生物教师新课程实验技能培训讲义.docx
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生物教师新课程实验技能培训讲义
生物教师新课程实验技能
培
训
讲
义
第一章微量可调移液器使用及注意事项
一、仪器特点
微量移液器是一种移取微量液体的新型实验工具，相对其他液体吸取工具（量筒、移液管）具有连续可调，快速，准确，微量等特点。
我们提供的移液器主要有两种不同规格，分别为教师使用移液器和学生使用移液器。
1、教师使用移液器的型号和液体量取范围。
型号
量取范围
HST-MAP-H10
0.5~10uL
HST-MAP-H20
2~20uL
HST-MAP-H100
10~100µl
HST-MAP-H200
20~200µl
HST-MAP-H1000
100~1000µl
HST-MAP-H5000
1000~5000µl
2、学生使用的移液器型号和量取液体范围。
型号
量取范围
HST-MAP-10
0.5~10uL
HST-MAP-200
20~200µl
HST-MAP-1000
100~1000µl
HST-MAP-H5000
1000~5000µl
二、移液器使用步骤
1、选择量程：
根据实际吸取液体的体积，选择合适量程的移液器。
2、掌握正确的握姿：
右手（或左手）握住移液器，拇指放在“取液及刻度调节复合旋钮”或“取液按钮”上，“褪管按钮”朝向身体内侧。
3、容量设定：
容量的设定分为两个步骤，一是粗调，即通过调节按钮将容量值迅速调整至接近自己的预想值；二是细调，当容量值接近自己的预想值以后，应将移液器横置，水平放至自己的眼前，通过调节轮慢慢地将容量值调至预想值，从而避免视觉误差所造成的影响。
注：
教师用移液器调节量程前，需先拔起固定按钮，调好量程后，再将固定按钮按下，固定量程。
4、吸头安装：
正确的安装方法叫旋转安装法，具体的做法是，把移液器顶端插入吸头，在轻轻用力下压的同时，把手中的移液器按逆时针方向旋转180度。
切记用力不能过猛，更不能采取剁吸头的方法来进行安装。
5、吸取液体：
先将移液器排放按钮按至第一档，再将吸头垂直浸入液面，将枪头插入液面下2－3毫米。
平稳松开按钮，切记不能过快。
6、放液：
放液时，吸头紧贴容器壁，先将吸液按钮按至第一档，略作停顿以后，再按至第二挡，这样做可以确保吸头内无残留液体。
7、褪去吸头：
按褪管按扭，褪掉吸头即可。
褪掉的吸头一定不能和新吸头混放，以免产生交叉污染。
8、仪器归位：
使用结束后把移液器调到其最大量程，放置在移液器架子上，以便使得弹簧处于松弛状态保护弹簧。
三、移液器使用注意事项
错误操作
结果
仪器损坏
不加吸头
溶液进入移液器中
密封破坏、仪器被腐蚀
带液平放
溶液进入移液器中
密封破坏、仪器被腐蚀
猛吸
溶液进入移液器中
密封破坏、仪器被腐蚀
一档二档不分
量取液体不准确
猛排
量取液体不准确
太早从溶液中拿出
产生气泡、量取液体不准确
吸头太松
漏气、称取液体不准确、滴液
排液不干净
量取液体不准确
上调节按钮没有定位
量取液体不准确
损坏调节部分
超过调和调节
旋钮卡死
损坏褪管部分
吸头太紧
不宜褪吸头
姿势不对
动作不标准、量取液体不准确
没有选取合适量程
效率不调或准确度不高
第二章大肠杆菌的培养和分离
一、实验原理
大肠杆菌是革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌。
微生物接种的方法有很多，最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。
平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。
稀释涂布平板法则是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落。
二、实验目的
1、掌握用平板划线法分离纯化大肠杆菌的方法；
2、掌握用稀释涂布平板法分离纯化大肠杆菌的方法。
