细胞与遗传学基础试验指导.docx

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细胞与遗传学基础试验指导

绪言

一、实验课目的

本学科是一门实验性很强的学科，其实验课教学是整个教学的重要组成部分。

目的有如下几方面：

（一）验证理论。

通过对理论课所学理论的验证，进一步加深对教学内容的理解、巩固和提高。

（二）通过基本技能的训练以及对实验结果的观察分析，使学生了解并掌握细胞生物学有关的实验技术方法，进而培养学生动手实践、观察分析和解决问题的能力。

（三）培养学生实事求是的科学态度和科学的思维方法，为其后续课的实验及今后的医学研究打下基础。

二、实验课要求

（一）学生在实验前应认真预习实验指导及教材中与实验有关的章节，对实验课的原理、内容及方法有初步的了解。

（二）在实验中要认真操作、仔细观察、分析并及时做好记录。

（三）要注重动手能力的培养。

（四）在实验中要注重基本技能的训练及实验仪器、器械的使用方法。

对基本的实验技能要反复训练直至基本掌握。

（五）实验结束后，要根据实验过程中的记录和实验指导的要求，实事求是、认真的写好实验报告，不得抄书或借阅他人的报告参考。

三、实验室规则

（一）遵守实验纪律，不迟到、不早退或无故缺席。

（二）进入实验室要穿好白大衣。

（三）进实验室后要按学号对号入座，不能随意更换座位。

要保持肃静。

（四）要严肃认真地进行实验。

实验期间不得进行任何与实验无关的活动。

（五）实验中各种用品使用后应放回原处。

示教标本应按顺序观察，不能任意移动标本，以免妨碍他人观察。

（六）要爱护仪器、标本和器械，如有损坏，应及时报告老师，以便修理或更换。

损坏仪器、器械和标本者应按规定进行赔偿。

（七）要注意节约实验材料、药品和水、电等资源。

（八）保持实验室内清洁整齐。

实验废物及纸屑应放到指定地点，不得随意乱丢。

实验结束后要认真清理各自的实验台面，将器械清洗后点清数目并摆放整齐。

值日生负责清扫实验室，清扫结束后要关好水、电、门窗等，经教师允许方可离开实验室。

附：

实验课绘图要求学生每人准备一支HB铅笔、直尺和橡皮。

四、实验教学的内容

实验顺序

实验内容

实验一

普通光学显微镜的结构和使用

实验二

动物细胞的基本形态观察和显微测量

实验三

细胞组分的化学反应

实验四

线粒体的活体染色

实验五

液泡系的活体染色

实验六

细胞膜通透性的观察

实验七

细胞计数

实验八

细胞超微结构电镜照片的识别

实验九

细胞分裂

实验十

细胞的原代和传代培养

实验十一

细胞融合

第一次实验：

普通光学显微镜的结构和使用

动物细胞的基本形态观察和显微测量

第二次实验：

细胞组分的化学反应

线粒体的活体染色

液泡系的活体染色

第三次实验：

细胞膜通透性的观察

细胞计数

第四次实验：

细胞超微结构电镜照片的识别

细胞分裂

细胞的原代和传代培养录像

常用实验动物的了解和解剖器械的使用

一、常用实验动物

常用的实验动物有蟾蜍、小白鼠、大白鼠、豚鼠、猫、兔和狗等。

在医学实验中，常常根据不同的实验目的而选用不同的动物进行实验研究。

例如，蟾蜍可以用于观察离体心脏搏动情况的实验，小白鼠常用于样本很大的实验（如药物的半数致死量的测定等），猫常用于测定脑内电位的实验，而狗是局解手术中常用的实验动物。

