为底物耗尽。
下面举例说明计算方法:
图30Sampleu/d判断底物耗尽的例子
图中红色为试剂空白,蓝色为异常样本。
试剂空白的E2为-0.004,样本的E2为0.6127;
Sampleu/d=1.25-[0.6127-(-0.004)]*{[16(S)+80(R1)]/[16(S)+80(R1)+16(R2)]}=0.7215;
经过修正后的曲线就是蓝色虚线部分,那么主读点区的最后两个点的吸光度也就是选择点的吸光度值只有0.250,远远小于Sampled的0.7215(图中放宽到0.750),所以判定为底物耗尽。
(下降反应是Sampled,上升反应是Sampleu)。
图31读点前移的各种可能图示
当然最理想的状况是左侧的红色箭头,如果是右侧的红色箭头,即便是读点前移也毫无意义。
由此可知,Advia的读点前移技术相当的复杂,并不是那么容易掌握,而且在前移点的选择上也很令人抓狂,远不如东芝的弹性速率法简单。
不过,利用这种技术不仅可以判断试剂问题,也可以判断反应过程中的问题,还是很有帮助的。
四、前带监测:
Prozone前带监测功能是几乎所有生化仪都拥有的,Advia系列也不例外。
更何况Advia强调免疫比浊功能,所以前带监测的设置与IMA的设置在一起,同在参数界面的一个区域里。
图32前带监测界面示意图
前带现象可能会导致实际结果偏低,这与底物耗尽类似,但在曲线上,而且截然不同。
在前带监测选择里,前带计算公式可以选择前带公式(用于终点法项目),也可以选择速率公式(用于速率法项目)。
无论选择什么公式,ProzoneLimit前带范围都要输入,这也是前带发生反应的实际吸光度值,超过这个值就会判定是前带反应。
Prozonejudge是前带的反应方向,这个方向决定是高于还是低于ProzoneLimit值,来判断前带现象。
如果选择速率公式,那么必须输入judgelimit的值,这个值低于前带子读点的吸光度值,将不进行前带检查。
下面举例如何使用前带监测:
图33前带监测举例
图中的实线是正常样本,虚线是前带样本。
––r53=0.400。
主读点与子读点的吸光度差为0.350。
把这个数值作为ProzoneLimit值。
––r53=0.667。
主读点与子读点的吸光度差为0.049。
Prozonejudge设置为向下范围,0.049小于0.350,所以发生前带现象,因此结果带有p标示,提醒操作人员注意。
如果是低浓度反应,可以讲前带主读点设置在启动反应之后的几个点,而子读点可以设为0不用。
下图是Advia1650的设置参数,R2加入点为49点。
图34前带监测的设置举例-Advia1650
而在速率法中,前带的现象也会导致结果偏低。
图35速率法前带现象图示1
上图中曲线A是高浓度校准品,曲线B是同值的高浓度样本。
校准品由于经过处理,所以不会存在前带反应,而样本则不然,几乎无法避免。
图36速率法前带现象图示2
上图可以看出,主读点区内的速率相差很大,高浓度校准品速率为0.050,高浓度样本的速率为0.031,由此计算出来的浓度值或活性值将会相差很大。
图37速率法前带监测的计算图示
––r56=0.046,速率比值mn/pr=0.96,把这个值当做ProzoneLimit值。
––r56=0.177,速率比值mn/pr=0.12。
Prozonejudge设置为向下范围,0.12小于0.96,所以发生前带现象,因此结果带有p标示,提醒操作人员注意。
如果是低浓度标本,会不会导致误判呢?
下面举例说明:
图38低浓度样本速率法前带监测图示
曲线A还是高浓度校准品,曲线C为低浓度样本,图中看出没有前带现象。
––r56=0.016,速率比值mn/pr=0.44。
Prozonejudge设置还是为向下范围,ProzoneLimit值还是0.96,那么0.44小于0.96,还是会报告前带现象,结果p表示。
为了解决这个误报,在速率法进行前带监测时,要采用JudgeLimit值,这个值低于子读点的吸光度中间值时,将不进行前带检查。
下图就是参数设置画面:
图39低浓度样本前带监测设置图示
这样设置,低浓度样本就不会进行前带监测。
这也是为什么出现前带现象后,稀释样本重测的原因。
综上所述,我们知道,设置前带监测需要使用没有前带现象的样本或校准品进行ProzoneLimit和JudgeLimit的计算,同时也要知道前带现象的方向,从而设置Prozonejudge,还要清楚的知道前带主子读点的设置位置。
前带子读点一般在启动反应后的几个点,前带主读点一般在启动反应后的最后几个点。
前带读点与计算读点并不冲突。
同时前带监测与底物耗尽监测也不冲突。
需要指出的是,启用前带监测,速率法效果非常明显。
而对于终点法,特别是两点终点法来说,效果并不是很明显,浓度或活性差别并不大。
五、参数设置:
Adiva系列由于型号不同,版本不同,参数界面也有所不同,但都大同小异,区别仅仅在四种试剂或两种试