三、仪器与用具
高压灭菌锅，超净工作台，接种环，培养皿，酒精灯，试管，玻璃涂布器，pH试纸，微量可调移液器，恒温培养箱，大肠杆菌，微生物的实验室培养试剂盒。
四、试剂配制
培养基配制：
称取微生物试剂盒中的固体培养基16g加入450mL水中，加热充分溶解（可按培养的微生物最适合生长条件需要调节pH），定容至500mL，121℃高压灭菌20min待用。
五、实验步骤
1、倒平板操作：
⑴将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手打开封口膜。
⑵右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰。
⑶用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约25mL）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。
⑷等待平板冷却凝固，大约需要5～10min。
然后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。
2、平板划线操作：
⑴将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红；⑵在火焰旁冷却接种环，并打开试管冒；⑶将试管口通过火焰；⑷将已冷却的接种环深入菌液中，沾取一环菌液。
⑸将试管口通过火焰，并盖上试管冒。
⑹左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速深入平板内，划三到五条平行线，盖上皿盖。
注意不要划破培养基。
⑺灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。
重复以上操作，在三、四、五区域内划线。
注意不要将最后一区的划线与第一区相连。
3、系列稀释操作：
⑴将分别盛有7.2mL水的5支试管灭菌，并按101～105的顺序编号。
⑵用移液管吸取0.8mL培养的菌液，注入第二支试管中。
吹吸三次，使菌液与水充分混匀。
⑶从101倍稀释的试管中吸取0.5mL稀释液，注入102倍稀释的试管中，重复第2步的操作。
依次类推，直到完成最后一只试管的稀释。
4、涂布平板操作：
⑴用火焰灼烧涂布器灭菌，然后冷却8～10s。
⑵取少量菌液（0.1mL）,滴加到培养基表面。
⑶用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。
六、实验结果与分析
图1大肠杆菌稀释涂布和平板划线分离
如图1所示，大肠杆菌经通过稀释涂布和划线的方法得到分离，最终得到大肠杆菌的菌落。
第三章分离以尿素为氮源的微生物
一、实验原理
一些细菌能够以尿素为氮源，这些细菌含有脲酶，通过降解尿素作为其生长的氮源。
这类细菌可以通过以尿素为氮源的培养基，从土壤中分离出来。
化学式：
CO（NH2）2+H2O脲酶CO2+NH3。
二、实验目的
使用专一培养基（含有尿素）分离专一的细菌（有脲酶的细菌）。
三、仪器与用具
三角瓶，有盖试管，培养皿，超净工作台，微量可调移液器，恒温培养箱，分离以尿素为氮源的微生物试剂盒。
四、试剂配制
尿素固体培养基：
取1瓶尿素固体培养基同时加入酚红溶液2.5ml，加水定容至1.2L，110℃，30min灭菌即可；2.5g尿素溶于50mL无菌水中，并过滤除菌。
待尿素固体培养基温度降至60℃时，将过滤除菌的尿素溶液与其混合均匀，每组分100mL（3个平板量），并立即倒平板。
LB固体培养基：
取1瓶LB固体培养基，加水定容至1250mL，调节pH到7.0~7.2，121℃灭菌20分钟，并立即倒平板。
五、实验步骤
1、制备细菌悬液：
称取1g土壤，在无菌条件下加到装有99mL无菌水的三角瓶中，振荡均匀，即成10-2稀释液，用微量可调移液器吸取10-2稀释液0.5mL，加到装有4.5mL无菌水的试管中，混匀，制成10-3的稀释液，按照此方法依次制备出10-4、10-5、10-6、10-7土壤稀释液，取样时只取悬液。
