溶菌酶的提取纯化及纯度测定.docx
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溶菌酶的提取纯化及纯度测定
溶菌酶的提取纯化以及纯度鉴定实验者：
钟吴宇豪绿药1501班201530360127同组者：
连学帆韩家鑫实验地点：
东配302实验日期：
2017年5月26日-5月27日报告完成日期：
2017年5月28日指导老师：
易喻
【摘要】溶菌酶是一种具有水解细菌细胞壁能力的蛋白质，工业上通常以蛋清为原料，在pH6.5条件下用弱酸性阳离子交换树脂732吸附后，再用硫酸铵洗脱，经透析后冷冻干燥得到，在医学及食品商具有广泛应用。
本文中我们通过等电点沉淀法对溶菌酶进行粗提取，然后通过离子交换层析进一步除去杂蛋白，提纯所得的溶菌酶粗品，并且通过紫外分光光度计检测溶液吸光度来对最后的产品进行纯度及产率鉴定，确认得到了纯化倍数较高但产率较低的溶菌酶产品。
Lysozymeisaproteinofbacterialcellwallhydrolysisability,theindustryusuallywitheggwhiteasrawmaterial,732exchangeresinadsorptionwithweaklyacidiccationundertheconditionofpH6.5,withammoniumsulfatewasdialyzedafterfreezedrying,iswidelyusedinmedicineandfoodbusiness.Inthispaperwebyisoelectricpointprecipitationmethodforcrudeextractionoflysozyme,followedbyionexchangechromatographytoremoveimpurityprotein,lysozymecrudepurified,andthemeasuredabsorbanceofthepurityandyieldofthefinalproductidentificationofUVspectrophotometry,confirmedthepurificationfactorwashighbutlowyieldthelysozymeproduct.
【关键词】溶菌酶，等电点沉淀法，离子交换层析，酶活，提纯【引言】对溶菌酶的研究始于20世纪初,人们发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶,因其具有溶菌作用,故命名为溶菌酶。
1937年Abraham和Robinson从卵蛋白中分离出溶菌酶晶体,揭开了研究溶菌酶的历史篇章。
它广泛存在于鸟类、家禽的蛋清中和哺乳动物的泪液、唾液、血浆、乳汁、胎盘以及体液、组织细胞内,其中在蛋清中含量最丰富（约0.13%）在一些植物体如卷心菜、萝卜、无花果和微生物体内也存在溶菌酶,只是含量差异较大。
溶菌酶（1ysozyme）又称胞壁质酶、N-乙酰胞壁质聚糖水解酶。
它能水解细菌细胞壁N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡葡糖之间的β-1,4糖苷键,破坏肽聚糖支架,低滲溶液中细胞在内部滲透压的作用下胀裂开,引起细菌裂解。
溶菌酶主要溶解革兰氏阳性菌的细胞壁。
溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质,又具有溶菌作用,因此可用作食品防腐剂。
目前已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐,溶
菌酶属于冷杀菌,在杀菌防腐过程中不需加热,因而避免了高温杀菌对食品风味的破坏作用,尤其对热敏感的物质更具有重要意义。
还可以添加到乳粉中,使牛乳人乳化,以抑制肠道中腐败微生物的生存,同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖。
此外,还能利用溶菌酶生产酵母浸膏和核酸类调味品。
