PMPA 异构体分析方法验证方案.docx
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PMPA异构体分析方法验证方案
替诺福韦（异构体）分析方法验证方案
分析方法验证方案编号：
INSERIREROBUSTEZZASOSTANZECORRELATE
anchenellanumerazioneindice
起草人
审核人
批准人
2范围………………………………………….………………………………….....2
3标准………………………………………….…………………………….……....2
4职责………………………………………….…………………………………….3
5简述………………………………………….…………..………………….……..3
6培训………………………………………….………………………………….....3
7有关物质分析方法…………………….……………………………………….....3
8.6精密度…….…………………..………………….…………………….….........16
8.6.1重复性…….……………..………………….…………………….…......16
8.6.2中间精密度…….……………..…………….…………………….…......18
1、目的
确保按PMPA对映体测定分析方法检测，能达到测试S-PMPA含量的要求。
2范围
适用于****公司生产的PMPA测试S-PMPA含量。
3、可接受标准（依据中国药典2015版四部通则9101药品质量标准分析方法验证指导原则）
项目
标准
专属性
PMPA和S-PMPA之间的分离度不小于1.5
检测限
信噪比为2:
1～3:
1时，或能明显检测出的浓度不高0.09%。
定量限
信噪比约10:
1时，或能明显检测出的浓度不高于0.15%。
准确度
S-PMPA定量限浓度回收率在80%~120%之间
线性
浓度在定量限到限度的120%内，线性相关系数
≥0.995。
准确度和范围
50%
回收率在90%~108%之间
100%
回收率在90%~108%之间
120%
回收率在90%~108%之间
精密度
重复性
测试6份样品的RSD不得过2.0%。
中间精密度
测试6份样品的RSD不得过2.0%。
2分析员测试12份样品的RSD不得过2.0%。
耐用性
改变流速、柱温、流动相配比和pH等条件，不同规格或不同批次的色谱柱测试PMPA和S-PMPA的分离度和相对保留时间。
溶液稳定性
测试溶液间隔一定时间后，测得S-PMPA的RSD不得过10.0%
4职责
QC负责分析方法验证文件起草和实施。
QA经理负责分析方法验证文件起草和审核，及文件与记录的管理。
QC经理负责分析方法验证文件和记录和数据的审核。
质量总监负责分析方法验证方案和报告的批准。
5简述
6培训
于验证铅对操作人员进行了本分析方法验证的培训。
7对映体测定
7.1仪器：
高效液相色谱仪配备紫外检测器
7.2试剂：
硫酸铜、L-苯基丙氨酸、磷酸二氢铵、三乙胺
7.3测定方法：
照高效液相色谱法（附录ⅤD）测定。
7.4色谱条件：
色谱柱：
InertsilODS-SP（或极性相似）,250×4.6mm,5µm
流动相：
称取0.75g硫酸铜,0.17gL-苯基丙氨酸,2.3g磷酸二氢铵于1000ml纯水中，用三乙胺条件pH为4.0
检测波长：
260nm
流速：
2.0mL/min
进样量：
25μl
柱温：
40℃
7.5供试品溶液：
取样品约40mg，置20ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，制成每1ml中约2mg的溶液。
精密量取供试品溶液各25μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
S-PMPA相对保留时间为0.83。
7.6计算方法：
w=
7.7标准规定：
S-异构体不得大于0.3%
本验证方案所用工作对照品及样品信息
/
来源
批号
含量
替诺福韦酯工作对照品
S-PMPA工作对照品
替诺福韦样品批号
8分析方法验证
8.1专属性
8.1.1溶液配制
S-PMPA储备液：
精密称取S-PMPA工作对照品mg（20mg）于20ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度。
（含S-PMPA约1μg/ml）
R-PMPA储备液：