样品的稀释和稀释液的取样培养流程示意图
2、用涂布法分离细菌：
分别取10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的土壤稀释液0.1mL，同时加到尿素和LB培养基上，用涂布器（玻璃刮刀）涂匀菌液。
3、细菌培养：
将培养皿倒置，于37℃恒温箱中培养24h～48h，观察菌落数。
六、结果与分析
1、结果如下图：
10-2稀释度土样涂布10-3稀释度土样涂布10-4稀释度土样涂布
LB培养基LB培养基LB培养基
10-2稀释度土样涂布10-3稀释度土样涂布10-4稀释度土样涂布
2、分析：
从实验结果可以看出，10-2、10-3、10-4土壤稀释液的涂布效果较好。
其中10-2土壤稀释液最适合计数分析。
土壤溶液的实际含菌量与实际选取的土壤有关，从以上结果分析，推荐使用10-4，10-3，10-2三种稀释度的土壤稀释液进行涂布。
由于尿素培养基中的氮源是尿素，所以在其上面只能培养出以尿素为氮源的微生物。
与LB培养基上的培养结果相对照，可以进一步证明，在尿素培养基上培养的细菌是以尿素为氮源的微生物。
七、实验要点
※尿素必须和培养基的其他成份分开灭菌，且必须使用过滤除菌的方法进行（试剂盒内配有尿素除菌的相关器具）。
※由于培养基内含有葡萄糖，所以培养基灭菌时，采用110℃灭菌30min，防止对葡萄糖成份的破坏。
第四章果汁中的果胶和果胶酶
一、实验原理
果胶是植物细胞壁的主要成分，由半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲脂组成。
山楂的果实中果胶含量最多，煮沸的山楂泥可制成山楂糕。
果胶起着将植物细胞粘合在一起的作用，果胶不溶于乙醇，这是鉴别果胶的一种简易方法。
工业生产果汁时常用95%的酒精沉淀果胶，酒精浓度加到50%～55%即可。
果胶酶是指分解果胶酶物质的多种酶的总称，可分解聚酶（Depolymerase）和果胶酯酶（Pectinesterase或PE）。
果胶酶可提高果汁出汁率，还可促进果汁的澄清，刚压榨出来的果汁粘度大，常会形成果汁分层、浑浊，在过滤时又容易堵塞过滤设备。
添加果胶酶澄清处理后，果汁的粘度迅速下降，使引起果汁浑浊的粒子迅速凝聚下沉，所得的果汁易于过滤和澄清。
二、实验目的
1、确定制作果汁的最佳条件。
2、检测果胶酶的活性。
三、实验材料
匀浆机、小刀、纱布一块、试管、试管架、微量可调移液器、250mL或500mL烧杯1个、水浴锅、记号笔、玻璃棒、95%的乙醇。
四、实验方法及步骤
1.制备苹果匀浆，已配制好。
准备方法：
将苹果洗净、切开，去皮、籽、柄，切成小块。
榨汁，将苹果块放入匀浆机中，在匀浆的同时用力摇晃匀浆机，直到苹果彻底打碎成匀浆状态。
将打出的匀浆用纱布包起来过滤（一层即可），适度挤压，以不挤出渣滓为宜，将过滤出的混浊果汁用烧杯盛起来。
2.取4支试管，用记号笔编号1～4。
用微量可调移液器分别向每支试管中加入4mL苹果汁，然后向1号、2号试管中加入1mL果胶酶溶液，向3号、4号试管中加入1mL蒸馏水，振荡混匀，放入45℃水浴锅中10～20min后可以观察。
到1号、2号试管中的果汁有明显分层，沉淀在下层，3号、4号试管中的果汁基本仍处于混浊状态。
3.将1号、3号试管取出放入沸水浴中1～2min，取出后可以观察到1号试管中的分层更加明显，沉淀体积明显缩小，但有可能被气泡顶到液体上层，3号试管变化不大。
4.另取4支干净试管，编号1～4，分别加入2mL乙醇。
用长胶头滴管伸入呈果汁试管内，吸取澄清液体1mL（3号、4号不分层，直接吸取即可），可以观察到1号、2号试管中的果汁被秲释，3号、4号试管中则出现大团的絮状沉淀。
（注意尽量不要吸到沉淀，加入对应号码的乙醇试管内，乙醇不果汁的加入顺序不分先后）。
五、实验结果与分析
1.实验现象分别如图2所示
图2从左往右分别为第2步，第3步和第4步实验现象。