在生物工程研究上，随着生物科学的发展,溶菌酶已成为基因工程及酶工程中必不可少的工具酶。
在医疗中，溶菌酶对G+、枯草杆菌等有很好的杀灭作用,对大肠杆菌、普通变球菌等G-也具有一定程度溶解。
此外,溶菌酶与抗菌素合用效果更佳,因而,溶菌酶广泛应用于医药行业,如利用溶菌酶治疗各种五官科炎症,尤其对急性炎症如急性咽炎、急性喉炎、急性中耳炎等效果明显。
溶菌酶在畜禽饲料中，由于溶菌酶本身是一种天然蛋白质,无毒性,是一种安全性高的饲料酶,它能专一性的作用于目的微生物的细胞壁,而不能作用于其它物质。
该酶对革兰氏阳性菌、枯草杆菌、耐辐射微球菌有很强分解作用。
为了从鸡蛋清中提取并提纯得到的溶菌酶，我们分别采用了等电点沉淀法得到了溶菌酶粗品，然后通过离子交换层析提纯得到的样品，最后测定了所制的溶菌酶活性及蛋白质含量。
【实验部分】
1.1试剂与仪器
1.1.1试剂250mL烧杯、玻璃棒、小漏斗、定性快速滤纸、50mL量筒、50mL离心管、鸡蛋1只、0.02mo1/LPBS（pH7.0、pH8.0、）,lmLEp管,pH计,移液管1m1、冰醋酸、5mo1/LNaOH,滴管,离心管，样品S1、S2、S-2,CM一纤维素高子交换介质.,0.02mo1/LpH8.0的PBS,0.6mo1/LNaC1,烧杯（50mL,250mL）、桔草芽胞杆菌过夜培养物（37℃,18h,160r/min,100/250mL）、0.02mo1/LpH8.0的PBS（测活缓冲液,含50mmo1/LNaC1）,0.2mo1/LpH8.0的PBS。
1.1.2仪器
分光光度计、揺床、高速离心机，分部收集器,核酸蛋白质检测仪,记录仪,高速离心机（可用50mL离心管）,冰箱,可见光分光光度计、揺床、烧杯、玻璃棒、漏斗、滤纸等。
1.2实验方法
1.2.1实验原理
溶菌酶是一种葡萄糖苷酶,其化学性质稳定,干燥条件下在室温可长期保存而活性不丧失。
在自然界中广泛存在,其中以禽类蛋清中含量较高,鸡蛋中占蛋白总量的3.5%,所以我们选择使用鸡蛋清来提取溶菌酶。
鸡蛋清中溶菌酶由18种129个気基酸残基组成的单肽链蛋白质,分子中含有4个二硫键,等电点为10.8,对温度和酸不敏感,在弱碱性条件下稳定。
鸡蛋清中含13%~15%的蛋自质,除溶菌酶以外,还有其他的的蛋白质,其主要特点分别如下:
由此可见，其中大部分的杂蛋白与溶菌酶的等电点都具有很大的不同，所以我们使用等电点沉淀法来对溶菌酶进行粗提取。
等电点沉淀法是利用蛋白质在等电点时溶解度最低而各种蛋白质又具有不同等电点的特点进行分离的方法。
在等电点时,蛋白质分子以两性离子形式存在,其分子净电荷为零（即正负电荷相等）,此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥,分子相互之间的作用力减弱,其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀,所以蛋白质在等电点时,其溶解度最小,最易形成沉淀物。
等电点时的许多物理性质如黏度、膨胀性、渗透压等都变小,从而有利于悬浮液的过滤。
为了提纯得到的溶菌酶粗品，我们选择了离子交换层析，离子交換层析（简称为IEc）是依据各种离子或离子化合物与高子交換剂的结合力不同而进行分离纯化的。
目前广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。
离子交换剂是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的,可以分为三部分:
高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。
电荷基团与高分子聚合物共价结合,形成一个带电的可进行高子交换的基团。
平衡高子是结合于电荷基团上的相反离子,它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。
