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药物遗传毒性研究技术指导原则

附件四

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指导原则编号：

药物遗传毒性研究技术指导原则

药物遗传毒性研究技术指导原则

一、概述

遗传毒性研究（GenotoxicityStudy）是药物非临床安全性评价的重要内容，它与其他毒理学研究尤其是致癌性研究、生殖毒性研究有着密切的联系，是药物进入临床试验及上市的重要环节。

拟用于人体的药物，应根据受试物拟用适应症和作用特点等因素考虑进行遗传毒性试验。

遗传毒性试验是指用于检测通过不同机制直接或间接诱导遗传学损伤的受试物的体外和体内试验，这些试验能检出DNA损伤及其损伤的固定。

以基因突变、较大范围染色体损伤、重组和染色体数目改变形式出现的DNA损伤的固定，一般被认为是可遗传效应的基础，并且是恶性肿瘤发展过程的环节之一（这种遗传学改变仅在复杂的恶性肿瘤发展变化过程中起了部分作用）。

在检测此类损伤的试验中呈阳性的化合物为潜在致癌剂和/或致突变剂，即可能诱导癌和/或遗传性疾病。

由于在人体中已建立了某些化合物的暴露和致癌性之间的关系，而对于遗传性疾病尚难以证明有类似的关系，故遗传毒性试验主要用于致癌性预测。

但是，因为已经确定生殖细胞突变与人类疾病有关，所以对可能引起可遗传效应的化合物与可能引起癌症的化合物应引起同样的关注；此外，这些试验的结果可能还有助于解释致癌性的机制和试验结果。

因此，在药物开发的过程中，遗传毒性试验的目的是通过一系列试验来预测受试物是否有遗传毒性，在降低临床试验受试者和药品上市后使用人群的用药风险方面发挥重要作用。

本指导原则重点阐述遗传毒性试验体内外试验的基本原则，并介绍标准试验组合方案，以及对试验结果的综合分析及评价。

本指导原则适用于中药、天然药物和化学药物的遗传毒性试验研究。

二、基本原则

（一）实验管理

药物的遗传毒性试验属于安全性评价研究，根据《中华人民共和国药品管理法》的规定，必须执行《药物非临床研究质量管理规范》。

（二）具体问题具体分析

遗传毒性试验的设计，应该在对受试物认知的基础上，遵循“具体问题具体分析”的原则。

应根据受试物的结构特点、理化性质、已有的药理毒理研究信息、适应症和适用人群特点、临床用药方案选择合理的试验方法，设计适宜的试验方案，并综合上述信息对试验结果进行全面的分析评价。

（三）随机、对照、重复

遗传毒性试验应符合毒理学试验的基本原则，即随机、对照和重复的原则。

三、基本内容

（一）受试物

1、中药、天然药物

受试物应能充分代表临床研究受试物或上市药品，因此受试物应采用制备工艺稳定、符合临床研究质量标准规定的样品，一般用中试样品，并注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等。

如不采用中试样品，应有充分的理由。

如果由于给药容量或给药方法限制，可采用原料药进行试验。

试验中所用溶媒和/或辅料应标明批号、规格及生产厂家。

2、化学药物

受试物应采用制备工艺稳定、符合临床研究用质量标准规定的样品，并注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等，并附有研制单位的自检报告。

所用辅料、溶媒等应标明批号、规格和生产厂家，并符合试验要求。

（二）试验设计的总体考虑

对药物而言，需对潜在的遗传毒性进行全面评价，遗传毒性试验可用作鉴定体细胞诱变剂、生殖细胞诱变剂和潜在的致癌物。

目前，遗传毒性试验方法较多，所使用的生物材料多种多样，可以利用原核细胞到真核细胞直至高等哺乳动物细胞在体外进行添加或不添加代谢活化物的试验，也可在整体动物上进行体内试验；根据试验检测的遗传终点可将检测方法分为三大类，即基因突变、染色体畸变、DNA损伤与修复；从试验系统来分，遗传毒性试验可分为体内试验和体外试验。