在我们细胞生物学实验中，除应用培养细胞外，最常用的动物是蟾蜍和小白鼠，下面对其特点及基本处置做一简单的介绍。

蟾蜍

蟾蜍是两栖类动物，由于其取材方便，常用于各种实验。

其细胞较哺乳类动物的细胞大得多，因此常用于观察细胞形态的实验。

1．雌雄鉴别

通常雄性蟾蜍较雌性的为小，且在其前肢的l～3趾基部有被称为婚垫的黑疣。

2．捉拿及处死方法：

常用捣髓法处死蟾蜍，即用解剖针捣毁其脑组织和脊髓。

具体方法是，左手握住蟾蜍的身体和四肢，使其腹部贴着掌心，食指压住蟾蜍头部前端使其尽量腹屈。

在头与躯干之间可触及一凹陷（即枕骨大孔所在处），右手持解剖针直插入此凹陷约l～2mm，随即将针尖转向头侧插入颅腔捣毁脑组织。

然后将解剖针抽回并转向尾侧刺入脊椎管内捣毁其脊髓。

如此直至其四肢松软，呼吸消失为止。

小白鼠

小白鼠是哺乳动物，是最为常用的实验动物。

1．捉拿方法：

将小白鼠放在鼠笼盖铁网上，用右手持其尾巴向后拉，小鼠则会尽力向前蹬。

用左手的拇指和食指抓住其头顶部皮肤，然后用左手小指与手掌之间夹住其尾巴。

2．处死方法：

处死应以安乐死为原则，即使之无痛苦而迅速死亡。

常用的方法有颈椎脱位法，断头法和二氧化碳吸入法等。

断头法需用特殊的断头器，二氧化碳吸入法则将小鼠放入盛有二氧化碳的容器内即可。

颈椎脱位法的具体方法是：

左手拇指和食指按住小白鼠的头部，左手捉住其尾巴迅速向后猛拉，使其颈椎脱位而立即死亡。

3．给药方法：

小自鼠的给药途径有经口给药、腹腔内注射、尾静脉注射、皮下注射、皮内注射和肌肉注射等。

我们常用的是腹腔注射。

具体方法是：

左手捉住小鼠（如前所述），在其腹正中线稍外侧（避开膀胱和血管）用酒精消毒后，首先将注射针头向头部方向刺入皮下，进针1～2mm后，再以45°角刺穿腹部肌肉而进入腹腔（刺穿腹肌时有一落空感）。

针头刺入腹腔后切勿左右摆动，以免损伤肠管或肝脏。

注意每次注入的液体量应为0.1～0.2ml／10克体重。

二、常用手术器械及操作方法：

1．解剖针：

用于挑、刺等。

常用来捣髓处死蟾蜍，持法如执笔法。

2．解剖刀（即外科手术刀）：

用于各种皮肤切口和组织切除等。

持法有执弓法与执笔法两种。

前者用于较大力量切开较长距离的坚韧的组织，如大动物的皮肤切口等；后者则用于小力量的短距离切开，或分离皮肤和肌肉等。

3．大剪刀：

用于剪毛、皮肤、皮下组织和肌肉等。

持法如图。

4．眼科剪刀：

用于剪断神经、血管、筋膜等细软组织。

5．眼科镊子：

用于提取神经、血管和筋膜等细软组织。

6．钝头镊子：

用于提取脏器、组织等。

7．有钩镊子：

用于提取皮肤切口等。

常用手术器械

执刀方法

执镊姿势

执剪姿势

实验一普通光学显微镜的结构和使用

实验目的：

1．熟悉普通光学显微镜的主要构造及其性能。

2．掌握低倍镜及高倍镜的使用方法。

3．初步掌握油镜的使用方法。

实验用品：

1．普通光学显微镜、二甲苯、香柏油、擦镜纸。

2．羊毛装片、蛙血涂片、神经细胞标本。

实验内容：

一、光学显微镜的类型

光学显微镜，简称显微镜或光镜，是利用光线照明使微小物体形成放大影像的仪器。

400多年来，经不断改进，显微镜的结构和性能逐步完善，形成了品种繁多、型号各异的光学显微镜系列（图1—1）。

除了广泛使用的普通光镜外，还有相差显微镜、暗视野显微镜、荧光显微镜和倒置显微镜等具有特殊功能或用途的光镜。

形形色色的光学显微镜虽然外形和结构差异较大，但其基本构造和工作原理是相似的。

二、光学显微镜的结构

1．机械系统

（1）镜筒是安装在光镜最上方或镜臂前方的圆筒状结构或方形结构，其上端装有目镜，下端与物镜转换器相连（图1—2）。

（2）物镜转换器又称旋转盘，是安装在镜筒下方的一圆盘状结构，可以按顺时针或逆时针方向旋转，其上均匀分布有3～4个圆孔，用以装载不同放大倍数的物镜。

转动旋转盘可使不同的物镜到达工作位置（即与光路合轴），此时能听到“咔”的一声。

（3）镜臂是支持镜筒和镜台的弯曲状结构，是取用显微镜时握持的部位。

图1-2普通光学显微镜的结构示意图

（4）调焦器也称调焦螺旋，是调节焦距的装置，位于镜柱的下端，左右对称各一套。

分粗调螺旋（大螺旋）和细调螺旋（小螺旋）两种。

粗调螺旋可使载物台以较快速度或较大幅度升降，能迅速调节好焦距，使物像呈现在视野中，适于低倍镜观察时的调焦。

细调螺旋只能使载物台缓慢或较小幅度地升降，升或降的幅度不易被肉眼观察到，适用于高倍镜和油镜焦距的精细调节；也常用于观察标本的不同层次，一般在粗调螺旋调焦的基础上使用。