平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用,称为阳离子交换剂;平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用,称为阴离子交换剂。
离子交换过程如下反应方程:
其中R代表离子交换剂的高分子聚合物基质,X-和M+分别代表阳离子交换剂和阴高子交换剂中与高分子聚合物共价结合的电荷基团,Y+和N-分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂的平衡离子,A+和B-分别代表溶液中的离子基团。
从上面的反应式中可以看出,如果A离子与离子交换剂的结合力强于Y离子,或者提高A离子的浓度,或者通过改变其它一些条件,可以使A离子将Y离子从离子交换剂上置換出来。
也就是说,在一定条件下,溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来,并通过电荷基团结合到固定相上,而平衡离子则进入流动相,这就是离子交換层析的基本置换反应。
通过在不同条件下的多次置換反应,就可以对溶液中不同的离子基团进行分离。
比如说，阳离子交换剂的电荷基团带负电,装柱平衡后,与缓冲溶液中的带正电的平衡离子结合。
待分离溶液中可能有正电基团、负电基团和中性基团。
加样后,正电基团可以与平衡离子进行可逆的置换反应,而结合到离子交换剂上。
而负电基团和中性基团则不能与离子交换剂结合,随流动相流出而被去除。
通过选择合适的洗脱方式和洗脱液,如增加离子强度的梯度洗脱。
随着洗脱液离子强度的增加,洗脱液中的离子可以逐步与结合在离子交换剂上的各种正电基团进行交換,而将各种正电基团置换出来,随洗脱液流出。
与离子交换剂结合力小的正电基团先被置换出来,而与离子交换剂结合力强的需要较高的离子强度才能被置换出来,这样各种正电基团就会按其与离子交换剂结合力从小到大的顺序逐步被洗脱下来,从面达到分离目的。
在本试验中我们通过离子交换剂将杂质蛋白洗脱出来从而提纯所得的溶菌酶样品。
并且通过考马斯亮蓝法来鉴别蛋白质的含量，考马斯亮蓝G_250比色法是常用的一种蛋白质含量的测定方法。
1976年由Bradford建立,用于测定蛋白质浓度。
考马斯亮蓝G-250是一种染料,在酸性溶液中为棕红色,最大光吸收波长为465nm。
它能与蛋白质通过疏水作用结合,形成蛋白质一染料的复合物,颜色由红色转变为蓝色,在595nm波长下有最大吸收值,并且在低浓度范围内（0.01-1.0mg/m1）,与蛋白质浓度的关系服从比尔定律。
该法操作简単,反应迅速,2min左右即达到平衡,而且灵敏度很高,可测微克级的蛋白质含量,所生成的染料一蛋白质颜色稳定,实验重复性好,抗干扰性也强,现已广泛应用于蛋白质含量的测定。
被测蛋白质与标准蛋白质氨基酸组成差异较大时,有一定误差,因为与染料结合量不同。
之后通过测定枯草芽孢杆菌的吸光度降低来得到样品的酶活，对所得样品的纯度和收率进行了客观的分析。
1.2.2数据处理注意事项
根据酶的动力学特性可知,在特定的时间段,酶促反应的速度是相等的,即产物浓度随时间成线性变化。
根据此特性,将所得数据在坐标纸上作图,以时间为横轴,0D（595）值为纵轴,将数据定位后,根据拟合直线的斜率,即为单位时间内0D值的下降值,然后再除以0.001,即可得到所取测量酶液的活力单位。
除以酶液体积,即可得到酶浓度（u/mL）。
溶菌酶活力单位（u）=△0D/0.001其中△0D为一分钟内0D值的下降值1.3操作步骤
1.3.1溶菌酶的粗提取
↓
用冰酷酸调pH4.7左右,充分搅拌
↓
4000rpm,离心10min
↓
弃沉淀,转移上清至烧杯中
↓
加入1.0倍体积的0.02M,pH8.0PBS缓冲液,搅拌均匀,并用5mo1/LNaOH调pH8.0↓
滤纸过滤,取清液,测量并记录体积v2
↓
取1.0mL清液于1mLEp管,制备2管,4℃备用（样品S2）
↓余下的清液放在100mL烧杯中4℃保存备用.（样品s2）
1.3.2溶菌酶的分离纯化
1、装柱
取20mLCM纤-维素离子交換介质,1.0x40cm层析柱,以0.02MPBS,pH8.0为缓冲液装柱。