因体内和体外试验差异较大，以下分别讨论体外试验和体内试验的基本要求。

由于体内外的试验方法均较多，本指导原则仅讨论常用方法及需要重点关注的问题，具体试验时需根据具体情况具体分析。

1、体外试验基本要求

1.1细菌回复突变试验中采用的基本菌株

在细菌回复突变试验中至少应采用5种菌株，包括用于检测组氨酸靶基因中鸟嘌呤-胞嘧啶（G-C）位点碱基置换或移码突变的4种组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌（TA1535；TA1537/TA97/TA97a（注释1）；TA98；TA100），以及用于检测组氨酸或色氨酸基因中腺嘌呤-胸腺嘧啶（A-T）位点碱基置换或移码突变的鼠伤寒沙门氏菌TA102或埃希氏大肠杆菌WP2uvrA或埃希氏大肠杆菌WP2uvrA（pKM101）（注释2）。

由于检测G-C位点突变的4种菌株无法检测交联剂，因此检测交联剂时最好采用TA102菌株或增加一种修复准确型大肠杆菌（如埃希氏大肠杆菌WP2uvrA（pKM101））。

1.2体外试验中最高浓度的确定（注释3）

体外试验中受试物的最高浓度主要取决于受试物对细菌/细胞的毒性和溶解度。

1.2.1无毒化合物的高浓度

对易溶解的无毒化合物，细菌试验应达到的最高浓度为5mg/皿，哺乳动物细胞试验为5mg/ml或10mM（选用较低者）。

1.2.2要求达到的细胞毒性水平

在遗传毒性体外试验中，某些遗传毒性致癌剂只有在检测浓度高达可产生一定程度的细胞毒性时才可检出，但毒性过高又可影响对相应的遗传终点进行恰当的评价。

当哺乳类动物细胞存活率很低时，一些遗传毒性以外的作用机制如细胞毒性（如与细胞凋亡、溶酶体释放核酸内切酶等有关的结果）会导致遗传毒性的假阳性结果，这种情况常发生于受试物浓度达到毒性阈浓度时。

鉴于以上情况，在体外细菌和哺乳类动物细胞试验中，目前可接受以下的细胞毒性水平（浓度不应超过1.2.1中的规定）：

（1）在细菌回复突变试验中，最高浓度应能显示明显的毒性，如回复突变数减少、背景菌斑减少或消失。

（2）哺乳动物细胞体外遗传毒性试验中，毒性水平应高于50%细胞抑制率或细胞融合率，对培养的淋巴细胞，有丝分裂指数抑制率应高于50%。

（3）哺乳动物细胞体外基因突变试验中，理想的最高浓度应能产生至少80%毒性（即存活率不大于20%）。

可通过评价平板接种效率或相对总生长率测定毒性。

对于细胞存活率低于10%时获得的阳性结果，应谨慎对待。

1.2.3难溶受试物的检测

在用细菌和哺乳动物细胞遗传毒性试验检测某些受试物时，在不溶解的浓度范围内也能检测出剂量相关性的遗传毒性（注释4）。

建议采用以下策略检测相对不溶的受试物，该建议仅针对培养基中的受试物。

（1）若未观察到细胞毒性，应以产生沉淀的最低浓度作为最高浓度，但细菌试验不超过5mg/皿，哺乳动物细胞不超过5mg/ml或10mM。

（2）若观察到剂量相关性的细胞毒性或诱变性，则不管溶解度如何，应按上述1.2.2要求的毒性水平来确定最高浓度，这需要检测多个产生沉淀的浓度。

但当沉淀量影响到结果观察时，则无法达到所要求的细胞毒性的剂量水平。

在给药处理开始前和结束时，均应用肉眼评价沉淀量。

1.3体外试验的重现性

体外试验应关注重现性。

体外试验通常应进行重复试验。

但是，当采用标准的、已广泛应用的常规体外试验方法时，若这些试验经过了充分验证且进行了有效的内部质量控制，可不必进行重复试验，例如：

对哺乳动物细胞基因突变试验，进行了规范的范围确定试验，其可提供足够的数据以保证试验方法的正确性；对体外染色体损伤的细胞遗传学试验和小鼠淋巴瘤tk试验，采用了合适的、规范的方法，如包括有阳性和阴性对照、加和不加代谢活化的试验、处理时间及采样时间合适等。

