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细胞与分子遗传学

细胞和分子遗传学

第一章绪论

1.遗传：

生物信息从上代往下代传递

2.遗传学：

研究遗传规律的科学

3.基因组Genome:

一整套染色体上的所有遗传物质

4.基因组学Genomics:

研究基因组的科学，包括研究分析核酸序列、基因成分、基因结构和基因数目.

5.细胞遗传学:

从细胞学和遗传学发展起来的交叉学科，它涉及染色体的形态、结构、数目、功能和运动等特征，以及这些特征的各种变异对遗传传递、重组、表达与调控的作用和影响，也涉及染色体外的遗传因子。

以染色体遗传为研究核心。

6.FISH（fluorescentinsituhybridization）:

荧光原位杂交

7.原位杂交：

是一项利用标记的DNA或RNA探针直接在染色体、细胞或组织水平定位特定靶核酸序列的分子细胞遗传学技术。

8.FISH工作原理：

用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。

由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。

与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可以多重染色等特点。

9.FISH的应用：

⑴位点特异性探针：

能与染色体的特定部位杂交；已经分离出一段基因的一小部分，若要确定这段基因位于哪个染色体，就准备这段基因的探针并观察该探针与哪个染色体杂交。

⑵整个染色体探针：

能分别与染色体纵轴的不同序列杂交的很短的探针的集合。

用这些探针库能画出全部染色体并产生核型谱带，再进行核型分析，用于检测染色体异常

10.原位杂交的种类：

⑴GISH（Genomicinsituhybirdization）——以基因组为探针（整个染色体）。

⑵FISH（Fragmentinsituhybridization）——以特定的基因为探针（基因片段）。

⑶mFISH（multicolorFISH）——利用不同颜色的荧光素标记不同的探针。

⑷Fiber-FISH——利用化学方法对染色体进行线性化，再以此线性化的染色体DNA纤维为载体进行FISH（提高分辨率）。

第二章基因组作图与基因定位

1.结构基因组的研究策略：

测序路线——作图（遗传图和物理图）、测序（图谱测序和随机测序）、组装（骨架图和空隙图）。

2.为何要绘制遗传图与物理图？

1）基因组太大,必需分散测序,然后将分散的顺序按原来位置组装,需要图谱进行指导.2）每次仅能读取1000bp，已知最小的细菌为580kb.3）基因组存在大量重复顺序,会干扰排序,因此要高密度基因组图.4）遗传图和物理图各有优缺点,必须相互整合校正.

3.遗传图与物理图：

⑴遗传作图（Geneticmapping）采用遗传学分析方法将基因或其它DNA顺序标定在染色体上构建连锁图。

包括杂交实验，家系分析。

遗传图距单位为厘摩（cM）,每单位厘摩定义为1%交换率。

⑵物理作图（Physicalmapping）采用分子生物学技术直接将DNA分子标记、基因或克隆标定在基因组实际位置。

物理图的距离依作图方法而异，如辐射杂种（radiationhybrid）作图的计算单位为厘镭（cR）,限制性片段作图与克隆作图的图距为DNA的分子长度，即碱基对（bp,kb）。

4.基因组测序的策略：

Clone-by-clone测序（基因克隆）、鸟枪法测序（全基因组）、混合法测序。

基本流程：

随机酶切成小片段（不完全酶切）——亚克隆（酶切片段+载体）——亚克隆测序（两端测序）——组装。

关键：

酶选择，片段大小，数量（库大小）。

5.基因组路标（landmarker）：

染色体上的基因和DNA顺序均可作为路标,路标具有物理属性,他们由特定的DNA顺序组成.路标位于染色体上的位置是固定的,不会更改的,因而提供了作图的依据。

6.RFLP（restrictionfragmentlengthpolymorphism，限制性片段长度多态性）：

指基因型之间限制性片段长度的差异（同种酶），这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。

7.RFLP的特点：

⑴处于染色体上的位置相对固定;⑵同一亲本及其子代相同位点上的多态性片段特征不变;⑶同一凝胶电泳可显示不同多态性片段,表现为共显性（双亲的性状同时在F1个体上表现出来）——一个酶切位点突变，则两条同源染色体跑出的胶共有3段，下面两段相加等于上面那段.

8.如何寻找RFLP标记（即酶切位点）:

⑴随机克隆筛选;⑵将其它方法获得的DNA标记,如RAPD（randomamplifiedpolymorphismDNA）标记转换为RFLP标记;⑶从cDNA中寻找RFLP.⑷计算机筛选.