精密称取R-PMPA工作对照品mg（20mg）于20ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度。
（含R-PMPA约1μg/ml）
混合溶液：
精密移取S-PMPA储备液、R-PMPA储备液各1.0ml于100ml量瓶中，用水稀释至刻度。
（含S-PMPA和R-PMPA各约10μg/ml）
8.1.2操作
依次进样空白（水）、S-PMPA储备液、R-PMPA储备液、混合溶液各1针，记录色谱图，计算混合溶液中S-PMPA和R-PMPA的保留时间、分离度、理论塔板数和拖尾因子。
8.1.3结果如下：
名称
S-PMPA
R-PMPA
保留时间
相对保留时间（以R-PMPA为1）
分离度
理论塔板数
拖尾因子
结论：
检验人：
复核人：
8.2检测限
采用专属性项下的混合溶液稀释至S-PMPA和R-PMPA的主峰信噪比约2~3：
1，
8.2.1溶液配制
8.2.2操作
将调整好的溶液重复测试3次，记录色谱图。
8.2.3结果如下：
名称
浓度（μg/ml）
相当于2mg/ml供试液的百分比
信噪比
1
2
3
平均值
S-PMPA
R-PMPA
结论：
检验人：
复核人：
8.3定量限
采用专属性项下的混合溶液稀释至S-PMPA和R-PMPA的主峰信噪比约2~3：
1，
8.3.1溶液配制
8.3.2操作
将调整好的溶液重复测试6次，记录色谱图。
8.3.3结果如下：
名称
浓度（μg/ml）
相当于2mg/ml供试液的百分比
信噪比
1
2
3
4
5
6
平均值
S-PMPA
R-PMPA
8.3.4定量限准确度验证
8.3.4.1溶液配制
对照液：
精密移取S-PMPA储备液、R-PMPA储备液各0.6ml于100ml量瓶中，用水稀释至刻度。
（含S-PMPA和R-PMPA各约6μg/ml，0.3%）
空白样品溶液：
精密称取替诺福韦样品mg（40mg）于20ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度。
QL溶液：
精密称取替诺福韦40mg，并加入一定量S-PMPA于20ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，使S-PMPA含量为定量限浓度时的含量。
共配制6份。
记录色谱图，计算S-PMPA回收率，回收率范围在80%~120%之间。
8.3.4.2计算公式：
空白量=
发现量=
增加量=发现量-空白量
回收率=
AM：
空白溶液中S-PMPA的峰面积；CM：
空白溶液S-PMPA浓度，mg/ml；
ARS：
对照溶液中S-PMPA峰面积；CRS：
对照溶液S-PMPA浓度，mg/ml；
AX：
测试溶液中S-PMPA的峰面积；m：
替诺福韦称样量，mg；
P：
S-PMPA工作对照品含量，%。
8.3.4.3操作：
依次进样空白（水）1针，空白样品溶液1针，对照液5针，QL溶液各1针。
记录色谱图，计算QL溶液中S-PMPA的回收率。
8.3.4.4结果如下：
S-PMPA和R-PMPA分离度为（不得小于1.5）
/
RS-1
RS-2
RS-3
RS-4
RS-5
平均值
SD
RSD%
替诺福韦
S-PMPA
/
称样（mg）
空白量
（μg）
加入量
（μg）
发现量
（μg）
增加量
（μg）
回收率%
QL-1
QL-2
QL-3
QL-4
QL-5
QL-6
平均值
SD
RSD%
结论：
检验人：
复核人：
8.4线性
8.4.1溶液配制
溶液配制范围，从定量限到标准限度的120%。
L1：
定量限浓度
L2：
精密移取专属性项下的S-PMPA储备液、R-PMPA储备液各0.2ml于100ml量瓶中，用水稀释至刻度。
（含S-PMPA和R-PMPA各约2μg/ml，0.1%）；
L3：
精密移取专属性项下的S-PMPA储备液、R-PMPA储备液各0.4ml于100ml量瓶中，用水稀释至刻度。
（含S-PMPA和R-PMPA各约4μg/ml，0.2%）；
L4：
精密移取专属性项下的S-PMPA储备液、R-PMPA储备液各0.6ml于100ml量瓶中，用水稀释至刻度。
（含S-PMPA和R-PMPA各约6μg/ml，0.3%）
L5：
精密移取专属性项下的S-PMPA储备液、R-PMPA储备液各0.8ml于100ml量瓶中，用水稀释至刻度。
（含S-PMPA和R-PMPA各约8μg/ml，0.4%）
8.4.2操作：