在进行这些试验后，若得到明确的阳性或阴性结果，一般可不需要进行其他确证性试验；但若得到可疑结果，则需要进一步试验。

2、体内试验基本要求

2.1体内试验的给药途径

一般情况下，给药途径应与临床拟用途径一致。

若不一致，应说明理由。

2.2体内检测染色体断裂剂的骨髓试验

啮齿类动物骨髓有核细胞的染色体畸变试验可以检测多种染色体完整性方面的改变，该类变化几乎均来源于原发性的单个或多个染色单体断裂。

如果产生了一个无着丝点片段，染色单体或染色体断裂就导致微核形成，因而检测染色体畸变或微核的方法可用于检测断裂剂（注释5）。

由于细胞分裂后期的一个或多个染色体相对滞后也能形成微核，因而微核检测方法也能检测一些非整倍体诱导剂（注释6）。

总之，体内骨髓细胞染色体畸变试验或骨髓嗜多染红细胞微核试验均可用于检测断裂剂。

此外也可以通过测定小鼠外周血中未成熟（嗜多染）红细胞的微核率来检测断裂剂，除小鼠外，也可采用其他脾脏无法清除带微核的红细胞或对断裂剂或非整倍体诱导剂有足够灵敏度的动物。

2.3骨髓微核试验中啮齿类动物性别的选择

对小鼠微核试验检测已知断裂剂的许多研究表明，通常雄性小鼠比雌性小鼠对诱导微核更敏感，二者之间仅有量的差异而无质的差异，但若性别间存在显著的量的差别则会导致性别间的毒性不同。

若性别间代谢产物有明显的质的差别，则应采用二种性别的动物。

类似的原则同样适用于其他体内试验方法（注释7）。

骨髓微核试验可采用小鼠或大鼠。

总之，在微核试验中，除非性别间在毒性或代谢方面有明显差异，一般单用雄性动物即可。

如果受试物专用于一种性别，则通常选用相应性别的动物进行试验。

（三）标准试验组合

遗传毒性试验方法有多种，但没有任何单一试验方法能检测出所有的遗传毒性物质，因此，通常采用体外和体内遗传毒性试验组合的方法，以减少遗传毒性物质的假阴性结果。

这些试验相互补充，对结果的判断应综合考虑。

1、标准试验组合应具备的特征

标准试验组合应反映不同遗传终点，包括体内和体外试验，从原核到真核细胞，因此应包含以下内容：

（1）应包含细菌回复突变试验，因为该试验已被证明能检出相关的遗传学改变和大部分啮齿类动物遗传毒性致癌剂。

（2）因细菌不能完全检测DNA损伤，应采用哺乳动物细胞进行评价。

目前使用的几种哺乳动物细胞系有：

检测染色体损伤的细胞系（染色体结构和数目畸变的体外试验）；主要检测基因突变的细胞系（注释8）；检测基因突变与染色体断裂作用的细胞系（小鼠淋巴瘤tk试验）（注释9）。

现有研究表明，对于检测具有遗传毒性但在细菌回复突变试验中结果为阴性的化合物，在采用合适的试验方案条件下，检测染色体损伤的各种体外试验与小鼠淋巴瘤tk试验结果高度一致。