有些类型的光镜，在左侧粗调螺旋的内侧有一窄环，称为粗调松紧调节轮，其功能是调节粗调螺旋的松紧度。

另外，在右侧粗调螺旋的内侧有一粗调限位凸柄，当用粗调螺旋调准焦距后向上推紧该柄，可使粗调螺旋限位，此时镜台不能继续上升，但细调螺旋仍可调节。

（5）载物台也称镜台，是位于物镜转换器下方的方形平台，用于放置被观察的玻片标本。

载物台的中央有圆形的通光孔，来自下方的光线经此孔照射到标本上。

在载物台上装有标本移动器，也称推进器或推进尺，其上安装的弹簧夹用于固定玻片标本，载物台的左下方的两个螺旋可以移动推进器，可使玻片标本在水平面上前后左右移动，用来寻找目标。

（6）镜柱是连接镜臂与镜座的短柱，其上有调焦器。

（7）镜座位于最底部，是整台显微镜的基座，用于支持和稳定镜体。

在镜座内装有照明光源。

2．光学系统

光学系统包括目镜和物镜。

（1）目镜又称接目镜，安装在镜筒的上端，起着将物镜所放大的物像进一步放大的作用。

每个目镜一般由两个透镜组成，在上下两个透镜（即接目透镜和会聚透镜）之间安装有能决定视野大小的金属光阑——视场光阑，此光阑的位置即是物镜所放大实像的位置。

因此，可将一小段细金属丝或头发粘附在光阑上作为指针，用以指示视野中的某一部分供他人观察。

另外，还可在光阑的面上安装目镜测微尺。

每台显微镜通常配置2～3个不同放大倍数的目镜，如“5×”、“10×”和“15×”（数字表示放大倍数）目镜，可根据不同需要选择使用，最常使用的是“10×”目镜。

（2）物镜也称接物镜，安装在物镜转换器上。

每台光镜一般有3～4个不同放大倍数的物镜，每个物镜由数片凸透镜组合而成，是显微镜最主要的光学部件，决定着光镜分辨力的高低。

常用物镜的放大倍数有“10×”、“40×”和“100×”等几种。

一般将“10×”物镜称为低倍镜（而将“5×”及以下的叫做放大镜），将“40×”或“45×”物镜称为高倍镜，将“100×”物镜称为油镜（这种镜头在使用时其顶端需浸在香柏油中）。

在每个物镜的侧壁通常都标有能反映其主要性能的参数（图1—3），主要有放大倍数和数值孔径（如10/0.25、40/0.65、100/1.25）、该物镜所要求的镜筒长度和标本上的盖玻片厚度（160/0.17，单位为mm）；另外，在油镜上还常标有“油”或“oil”字样。

玻片上表面

物镜头与玻片标本之间的介质一般为空气。

由于玻璃与空气的折光率不同，光线通过载玻片和空气进入物镜，部分光线产生折射而损失掉，导致进入物镜的光线减少，分辨率降低。

而油镜用香柏油或石蜡油作为介质，香柏油或石蜡油折射率与玻璃近似（玻璃、香柏油和石蜡油的折射率分别为1.52、1.51和1.46，空气为1），可减少光线的折射，增加视野亮度，提高分辨率。

物镜分辨率还和数值孔径有关，其数值越大，分辨率越高。

不同物镜有不同的工作距离，所谓工作距离是指显微镜处于工作状态（焦距调好、物像清晰）时，物镜最下端与玻片上表面之间的距离（图1—3）。

物镜的放大倍数与其工作距离成反比。

当低倍镜被调节到工作距离后，可直接转换高倍镜，只需旋动细调螺旋，便可见到清晰的物像，这种情况称为同高调焦。

不同放大倍数的物镜可从长短上加以区分，一般来说，低倍镜最短，油镜最长，而高倍镜的长度介于两者之间。

显微镜的放大倍数是目镜的放大倍数和物镜的放大倍数的乘积。

3．照明系统

（1）聚光器位于载物台通光孔的下方，由2～3个透镜组合而成，其主要功能是将光线集中到所要观察的标本上，增加视野的亮度。

在聚光器的左下方，有一调节螺旋，可使其上升或下降，从而调节光线的强弱。

升高聚光器可使聚光作用增强，反之则聚光作用减弱。

（2）光圈也称彩虹光阑或孔径光阑，位于聚光器的下端，是能够控制进入聚光镜光束大小的可变圆环结构。

它由十几张金属薄片组合排列而成，