注意不能使介质露出水面,因为介质露于空气中,当加入溶液时,介质间隙中会产生气泡,而使交換不完全。
对子重复使用的填料,需要先冲3倍柱床体积蒸馏水,将保存用的乙醇洗脱出来。
2、平衡
用泵将3倍于柱床体积的0.02MPBSpH8.0过柱。
这一步的作用是使得柱床体系的内外达到平衡与均一,以利后续目的蛋白的结合。
3、上样
用泵将S-2样品泵入层析柱,经过一段时间之后,蛋白将通过离子交換的方式,与介质相互作用而挂柱。
注意观察并记录280nm下吸收值的变化。
4、淋洗
用3~4cv0.02mo1/LpH8.0的PBS洗涤离子交换柱至无穿透峰为止,收集穿透峰S3,流速约1.5mL/min。
取约1mL于Ep管4°C保存备用.。
5、洗脱
分别用3~4cv含0.2mo1/LNaC1的PBS（0.02mo1/L、pH8.0）缓冲液和3~4cv含0.6mo1/LNaC1的PBS（0.02mo1/LpH8.0）进行阶段税度洗脱。
收集洗脱峰S4,记录洗脱时间和洗脱峰体积V4。
取1.0mL清液于1mLEp管中,制备2管,4℃备用（留样S4）。
（洗脱时得到两个峰，所以最后还得到了S5）
6、再生
用泵将2倍柱体积的2mo1/LNaC1过柱,然后水洗4倍柱体积。
洗脱完成后,需要进行高子交换填料的再生处理。
离子交换基团为一些盐所覆盖,影响下次的重复使用。
因此,先用高浓度的盐将与介质结合紧密的杂质洗脱下来,然后再恢复其离子交換功能。
对于CM-纤维素而言,只需要用水过柱即可以使其离子交換功能得到恢复。
7、保存
用泵将2倍柱体积的20%乙醇过柱。
介质回收用于蛋白质分离纯化的介质多保存于液体中。
保存时需加入一些抑菌剂,如叠氮化钠等。
对于本介质,只需采用20%乙醇保存即可。
对于洗脱下来的样品,我们无法确证是否含有溶菌酶。
因此需要进行监测。
一般采取活性监测的方式。
本实验中利用溶菌酶水解枯草芽孢杆菌细胞壁,使得枯草芽孢杆菌裂解,以595nm下光吸收值的变化来确定溶菌酶所在的吸收峰。
1.3.3溶菌酶活性测定
取6mL枯草芽孢杆菌的过夜培养物,3500rpm常温离心5分钟,弃上清,沉淀用6mL0.02mo1/LPBS缓冲液悬浮,利用可见光分光光度计测其0D5g5并记录（吸光度在0.5~1.0范围,如果读数过高可适当稀释）。
比色皿编号见下表,其中1只加入PBS作为仪器调零空白,2作为对照,3、4用于平行测定然后取平均值）,30s测定一次吸光度值,约3min内至吸光度达到稳定。
比色皿
1
2
3
4
PBS缓冲液/mL
3
/
/
/
细胞PBS悬液/mL
/
3
2.9
2.9
分别用酶液S1~S4/mL
/
/
0.1
0.1
在室温,以1号管为对照,每隔30s分别测定2、3、4在595
nm的吸光度。
时间（s）
0
30
60
90
120
150
180
2号
3号
4号
1.3.4溶菌酶蛋白质含量测定
1.3.4.1利用考马斯亮蓝制备蛋白质标准曲线
在6支试管中,分别精确吸取牛血清蛋白原液0.20,0.40,0.60,0.80,1.00m1,用蒸馏水全部稀释至1.0m1,然后分别加入5.00m1考马斯亮蓝溶液,混合均匀,于（25士1）℃的恒温水浴中保温10min,冷水浴中冷却后,立即于595nm波长处比色测定。
以1.00m1蒸馏水代替样品液,加入5.00m1考马斯亮蓝溶液,其余操作同上,做空白对照。
以试管中标准蛋白的总量（ug）为横坐标,相应的吸光度值为纵坐标作标准群曲线图,并作线性回归,求线性方程。
1.3.4.2未知样品蛋白质含量测定将S1，S2,S3，S4，S5作适当稀释（使其测定值在标准曲线的直线范围内）,取1.00m1稀释液于试管中,按上述相同方法加入考马斯亮蓝溶液并比色测定。
根据所测定的OD值,由标准曲线线性方程,计算出未知样品的蛋白质质量浓度（mg/m1）。
【结果与讨论】
1.离子交换层析谱图
2.
图1.离子交换层析图谱
第一个峰为S3.第二个峰为S4，第三个峰为S5.（由于出现了断电的意外情况，谱图受到了些许影响，万幸时间较短，没有对谱图走向形成大的影响）
3.