依次进样溶剂（水）1针、L1~L5各2针，记录色谱图，计算替诺福韦和S-PMPA的线性方程。
线性方程中相关系数R2≥0.995，S-PMPA和R-PMPA之间的校正因子
8.4.3结果如下：
S-PMPA
浓度（μg/ml）
面积
平均峰面积
RF值
1
2
L1
L2
L3
L4
L5
平均值
线性方程：
R-PMPA
浓度（μg/ml）
面积
平均峰面积
RF值
1
2
L1
L2
L3
L4
L5
平均值
线性方程：
结论：
检验人：
复核人：
8.5准确度和范围
8.5.1色谱条件同专属性项下。
范围应根据分析方法的具体应用及其线性、准确度、精密度结果和要求确定。
通常情况下是选择50%、100%、150%进行分析，通过对被分析物的百分回收率得出的准确度及其置信区间来评价杂质分析方法的准确性。
回收率在90%~108%之间。
范围的可接受标准为不得小于报告限至限度的120%。
8.5.2溶液配制
对照液：
精密移取专属性项下的S-PMPA储备液和R-PMPA储备液各0.6ml于100ml量瓶中，用水稀释至刻度。
（含S-PMPA和R-PMPA各约6μg/ml，0.3%）
准确度溶液：
精密称取S-PMPA工作对照品mg（15mg）和R-PMPA工作对照品
mg（15mg）于50ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度。
再移取1ml于100ml量瓶中，用水稀释至刻度。
（含S-PMPA和R-PMPA各约3μg/ml）
A1：
精密称取替诺福韦mg（40mg），于20ml量瓶中，加入准确度溶液1.0ml，用水溶解并稀释至刻度。
共配制3份。
记录色谱图，计算S-PMPA回收率。
A2：
精密称取替诺福韦mg（40mg），于20ml量瓶中，加入准确度溶液2.0ml，用水溶解并稀释至刻度。
共配制3份。
记录色谱图，计算S-PMPA回收率。
A3：
精密称取替诺福韦mg（40mg），于20ml量瓶中，加入准确度溶液3.0ml，用水溶解并稀释至刻度。
共配制3份。
记录色谱图，计算S-PMPA回收率。
8.5.3操作：
依次进空白1针、对照液5针，测试液（A1，A2，A3）各1针，记录色图谱。
8.5.4计算公式：
；增加量=检出量-空白量；
；
式中：
Az：
空白溶液中各杂质的峰面积；Cv：
加入样品的浓度（mg/ml）；
m：
测试溶液称样量；CX：
空白样品的浓度（mg/ml）；
V：
加入的体积；P：
各杂质的含量。
8.5.5结果如下
对照液
1
2
3
4
5
平均值
SD
RSD
S-PMPA
R-PMPA
A1结果
S-PMPA
测试液称样量（mg）
峰面积
空白量（μg）
检出量（μg）
增加量（μg）
加入量（μg）
回收率（%）
A1.1
A1.2
A1.3
平均值
SD
RSD
A2结果
S-PMPA
测试液称样量（mg）
峰面积
空白量（μg）
检出量（μg）
增加量（μg）
加入量（μg）
回收率（%）
A2.1
A2.2
A2.3
平均值
SD
RSD
A3结果
S-PMPA
测试液称样量（mg）
峰面积
空白量（μg）
检出量（μg）
增加量（μg）
加入量（μg）
回收率（%）
A3.1
A3.2
A3.3
平均值
SD
RSD
8.5.6结论：
检验人：
复核人：
结合线性范围，得出按本分析方法检测S-PMPA含量的准确范围为：
8.6精密度
8.6.1重复性
色谱条件同专属性项下。
8.6.1.1溶液配制
对照液：
精密移取专属性项下的S-PMPA储备液和R-PMPA储备液各0.6ml于100ml量瓶中，用水稀释至刻度。
（含S-PMPA和R-PMPA各约6μg/ml，0.3%）
供试液：
精密称取替诺福韦mg（40mg），于20ml量瓶中，加入“准确度和范围”项下的准确度溶液2.0ml，用水溶解并稀释至刻度。
共配制6份。
记录色谱图。
8.6.1.2操作：
依次进空白液1针、对照液5针和供试液各1针，记录色谱图。
8.6.1.3结果见下表
对照液
1
2
3
4
5
平均值
SD
RSD
S-PMPA
R-PMPA
测试液结果
项目
称样量
S-PMPA
峰面积
含量
P1
P2
P3
P4
P5
P6
平均值
/
RSD
/
8.6.1.4结论：
检验人：
复核人：
8.6.2中间精密度
8.6.2.1色谱条件
电子天平型号
编号
液相色谱仪型号
编号
检测波长：
260nm
nm
流速：
2ml/min
ml/min
柱温：
40℃
℃
进样量：
25μl
μl
色谱柱：
