体外构建气管黏膜上皮组织的研究.docx

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体外构建气管黏膜上皮组织的研究

体外构建气管黏膜上皮组织的研究

【摘要】目的:

应用组织工程原理和方法在体外构建气管黏膜上皮组织.方法:

将原代兔气管上皮细胞种植在铺有鼠尾胶原的小肠黏膜下层上培养，在体外构建气管黏膜上皮组织，培养1wk后行HE染色，对气管上皮细胞行免疫细胞学鉴定.结果:

原代气管上皮细胞培养1wk后增殖旺盛，10d时上皮细胞分布范围更广.将构建的气管黏膜上皮组织行HE染色，显示有气管黏膜上皮和SIS双层结构.抗角蛋白单克隆抗体免疫细胞化学反应阳性显色率可达90%左右.结论:

将铺有鼠尾胶原的SIS复合气管上皮细胞生长，成功的在体外构建出组织工程化的气管黏膜上皮组织.

【关键词】支气管/细胞学；上皮细胞；小肠黏膜下层；组织培养；组织工程

0引言

目前，在因外伤、肿瘤或其他病变导致气管大范围受损、需要切除较长段气管的情况下，尚缺乏有效的方法来修复缺损气管.利用同种异体移植、自体组织移植以及人工材料替代物等方法，效果均不理想［1］.近年来，气管组织工程技术为这一问题的解决打开了新的视角.其中，有活性的气管黏膜上皮的重构仍是气管移植的关键.本研究在原代培养兔气管上皮细胞的基础上，将铺有鼠尾胶原的小肠黏膜下层作为支架，复合原代气管上皮细胞生长，试图在体外构建出组织工程化的气管黏膜上皮组织.

1材料和方法

材料健康成年大耳白兔20只，体质量kg，雌雄不限，购于第四军医大学实验动物中心.无血清生长因子培养基（以下简称无血清培养基）成分为：

1∶1DMEM/F12培养液，并加入以下激素及生长因子：

10μg/mL胰岛素（INS），5μg/mL转铁蛋白（TF），25ng/mL表皮生长因子（EGF），20ng/mL甲状腺素（T3），　μg/mL氢化可的松（HC），1mmol/LL谷氨酰胺，100U/mL青霉素，100U/mL链霉素.其中DMEM/F12培养基为Gibco产品；胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子、甲状腺素以及第一抗体鼠抗兔角蛋白单克隆抗体均为Sigma公司产品；余为国产分析纯.二氨基联苯胺DAB免疫组化试剂盒由华美公司提供.鼠尾胶原浓度为g/L，由本校生物医学工程系提供.

方法

消毒法制备SIS将兔以20g/L戊巴比妥钠全麻致死，无菌切取近端空肠，沿管腔的垂直面截取约10cm长度数段，清水冲洗干净之后浸于生理盐水中.翻转小肠，用裹着纱布的手术刀柄沿管腔纵向刮除黏膜层，直至黏膜下层.再次翻转小肠，用同样的方法刮除浆膜层和肌层，即得SIS.用生理盐水洗净小肠黏膜下层，仔细去除黏膜下层的残余组织.沿纵轴切开，切成1cm长的小段，在含青霉素、链霉素的生理盐水中浸泡30min3次，再浸入2mL/L过氧乙酸消毒30min，无菌生理盐水漂洗3次，储存于无菌PBS液中4℃冰箱保存.取部分SIS行HE染色观察其结构.

原代气管黏膜上皮细胞的培养将兔以20g/L戊巴比妥钠全麻致死，无菌操作取出颈段气管，用含有青霉素、链霉素的PBS溶液冲洗气管，机械法小心剥离气管黏膜，将黏膜剪切成1mm2大小组织块；以眼科镊送入小号培养瓶内，用弯头吸管将组织块在瓶壁上均匀摆置，再将培养瓶翻转，让瓶底朝上，向瓶内注入适量上述无血清培养基，将培养瓶倾斜放置在37℃细胞培养箱中，2~4h待组织小块贴附后，将培养瓶翻转平放，静置培养.以后每2d更换1次培养液，2d后小心将组织块倾倒出，继续培养细胞，10d后，细胞基本长满瓶壁后，以g/L胰酶进行消化，形成细胞悬液备用.

气管上皮细胞的鉴定以SP法对标本进行染色，主要实验步骤①将培养10d的气管上皮细胞常规进行细胞爬片，40g/L多聚甲醛溶液固定30min；②加30mL/L过氧化氢室温孵育10min，PBS浸泡3次，每次5min；③滴加100mL/L正常山羊血清37℃孵育10min后去除多余液体；④加第一抗体，4℃过夜，PBS漂洗3次，每次5min；⑤滴加生物素标记第二抗体，37℃孵育30min，PBS冲洗3次，每次5min；⑥滴加SA/HRP，37℃孵育30min，PBS冲洗3次，每次5min；⑦DAB显色，蒸馏水冲洗，苏木精复染，封片.空白对照采用PBS代替一抗.二氨基联苯胺DAB显色阳性为气管上皮细胞.