蛋白质标准曲线的制作
表1.蛋白质含量与吸光度关系表
蛋白质含量
/μg
20
40
60
80
100
吸光度
0.138
0.240
0.336
0.426
0.526
图2.蛋白质标准曲线
4.未知样品蛋白质测定
表2.未知样品吸光度与蛋白质含量记录表
样品名
稀释倍数
吸光度
蛋白质含量/μg/mL
S1
200
0.846
33391.7
S2
200
0.384
14141.7
S3
20
0.758
2972.5
S4
1
0.523
99.6
S5
2
0.461
173.5
4.通过酶促反应的速度得到酶液活力单位及酶浓度
表3.S1溶菌酶活性测定表
时间/s
30
60
90
120
150
180
2号
630
627
626
625
626
625
3号
626
627
626
624
621
619
4号
630
624
614
602
593
585
表4.S2溶菌酶活性测定表
时间/s
30
60
90
120
150
180
2号
547
546
547
548
548
549
3号
588
570
556
542
533
522
4号
566
553
538
525
515
504
表5.S3溶菌酶活性测定表
时间/s
30
60
90
120
150
180
2号
0.626
0.627
0.626
0.626
0.626
0.626
3号
0.604
0.603
0.604
0.604
0.604
0.604
4号
0.600
0.559
0.600
0.600
0.601
0.600
表6.S4溶菌酶活性测定表
时间/s
30
60
90
120
150
180
2号
0.614
0.615
0.614
0.614
0.614
0.615
3号
0.601
0.602
0.602
0.602
0.602
0.602
4号
0.619
0.618
0.618
0.618
0.618
0.618
表7.S5溶菌酶活性测定表
时间/s
30
60
90
120
150
180
2号
0.612
0.611
0.610
0.611
0.610
0.611
3号
0.595
0.583
0.573
0.563
0.553
0.544
4号
0.584
0.573
0.563
0.551
0.540
0.529
显而易见，S3,S4没有酶活性，因此不做下一部分处理
图3.S1样品的酶活性曲线
图4.S2样品的酶活性曲线
图5.S5样品的酶活性曲线
统计数据可得到表：
表8.样品与参数分析表
样品及参数
体积/ml
蛋白含量
/mg/ml
酶活/U/ml
比活/u/mg
鸡蛋蛋清
V1=25mL
33391.7
10.998
0.0033
S1
1mL
沉淀上清
V2=
14141.7
25.488
0.0180
S2
1mL
淋洗液
V3=
2972.5
0
0
S3
1mL
洗脱液
V4=
S4
ml
99.6
0
0
S5
ml
173.5
21.147
1.2188
纯化倍数
369.3
纯化收率
随着实验过程的进行，蛋白质含量不断降低，酶活性则是在提高，比活性不断提高（S3.S4由于洗脱时含酶量少，没有体现出活性）。
5.误差分析牛血清蛋白标准曲线所得到的R的平方有三个9，说明线性良好，遇到的误差较小，并且点的分布也比较均匀。
从最后的样品参数分析表上看，我们可以得知随着溶菌酶的提纯，蛋白质含量一直在减少，说明提纯过程中不断有杂质蛋白被除去，S4的蛋白含量低于S5，可能是由于最后洗脱的时候杂质蛋白的量已经很少，所以S4作为杂质蛋白（S3.S4均没有酶活性，说明都是杂质蛋白）被除去的也并不多了，最后S5中主要是最后被洗脱的溶菌酶，所以S5蛋白含量高于S4.从酶活性上上看，总酶活也呈现着总体下降的趋势，酶活则相反，虽然最后得到的S5酶活低于S2，但是S5的蛋白质含量远低于S2，因此比活力不断上升，说明溶菌酶纯度在不断提升。
最后得到S5的的纯化倍数为369.3倍，可见柱层析的分离效果显著，但是蛋白质和酶损失也很严重，这说明层析的离子交换剂可能并不是很优秀，也有可能是装柱不够完美，总体来说，试验完成比较圆满。
6.结论与讨论通过等电点沉淀法我们得到了溶菌酶粗品，通过离子交换层析，我们得到了提纯后的溶菌酶，最后得到溶菌酶的纯度也比较高，只是纯化收率显得较低。
纵观整个实验过程，等电点沉淀法的pH控制非常关键，第一次调到酸性是为了将卵清蛋白及一些酸性析出的杂蛋白清除，第二次调到碱性排除一些碱性析出的蛋白质，并且溶菌酶在碱性条件下更加稳定。
而在
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