2.实验结果分析
试管编号
试管内物品
反映后处理
加入酒精前现象
加入酒精后现象
1
4mL苹果汁，1mL果胶酶
加热
分层十分明显，沉淀被浓缩成一小团
果汁被稀释
2
4mL苹果汁，1mL果胶酶
不加热
分层十分明显，沉淀量比1号试管大
果汁被稀释
3
4mL苹果汁，1mL蒸馏水
加热
液体浑浊，比4号试管稍澄清
产生絮状沉淀
4
4mL苹果汁，1mL蒸馏水
不加热
液体浑浊
产生大量絮状沉淀
第五章α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测
一、实验原理
本实验是用吸附法将α-淀粉酶的固定在石英砂上。
一定浓度的淀粉溶液经过固定化酶催化后，可使淀粉水解成糊精。
流出液用淀粉指示液测试，呈红色，表明水解产物糊精生产。
α-淀粉酶β-淀粉酶糖化淀粉酶
淀粉—————→糊精—————→麦芽糖—————→葡萄糖
二、实验目的
1.制备固定化α-淀粉酶
2.迚行淀粉水解的测定
三、实验设备及用品
层析柱、50mL烧杯等、滴管或移液器、注射器架或铁架台、试管
四、实验材料准备和试剂配制
1.α-淀粉酶的固定化
在烧杯中将5mgα-淀粉酶溶亍4mL蒸馏水中（可以用50mL的烧杯，α-淀粉酶溶液已配制好，只需用移液器需4mL即可）。
由于酶不纯，可能有些不容物。
再加入5g石英砂，间歇搅拌，过30min后装入α-淀粉酶的固定化的注射装备。
在倒入前，把小纱布放入这个注射装备的内部的管口中，这个注射装备叫做层析柱（其中包括下端装有气门心并有夹子封住的注射器）。
然后用10倍体积的蒸馏水洗涤此层析柱以除去未吸附的游离淀粉酶，流速为1mL/min。
注意事项：
a.把纱布放在层析柱的内部的管口处。
纱布的目的是防止石英砂落入层析柱的内部的管口中，堵住管口。
在放置纱布时，应先将少量的固定好α-淀粉酶的石英砂放入管内，压住纱布。
以防止在将固定化后的α-淀粉酶倒入管内时，先倒入水，会使纱布秴微上浮；那么这样再倒入的石英砂会穿过纱布堵住管口。
b.转移石英砂至注射管中。
其中在原来的α-淀粉酶固定化的烧杯中会留有一些剩余的石英砂残渣，丢弃不用。
c.控制流速（重要！
！
！
）。
要用10倍体积的蒸馏水洗涤，这个注射器以除去未吸附的游离淀粉酶，流速为1mL/min。
从注射器下面的管子里流出的液体每一滴的体积大约50μL。
流速为1mL/min，就意味着每分钟从注射器的滴灌中流出20滴液体（20=1mL/50μL）。
2.可溶性淀粉溶液
已配制好，只需用移液器或者胶头滴管取用即可。
（老师配制时注意需要用水浴锅加热溶解淀粉！
）
3.5mmol/LKI-I2溶液
试剂盒提供已配制好。
五、实验步骤
1.将灌注了固定化酶的注射器放在注射架上，用滴管滴加淀粉溶液，使淀粉溶液已0.3mL/min的流速过柱。
在流出5mL后接收0.5mL流出液，加入1-2滴KI-I2溶液，观察颜色。
用水稀释1倍后再观察颜色，反映结果如图3所示。
图31、2mL水+1~2滴KI-I2溶液；2、2mL淀粉液+1~2滴KI-I2溶液；3、2mL淀粉滤液+1~2滴KI-I2溶液；4、2mL淀粉滤液+1~2滴KI-I2溶液+稀释1倍。
2.试验后，用10倍体积的蒸馏水洗涤此层析柱，放置在4℃冰箱里，几天后再重复上述实验，看是否有相同结果。
注意事项：
a.控制滴灌流速。
0.3mL/min的流速，我们就可以控制每分钟滴管流出量为每分钟6滴（6=0.3mL/50uL）。
这样做的目的是控制流速让淀粉和淀粉酶充分接触进行反应。
b.显色。
在流出5mL后接取0.5mL过滤液，然后向试管中加入1-2滴KI-I2溶液。
切记，KI-I2溶液不要加入太多，以免碘液颜色覆盖糊精淀粉反应后的颜色。
第六章果酒和果醋的制作
一、实验原理
酿酒和制醋是最古老的生物技术，至今已有五六千年的历史。
与酒和醋的生产有关的微生物分别是酵母菌和醋杆菌。
酵母菌是兼性厌氧微生物，在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，反应式：