InertsilODS-SP（或极性相似）,250×4.6mm,5µm
编号
对照液：
精密移取专属性项下的S-PMPA储备液和R-PMPA储备液各0.6ml于100ml量瓶中，用水稀释至刻度。
（含S-PMPA和R-PMPA各约6μg/ml，0.3%）
供试液：
精密称取替诺福韦mg（40mg），于20ml量瓶中，加入“准确度和范围”项下的准确度溶液2.0ml，用水溶解并稀释至刻度。
共配制6份。
记录色谱图。
8.6.2.2操作：
依次进空白液1针、对照液5针和供试液各1针，记录色谱图。
8.6.2.3结果见下表
对照液
1
2
3
4
5
平均值
SD
RSD
S-PMPA
R-PMPA
测试液结果
项目
称样量
S-PMPA
峰面积
含量
P1
P2
P3
P4
P5
P6
平均值
/
RSD
/
8.6.2.4结论：
检验人：
复核人：
8.6.3测试员之间的值
项目
S-PMPA
含量
P1
P2
P3
P4
P5
P6
IP1
IP2
IP3
IP4
IP5
IP6
平均值
RSD
8.6.4结论：
检验人：
复核人：
8.7耐用性
8.7.1改变流速、柱温、流动相pH，不同规格或不同批次的色谱柱测试PMPA和S-PMPA的分离度和相对保留时间。
8.7.1.1溶液配制
取专属性项下的混合溶液。
8.7.1.2改变条件
/
柱温，℃
流速ml/min
流动相pH
色谱柱
正常条件
40
2
4.0
InertsilODS-SP（或极性相似）,250×4.6mm,5µm
条件1
40
1.8
4.0
InertsilODS-SP（或极性相似）,250×4.6mm,5µm
条件2
40
2.2
4.0
InertsilODS-SP（或极性相似）,250×4.6mm,5µm
条件3
35
2
4.0
InertsilODS-SP（或极性相似）,250×4.6mm,5µm
条件4
45
2
4.0
InertsilODS-SP（或极性相似）,250×4.6mm,5µm
条件5
40
2
3.6
InertsilODS-SP（或极性相似）,250×4.6mm,5µm
条件6
40
2
4.4
InertsilODS-SP（或极性相似）,250×4.6mm,5µm
条件7
40
2
4.0
InertsilODS-SP（或极性相似）,250×4.6mm,5µm
8.7.1..3操作
依次进空白和以上条件各1针，记录色谱图，S-PMPA和R-PMPA分离不小于1.5。
8.7.1..4结果如下：
S-PMPA
R-PMPA
正常条件
RT（min）
RRT
分离度
条件1
RT（min）
RRT
分离度
条件2
RT（min）
RRT
分离度
条件3
RT（min）
RRT
分离度
条件4
RT（min）
RRT
分离度
条件5
RT（min）
RRT
分离度
条件6
RT（min）
RRT
分离度
条件7
RT（min）
RRT
分离度
结论：
检验人：
复核人：
8.7.2溶液稳定性
8.7.2.1溶液配制
取精密度项下的供试液
8.7.2.2操作
依次进空白1针、测试液每间隔一定时间进样1针，记录图谱图。
8.7.2.3结果如下：
时间
S-PMPA面积
R-PMPA面积
h
h
h
h
h
h
h
h
h
h
h
h
h
h
h
h
h
h
结论：
检验人：
复核人：
8.8样品测试
按此验证的方法测试三批样品
9结论
项目
标准
结果
专属性
PMPA和S-PMPA之间的分离度不小于1.5
检测限
信噪比为2:
1～3:
1时，或能明显检测出的浓度不高0.09%。
定量限
信噪比约10:
1时，或能明显检测出的浓度不高于0.15%。
准确度
S-PMPA定量限浓度回收率在80%~120%之间
线性
浓度在定量限到限度的120%内，线性相关系数
≥0.995。
准确度和范围
50%
回收率在90%~108%之间
100%
回收率在90%~108%之间
120%
回收率在90%~108%之间
精密度
重复性
测试6份样品的RSD不得过2.0%。
中间精密度
测试6份样品的RSD不得过2.0%。
2分析员测试12份样品的RSD不得过2.0%。
耐用性
改变流速、柱温、流动相配比和pH等条件，不同规格或不同批次的色谱柱测试PMPA和S-PMPA的分离度和相对保留时间。
溶液稳定性
测试溶液间隔一定时间后，测得S-PMPA的RSD不得过10.0%
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