9.AFLP（amplifiedfragmentlengthpolymorphism,放大的片段长度多态性）：

⑴这是一种筛选RFLP分子标记的方法.先将DNA样品采用选定的限制性内切酶（如EcoRI,Sau3A）消化,然后加上接头PCR引物（补平粘性末端并额外延伸1-3个碱基）.⑵接头PCR引物设计:

根据限制酶接头添加数个向外延伸的碱基（补平末端）,然后向3’方向延伸1-3个不同的碱基（共有41-43种不同的引物）.⑶选择不同的引物对扩放样品DNA（PCR）,经聚丙烯胺凝胶电泳分离标记的（就是用那多出的1-3个碱基作为标记）PCR产物.

10.SSLP（simplesequencelengthpolymorphism，简单序列长度多态性）：

⑴可变排列的简单重复顺序,即重复次数不一,在染色体的同一座位重复顺序拷贝数不同（导致多态性）;⑵SSLP的类型:

小卫星序列（minisatellite）,重复单位较长；微卫星序列（microsatellite）,重复单位较短,在1-6个核苷酸之间。

11.SSR（简单重复序列，即微卫星序列）:

其串联重复的核心序列为1-6bp，其中最常见是双核苷酸重复（CA,TG）,重复单位数目10-60个。

12.如何寻找微卫星序列标记?

⑴1982年Hamada等首次报道microsatellite现象（PNAS,79:

6564,1982）。

⑵1989年Weber等从GenBank中发现人类基因组的8个位点中,有7个位点存在（CA）n拷贝数的变化（Am.J.Hum.Genet.,44:

388,1989）.⑶现已证实人和老鼠基因组中平均每18-28kb含有一个多态性（CA）n.⑷获取方法:

a）机算机搜寻;b）用Sau3A,RsaI,HaeIII或AluI限制酶酶切基因组DNA,构建DNA文库.合成简单寡聚重复核苷酸作为探针从库中筛选.⑸根据简单重复顺序两侧的序列设计引物,用同位素标记PCR扩增样品,经聚丙烯酰胺凝胶电泳分辩.

13.SNP（singlenucleotidepolymorphism,单核苷酸多态性）：

指在基因组上单个核苷酸的变异,包括置换、颠换、缺失和插入，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。

14.SNP的一些特点：

⑴理论上同一碱基位置SNP等位型式最多为4.⑵直接从STS（sequence-taggedsite，序列标志位点）测序中可寻找到SNP.⑶MITWhiteheadInstitute经分析证实,人类基因组平均每1kb含有一个SNP.估计人类基因组有300万个SNP.⑷SNP与人类易感性疾病有关,涉及药物基因组学.⑸编码区SNP主要分布在密码子的摇摆位置（第3个碱基），表现为沉默突变而被保留下来.

15.★遗传图绘制-分子标记的等位型式及F2基因型分析，计算重组率，从而绘制遗传图（Aa/Bb，其中A/B连锁）（图-42）

16.★物理图绘制：

⑴限制性作图（Restrictionmapping）它是将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置。

⑵依靠克隆的基因组作图（Clone-basedmapping）根据克隆的DNA片段之间的重叠顺序构建重叠群（Contig）,绘制物理连锁图。

⑶荧光标记原位杂交（Fluorescentinsituhybridization,FISH）将荧光标记的探针与染色体杂交确定分子标记的所在位置。

⑷顺序标签位点（Sequencetaggedsite,STS）作图通过PCR或分子杂交将小段DNA顺序定位在基因组的DNA区段中（小段DNA序列已知，两端设计引物，利用PCR进行扩增）。

㈠限制性作图（Restrictionmapping）：

将限制性酶切位点标定在DNA分子（一般为小分子DNA）的相对位置。

⑴酶切片段电泳图；⑵推测出限制性物理图。

对于大分子DNA的研究策略与方法：

1）制备---琼脂糖包埋法2）酶切---稀有酶切位点限制酶3）分离---脉冲电泳分离4）克隆---载体设计

①琼脂糖包埋法（知道即可）：

a.分离纯化细胞核b.将收集的细胞核包埋在琼脂糖凝胶薄片中c.蛋白酶消化处理细胞核。

②稀有切点限制性内切酶的应用：

a.什么是稀有切点内切酶：

在基因组DNA顺序中有很少可识别序列的限制酶,一般识别位点在6-8碱基对之间,并含有高G/C比。

b.选用稀有切点限制酶注意事项：

a）识别位点的非特异顺序,-GANTC-（HinfI）,-GCCN4NGCC-（BglI）b）高等生物基因组一般A/T比较高,应选G/C高比例限制酶,如-GCGGCCGC-（NotI）c）基因组甲基化状态,高等生物基因组DNA甲基化比例很高,但果蝇和酵母基因组无甲基化。