C6H12O6+6O26CO2+6H2O
在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵，反应式：
C6H12O62C2H5OH+2CO2
温度是酵母菌生长和发酵的重要条件。
酵母菌繁殖的最适温度是25℃左右。
醋酸杆菌是一种好氧细菌，醋杆菌在有氧条件下才能将乙醇氧化为醋酸，其反应式：
C2H5OH+O2CH3COOH+H2O
醋酸杆菌的最适生长温度为30～35℃。
二、实验目的
利用果酒果醋发酵装置分别进行果酒及果醋的制作，观察实验现象，并探究酵母发酵速率。
三、实验用具
1、果酒果醋发酵装置一套（图4）；
图4果酒果醋发酵装置示意图
四、实验材料
1、葡萄（用葡萄糖溶液代替）；2、果酒及果醋的制作试剂盒。
五、试剂配制
取酵母粉25g，用250mL无菌水溶解。
醋曲溶液：
2g醋曲，加无菌水10mL浸泡片刻，用纱布过滤。
葡萄糖溶液：
取25g葡萄糖，加入500mL水溶解。
六、实验步骤
1.将500g葡萄洗净，用榨汁机将葡萄打成浆状（也可带一次性手套将葡萄挤烂），放入果酒果醋发酵装置中（用500mL葡萄糖溶液代替），加入10mL酵母溶液（5g酵母粉），并混匀。
2.在水封管1内加上3mL自来水，并滴入1滴酚红指示剂，拧好瓶盖。
3.置于室温（20～30℃为宜）发酵至无气泡冒出，每隔一段时间计录气泡冒出的数量（个/min）。
4.发酵结束后，除去瓶中上部的悬浮物，所得即为果酒。
5.用酒精消毒发酵装置，在瓶内装入500mL制出的果酒，加入醋曲溶液10mL，混匀。
6.将附带的较长的硅胶管连接到不锈钢管下端，将硅胶管1从不锈钢管上端摘下，然后将不锈钢管上端与通气泵连接，盖上瓶盖，不要拧紧。
7.打开通气泵，调节通气泵连接管上的控制阀使冒出气体的量为每秒种1～2个气泡，置于室温（30～35℃为宜）通气发酵一周左右后，过滤即可制成果醋。
七．实验结果及分析
1．果酒的制作
（1）实验现象记录
利用葡萄制作果酒时，每一天根据实验现象，取若干个时间点观察实验现象。
时间（h）
实验现象
0（10：
00）
无现象。
0.5（10：
30）
水封管2中液体被气体顶起。
1（11：
00）
水封管1中有气泡冒出，速度为5个/min。
4（14：
00）
水封管1中有气泡冒出，速度为39个/min。
7（17：
00）
水封管1中有气泡冒出，速度为36个/min。
24（10：
00）
水封管1中有气泡冒出，速度为160个/min。
27（13：
00）
水封管1中有气泡冒出，速度为160个/min。
30（16：
00）
水封管1中有气泡冒出，速度为161个/min。
48（10：
00）
水封管1中有气泡冒出，速度为240个/min。
51（13：
00）
水封管1中有气泡冒出，速度为120个/min。
54（16：
00）
水封管1中有气泡冒出，速度为56个/min。
57（19：
00）
水封管1中有气泡冒出，速度为3个/min
72（10：
00）
水封管1中无气泡冒出。
备注：
时间段的选择可根据实际情况调整。
（2）结果分析：
酵母发酵葡萄汁第一天：
1.从0.5h的实验现象可以得出，酵母在该阶段利用装置内的氧气产生相同体积的二氧化碳，当氧气耗完之后，酵母开始进行最初的无氧呼吸，产生的二氧化碳将水封管2中液体压起；2.1h时观察到水封管1有气泡冒出；3.4h，7h水封管1中气泡冒出速度相差不大，可以推出4h，7h酵母发酵速度相差不大。
酵母发酵葡萄汁第二天：
24h，27h，30h水封管1中气泡冒出速度相差不大，明显比第一天气泡冒出速度快，可以推出24h，27h，30h酵母发酵速度相差不大，比第一天速度快。
酵母发酵葡萄汁第三天：
48h水封管1中气泡冒出速度明显比第二天快，51h水封管1中气泡冒出速度明显比48h慢；57h水封管1中气泡冒出速度最慢，可以推出：
48h酵母发酵速度比第二天快，51h酵母发酵速度比48h慢；57h酵母发酵速度速度最慢。