因此，在标准试验组合中，上述试验系统可互相替换。

（3）应包含一项遗传损伤体内试验，以提供一个包括影响受试物遗传毒性作用的其他相关因素（吸收、分布、代谢、排泄）的试验模型。

体内试验可另外检出某些遗传毒性物质（注释10）。

可采用啮齿类动物造血细胞染色体损伤体内试验或其他合适的体内试验。

啮齿类动物染色体损伤体内试验包括骨髓细胞染色体畸变试验和骨髓细胞或外周血红细胞微核试验。

2、推荐的标准试验组合

（1）一项体外细菌基因突变试验；

（2）一项采用哺乳动物细胞进行的体外染色体损伤评估试验，或体外小鼠淋巴瘤tk试验；

（3）一项采用啮齿类动物造血细胞进行的体内染色体损伤试验。

对于结果为阴性的受试物，完成上述三项试验组合通常可提示其无遗传毒性。

对于标准试验组合得到阳性结果的受试物，根据其治疗用途，可能需要进行进一步的试验。

建议采用标准试验组合并不意味着其他遗传毒性试验（如DNA加合物检测，DNA链断裂、DNA修复或重组试验）不合适，这些试验可作为标准试验组合以外的供选试验，以进一步验证或补充标准试验组合得到的遗传毒性试验结果。

此外，用分子生物学技术对遗传毒性作用机制进行研究，将有利于危险度评估。

在某些情况下，标准试验组合中的一项或多项试验对受试物不适合时，可采用其他替代试验，但应提供充分的科学依据。

标准试验组合不包括为检测非整倍体而设计的特定试验。

但是，从体外和体内染色体损伤试验中可得到非整倍体损伤的信息，如有丝分裂指数升高、多倍体产生和微核增加；小鼠淋巴瘤tk试验对于非整倍体诱导剂的检测也能提供一些有用的信息。

出现上述情况时可能需要进行进一步的试验。

附录部分简介标准试验组合中常用的几种试验方法，该部分内容只是基本原则，具体试验时需根据具体情况具体分析，设计合适的试验方法。

3、标准试验组合的调整

标准试验组合在一些特殊情况下不适合，需要根据情况进行调整。

（1）在一些情况下，细菌回复突变试验不能提供合适的或足够的信息以评价遗传毒性，如对细菌毒性过大的受试物（如某些抗生素）和可能或已知可干扰哺乳动物细胞复制的受试物（如拓扑异构酶抑制剂、核苷酸同系物或DNA代谢抑制剂）。

在这种情况下，体外试验部分可改用二种不同类型细胞和二种不同终点（基因突变和染色体损伤）的体外哺乳动物细胞试验。

（2）三项标准试验组合一般可检出具有遗传毒性作用的可疑结构的受试物（注释11）。

但是，对此类结构的受试物，在三项试验组合中的结果为阴性时，需要适当增加一些试验，应根据其化学性质、已知反应性和代谢资料来选择附加试验或调整实验方案。

（3）对于某些特殊的受试物，如毒代或药代动力学研究表明不被全身吸收，在标准体内遗传毒性试验中无法到达靶组织（注释12）的受试物，如放射影像剂、抗酸铝合剂和一些皮肤用药，对这些受试物，标准组合的体内试验难以提供有用的附加信息。