复合气管黏膜上皮组织的构建在六孔培养板中放入铺有鼠尾胶原的SIS小段，将上述细胞悬液滴在其上.先不加培养液，在细胞培养箱中过夜后，再加入无血清培养基培养，以后每2d更换一次培养液.继续培养1wk.同时设对照组，将细胞悬液滴加到仅铺有鼠尾胶原的盖玻片上，以观察细胞生长情况.

石蜡切片HE染色将继续培养1wk的复合气管黏膜上皮组织以100g/L甲醛固定24h，石蜡切片，常规HE染色，在光学显微镜下观察其结构.

　　2结果

气管上皮细胞培养过程倒置相差显微镜观察原代气管上皮细胞生长情况，培养24h内可见组织块边缘有少量成纤维样细胞爬出，呈放射状分布，随后可见一些纤毛细胞爬出，纤毛自细胞顶面伸出，摆动活跃.此后组织块周围上皮样细胞数目逐渐增多，数天后上皮样细胞覆盖的面积逐渐增大，近组织块区域上皮细胞密集，远离组织块区域上皮细胞少见.2d后小心倾倒出组织块，继续观察，可见1wk时细胞增殖旺盛，小片状细胞群逐渐融合成片，部分上皮细胞汇合成多角形铺路石样生长.10d时，上皮细胞分布范围更广，但纤毛细胞数量无明显增加.此时细胞基本长满瓶壁.消化后形成细胞悬液，因复合气管黏膜上皮组织铺有SIS组织，透光度减弱，不便观察细胞生长情况.而对照组仅铺有一层鼠尾胶原，透光性良好.故以对照组的细胞生长情况来评估实验组的细胞生长情况.对照组继续培养1wk时，可见细胞生长良好，并逐渐汇合成铺路石样生长，但纤毛细胞结构逐渐退化或消失.

复合气管黏膜上皮组织HE染色可见气管黏膜上皮和SIS双层结构，气管黏膜上皮为一薄层组织，SIS层较厚，呈较均匀的结缔组织基质.胶原层显示不明显.我们自制的SIS呈较均匀的结缔组织基质结构，有少许细胞碎片残留.

气管上皮细胞免疫细胞化学鉴定抗角蛋白免疫细胞化学反应显示，二氨基联苯胺DAB阳性显色的细胞可达90％左右.

3讨论

组织工程技术运用工程学和生命科学的原理和A：

复合气管黏膜上皮组织（:

气管黏膜组织块,↑:

气管纤毛上皮细胞）；B：

SIS.方法，发展生物替代品以修复、维持或改善组织功能［2］.目前，组织工程学在组织或器官修复替代的研究很广泛，如组织工程化软骨［3］、膀胱［4］、皮肤［5］等人体组织器官方面，都取得了一定的成绩.然而，气管的呼吸功能重建方面仍进展缓慢.重建呼吸道功能的基础是建立有呼吸道黏膜的气管软骨支架.目前，软骨支架的构建已在裸鼠体内获得成功［6］.但复合气管黏膜上皮的构建仍在不断探索之中.

气管上皮细胞是构建气管黏膜上皮的关键.目前，气管上皮细胞的培养方法致力于研究提高细胞的增殖能力，延长存活时间，促进其分化成熟，使其结构和功能更接近于生理状况.有学者利用呼吸道上皮分离细胞进行培养［7］以及利用干细胞定向诱导分化产生气道上皮［8］，这些方法缺点是难以获得大量上皮细胞，且消化后细胞的功能和活性受到一定程度的影响.干细胞定向调控成本高，分化不确定，难以获得实用性的上皮细胞.本实验利用组织块法原代培养气管上皮细胞，对细胞损伤小，且操作简单、快捷；纤毛上皮细胞自组织块直接爬出，更好的保留了原有的生物学特性，其生长分布范围随培养时间延长而扩大.为推迟纤毛结构退化过程的发生，我们使用无血清培养基而不用含血清的培养基进行培养，因为无血清培养基中加入了表皮生长因子、激素等成分，替代了加速细胞老化的小牛血清，能使细胞的形态特征和生理功能更接近于正常机体细胞.

本实验应用鼠尾胶原作为细胞支架，其主要成分是Ⅰ型胶原蛋白，有利于气管上皮细胞的贴壁、展开和分化，同时可以维持上皮细胞的形态、促进纤毛的生成［9］.且将鼠尾胶原均匀涂在SIS上面，可以形成一平坦的表面，有利于细胞黏附，并且SIS可以构成更类似于正常气管黏膜层的黏膜下结缔组织层.Sanderson等［10］认为鼠尾胶原能促进细胞的贴附、生长，并有良好的光学属性，有利于光学显微镜的观察.故我们将对照组仅铺一层鼠尾胶原，以便观察细胞的生长情况.

【参考文献】

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