酵母发酵葡萄汁第四天：
72h水封管1中气泡冒出速度为0个/min，可以推出：
72h内发酵结束。
第七章亚硝酸盐含量的测定
一、实验原理
泡菜的制作离不开乳酸菌，乳酸菌是厌氧细菌，在无氧的情况下，将葡萄糖分解成乳酸。
常见的乳酸菌有乳酸链球菌和乳酸杆菌。
在醋酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与N-1-萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰色染料。
将显色反应后的样品与已知浓度的标准液进行目测比较，可以大致估算出泡菜中亚硝酸盐的含量。
二、设备及试剂
泡菜坛、蔬菜、三角瓶、量筒、烧杯、pH试纸、玻璃棒、微量可调移液器、试管、亚硝酸盐含量的测定试剂盒。
三、试剂配制
1、配制硫酸锌溶液：
取18gZnSO4·7H2O固体加水溶解，稀释至150mL。
混匀后备用；
2、配制氢氧化钠溶液：
取20gNaOH固体，加水至250mL，备用；
3、配制N-1-萘基乙二胺盐酸盐溶液：
向含有0.08gN－1－萘基乙二胺盐酸盐固体的离心管中加入1mL60%乙酸充分溶解，然后将以上溶解液加入到79mL60%乙酸中再溶解，混匀后，在冰箱中4℃避光保存，1周内稳定；
4、配制对氨基苯磺酸溶液：
取0.8g对氨基苯磺酸固体溶于56mL蒸馏水和24mL冰乙酸中，棕色瓶室温保存，使用时取上清夜；
5、配制显色液：
将N-1-萘基乙二胺盐酸盐溶液与对氨基苯磺酸溶液（上清液）等体积混合即可（现用现配）；
6、配制亚硝酸钠标准储液：
向含有0.025g亚硝酸钠固体的离心管中加入1mL蒸馏水充分溶解，然后将以上溶解液转秱到100mL烧杯中，向烧杯内加入19mL蒸馏水和10mLNH4Cl缓冲液混合，再秱至50mL容量瓶中，用蒸馏水秲释至刻度，冰箱中避光保存；
7、配制亚硝酸钠标准溶液（测定时用）：
取1mL亚硝酸钠储液，移至100mL容量瓶中，加蒸馏水稀释到刻度，即制得5.0μg/mL亚硝酸钠标准液
四、实验流程
1、泡菜的腌制
（1）各种菜（萝卜、白菜等）洗净并切成3～4cm长的小块。
（2）按照清水与盐的质量比4:
1的比例配制盐水，将盐水煮沸冷却。
（3）将经过预处理的新鲜蔬菜混合均匀，装入泡菜坛内，使盐水没过全部菜料，盖好坛盖。
（4）将坛口用水封好，防止外界空气进入。
（5）泡菜发酵。
2、测定亚硝酸盐的含量
（1）样品处理：
腌制的泡菜5g及少量泡菜汤，用研钵或研磨过滤器研成匀浆，用滤布过滤至100mL烧杯中，用20mL水洗涤研钵或研磨过滤器和滤布，合并滤液，用氢氧化钠溶液将pH调至8.0，再加入5mL硫酸锌溶液。
混匀，如不产生白色沉淀，再加入氢氧化钠溶液至产生白色沉淀为止。
在水浴中加热至60℃，10min后，冷却至室温，用滤纸过滤，用少量水淋洗沉淀2～3次，将滤液和洗涤液在100mL容量瓶中定容。
（2）样品测定：
取2mL样品溶液，置于有刻线试管中，加入900μLNH4Cl缓冲液，500μL60%乙酸和1mL显色液，加水定容至5mL，混合混匀，暗处静止25min；用光程1cm的比色杯在550nm处测定光密度值，以2mL水为空白对照。
（3）标准曲线：
吸取0，100，200，600，1000μL的亚硝酸钠标准溶液，分别置于有刻线试管中，各加入900μLNH4Cl缓冲液，500μL60%乙酸和1mL显色液，加水定容至5mL，混合混匀，暗处静止25min；用光程1cm的比色杯在550nm处分别测定光密度值。
以亚硝酸钠质量为横坐标，以光密度值（OD值）为纵坐标，绘标准曲线。
12.计算：
X1=（m2×1000×V1）/（m1×V2×1000）
式中：
X1为样品中亚硝酸盐含量，单位mg/Kg；m1为样品质量，单位g；m2为通过标准曲线得到的亚硝酸盐的质量，单位μg；V1为样品处理液总体积；V2为测定用样品液体积
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