若改变给药途径也不能提供足够的靶组织暴露时，可仅根据体外试验进行评价。

（四）与致癌试验相关的附加遗传毒性试验

1、肿瘤产生的相关证据

对于标准遗传毒性组合试验结果为阴性而在致癌试验中出现阳性结果但不能确定具有非遗传毒性作用机制的受试物，建议采用合适模型的附加遗传毒性试验。

为了有助于了解作用机制，附加试验可以改变体外试验的代谢活化条件或者进行肿瘤靶器官的遗传损伤的体内试验（例如：

肝UDS试验，32P-后标记试验，转基因突变测定，肿瘤相关基因遗传改变的分子特征研究）。

2、具有特异结构的化合物

在极个别情况下，具有特异结构的全新化合物可能会被开发为新药。

当不进行该化合物的啮齿类动物长期致癌试验时，应该对其遗传毒性进行深入评估。

四、结果分析与评价

遗传毒性研究是药物安全性评价与药物整体开发进程的一个有机组成部分，其最终目的在于预测受试物潜在的遗传毒性或致癌性。

试验结果的分析和评价是试验的必要组成部分，应对研究结果进行科学和全面的分析和评价。

在对遗传毒性试验结果进行评价时，应结合受试物的药学特点、药效学、药代动力学和其他毒理学研究的结果等信息进行综合分析。

中药、天然药物还应结合处方组成特点、方中药味毒性情况、临床应用背景情况等进行综合分析。

试验结果的评价最终应落实到临床研究受试者范围限定、风险效益评估以及必要防治措施的制定和应用上。

遗传毒性试验组合检测的是主要通过直接的遗传损伤机制的致癌剂（如绝大多数已知的人类致癌剂），该类组合无法检测出非遗传毒性致癌剂。

体外试验的一些实验条件，如有限的体外代谢活化能力，可能导致假阴性结果，但是，任何一种遗传毒性试验中的阳性结果并不一定能说明受试物对人体真正具有遗传毒性或致癌性的危险。

在对体内外试验结果进行评价时，对阳性或阴性的结果均应予以充分考虑，尤其是在有疑义时。

因此，需进行综合分析和评价。

（一）体外试验结果的评价

1、体外试验阳性结果

在评价体外试验阳性结果的生物学意义时，应考虑以下几个问题：

（1）与阴性或溶剂对照数据及背景数据比较，是否有意义？

（2）是否有剂量相关性？

（3）弱或可疑的阳性结果是否可重现？

（4）阳性结果是否由于体外独特的代谢活化途径或体外特殊的活性代谢物所致（注释13）？

（5）结果是否可归因于体内不存在的体外极端培养条件，如极端的pH值、渗透压、细胞悬液中的沉淀物？

（6）哺乳类动物细胞试验中，阳性结果是否仅出现在存活率极低的浓度？

（7）阳性结果是否归因于某种污染物（当某些化合物不存在可疑结构或仅为弱诱变剂或仅在很高浓度时才有诱变性时，可能发生该种情形）？

（8）某种特定遗传终点的试验结果是否与同类化合物中其他化合物的试验结果一致？

（9）有无其他可能的情况。

通过以上考虑，综合分析该阳性结果是否有生物学意义。

2、体外试验阴性结果

在评价体外试验阴性结果时，应慎重考虑以下问题：

（1）受试物的化学结构或已知代谢是否提示采用的标准体外代谢活化技术（如啮齿类动物肝脏S9）可能不合适？

（2）化合物的结构或已知反应性是否提示采用其他检测方法或系统更合适？

（3）有无其他可能的情况。

（二）体内试验结果的评价

与体外试验相比，体内试验方法具有考虑到与人体应用相关的吸收、分布、排泄的优点，而且体内代谢相对于体外试验中的代谢系统更具有相关性，因此，体内试验在遗传毒性试验中具有更重要的意义。

一些已经确证的体内方法可用于评价遗传毒性，其中包括骨髓或外周血细胞遗传学试验。

若某受试物体外试验结果为阴性，一般仅需进行一种体内细胞遗传学试验。

对于在一种或多种体外试验中显示有生物学意义的阳性结果的受试物，在进行一种体内细胞遗传学试验的基础上，采用骨髓或外周血以外的组织进行进一步的体内试验可提供更有用的信息（注释14）。

受试物体内作用的靶细胞以及体外试验的检测终点有助于选择附加的体内试验。

如果体外与体内试验的结果不一致，对其中的差异应采用具体问题具体分析的原则进行考虑和分析。

评价受试物的潜在遗传毒性时，应全面考虑各项试验结果、体内和体外试验方法的内在价值及其局限性。

1、体内试验结果阴性时，确定靶组织暴露水平的原则

体内试验结果的意义与确定受试物在靶组织（注释12）中有足够的暴露直接相关，尤其是当体外试验显示出确定的阳性结果而体内试验结果为阴性时更为重要。

由于靶组织以外的组织中出现了剂量限制性的毒性，因此靶组织中通常很难达到足以诱发生物学反应（如毒性）的浓度。

在这种情况下，毒代动力学资料能提示在靶组织中的暴露情况。

如果由于受试物在靶组织中利用度很低或蛋白结合率高等原因以致无法达到足够的暴露量，此时常规的体内遗传毒性试验的意义较小。

以下建议适用于骨髓细胞遗传学试验，如果用其他靶组织，类似的原则也可采用。

对于任何一种体外试验方法结果呈阳性、而体内试验结果为阴性的受试物，应采用以下任何一种方法反映受试物在体内的暴露水平：

（1）通过测定微核试验中在各剂量组和各采样时间点骨髓中未成熟红细胞数与红细胞总数的比例发生的显著变化，或通过测定染色体畸变试验中有丝分裂指数显著的降低，间接反映受试物的暴露水平。

（2）通过测定血液或血浆中的水平反映受试物相关物质的生物利用度（注释15）。

（3）直接测定骨髓中的受试物相关物质。

（4）通过放射自显影检测组织暴露水平。

对于方法

（2）～（4），应先在最高剂量或其他相关剂量采用与骨髓试验相同的动物种属品系及给药途径进行检测。

若体外试验未显示受试物有潜在遗传毒性，可采用上述任何一种方法，也可用啮齿类动物吸收、分布、代谢和排泄试验结果来确定体内（系统）暴露水平。

2、生殖细胞诱变剂的检测

遗传毒性对生殖细胞的影响也极其重要。

有关生殖细胞诱变剂检测的比较研究结果显示，大多数生殖细胞诱变剂能在体细胞试验中检出，而体内体细胞遗传毒性试验的阴性结果通常可提示受试物对生殖细胞也无影响。

体内体细胞试验结果为阳性时，在综合评价及指导用药时应关注受试物对生殖细胞的影响。

（三）综合分析与评价

当遗传毒性结果为阳性时，对进入临床试验是否安全，应考虑所有的安全性资料，包括对所有遗传毒性资料的全面评价和拟进行的临床试验的性质。

如果这些遗传毒性试验的结果提示无潜在的遗传毒性，则临床研究一般可在健康受试者和拟用临床适应症的病人中进行。

对于遗传毒性试验出现阳性结果、但不直接与DNA发生作用的受试物，不是全都会带来明显的体内给药的风险。

因此，当遗传毒性试验出现阳性结果时，建议提供有关遗传毒性机制的证据以及这种机制与预期体内暴露的相关性，或者通过试验排除药物为非直接与DNA作用的机制，如证明受试物不使DNA烷化或DNA链断裂。

若确认受试物可直接损伤DNA，在极特殊情况下，可能会允许用于危及生命的疾病（如癌症），但不能在健康受试者中使用。

当受试物的标准三项试验组合中的任何一项试验结果为阳性时，建议完成标准试验组合中的第四种试验。

若结果模棱两可，需重复试验以确定结果的可重现性。

若一项或多项试验结果为阳性，需采用证据权衡法（注释16）、进行作用机制研究或附加的支持性试验（注释17）以确认受试物是否会引起遗传毒性。

五、遗传毒性研究进行的时间

通常情况下，对于

（1）新的化学药物；

（2）中药、天然药物中的：

①新的有效成分及其制剂；②新的药材及其制剂；③新的中药材代用品；④药材新的药用部位及其制剂；⑤处方中含有无法定标准的药材，或来源于无法定标准药材的有效部位，以及用于育龄人群并可能对生殖系统产生影响的新药（如避孕药、性激素、治疗性功能障碍药、促精子生成药、保胎药或有细胞毒作用等的新药），在人体试验开始前，应完成标准组合的遗传毒性试验。

若出现可疑或阳性试验结果，应进一步进行其他相关试验。

对于其他需进行遗传毒性研究的中药、天然药物，如长期毒性试验中发现有异常增生、处方中含有高度怀疑的遗传毒性的药味或成分等，应根据具体情况提供相应的遗传毒性研究资料，并根据具体情况来确定所需要进行的遗传毒性试验的内容及进行的时间。

由于中药制剂尤其是中药复方制剂有其特殊性，如含有生药粉的制剂、不溶物较多、成分复杂、溶解度较差、pH值等问题，难以进行体外试验者，可选择进行合适的体内试验，但必须充分说明理由。

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