③脉冲交变电场电泳：

会跑出一段白色的轨迹，而不是一条一条的片段（因为各片段紧密相连，共同组成了连成一片的轨迹）。

㈡克隆作图（大分子DNA的克隆）：

根据克隆的DNA片段之间的重叠顺序构建重叠群（Contig）,绘制物理连锁图。

克隆作图的载体与方法：

⑴大分子DNA克隆载体构建：

YAC,BAC,PAC,HAC,MAC,TAC。

⑵大分子DNA克隆的作图：

步移法和指纹法。

①YAC（酵母人工染色体）和BAC（细菌人工染色体）基因组文库的构建：

1）目标基因组大分子DNA的制备2）载体制备3）载体和插入DNA的连接4）转化5）转化子鉴定

②染色体步移法：

以A1为探针，找到B1、B2（A1两端与B1、B2分别配对），在分别以B1、B2为探针重复杂交，筛选到下一轮阳性克隆C1、C2，不断重复，建立起彼此连接的重叠群。

③限制性片段指纹作图原理：

a.在两个重叠BAC克隆间存在相同指纹b.重叠BAC克隆DNA凝胶电泳指纹图（重叠的片段在图上显出相同位置的条带）：

BAC克隆酶切后经过琼脂糖凝胶电泳分离，染色后显示片段指纹，再经计算机识别相同的指纹区段，即重叠的BAC克隆。

最后构建指纹重叠群（物理图的绘制），基因组的遗传图可与物理图整合。

㈢顺序标签位点（Sequencetaggedsite,STS）作图：

通过PCR或分子杂交将特定DNA顺序定位在基因组染色体区段中。

STS作图原理：

将染色体DNA随机打断，两个标记所处的物理位置越近，位于同一片段的几率越高。

①辐射杂种作图:

辐射杂种图距单位——DNA分子暴露在N拉徳（rad）X射线剂量下两个分子标记之间发生1%断裂的机率,其图距单位为厘镭（centiRay,cR）.②③

17.物理图的应用——图位克隆或定位克隆：

该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的,无需预先知道基因的DNA顺序,也无需预先知道其表达产物的有关信息（遗传作图→物理作图→转录图→基因顺序）。

1）首先找到与目标基因紧密连锁的分子标记;2）用遗传作图和物理作图将目标基因定位在染色体的特定位置;3）构建含有大插入片段的基因组文库（BAC库或YAC）;4）以与目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库;5）用获得的阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群;6）通过染色体步行、登陆或跳跃获得含有目标基因的大片段克隆;7）通过亚克隆获得含有目的基因的小片段克隆;8）通过遗传转化和功能互补验证最终确定目标基因的碱基序列。

（百科）

18.★图位克隆的步骤：

1）连锁标记的分离与克隆（筛选到）;2）连锁标记向靶基因位置逼近;3）以紧密连锁标记为探针筛选基因组（大插入片段）克隆;4）染色体步移,构建覆盖靶基因位点的重叠群;5）以覆盖靶基因位点的DNA克隆为探针从cDNA文库筛候选基因;6）候选基因多态性分析;7）转基因验证.

第三章基因组测序与诠释

1.本章内容：

①基因组测序的策略②基因组测序的方法③高通量自动化测序④序列组装

2.基因组测序的策略：

①随机测序②限定测序

3.随机测序（与鸟枪法类似）：

①基因组文库的构建②两端测序（基因组DNA→部分酶切→电泳分离→DNA片段建库→挑取克隆→两端测序→形成重叠群→覆盖的DNA区段可得到）

4.基因组测序的方法：

①测序的DNA多聚酶②测序标记③电泳装置④测序难点.

5.测序的DNA多聚酶：

①高酶活性;②无5’→3’外切核酸酶活性;③无3’→5’外切核酸酶活性。

6.链终止法测序（Sanger法）：

和放射性同位素标记测序法不同——①以荧光颜色为标记信号,每种ddNTP各有1种代表颜色;②整个反应在一个试管中进行;③新合成的终止单链通过荧光监测仪时,可以光信号读出末端核苷酸并由电脑记录.

7.化学法测序（Maxam法）：

①分别修饰分别降解;②试剂含有毒性;③链终止法更易于自动化.

8．毛细管电泳：

取代聚丙烯酰胺凝胶电泳，有96个泳道，可同时进行96次测序，每轮不到2小时，一天近千次反应

9.几种不同生物基因组的测序：

1）大肠杆菌基因组测序----图位法2）流感嗜血杆菌基因组测序---鸟枪法3）果蝇基因组测序---鸟枪法4）人类基因组测序---图位法和鸟枪法（鸟枪法局限：

无法测到重复出现的DNA片段）5）拟南芥基因组测序—图位法6）水稻基因组测序---图位法和鸟枪法.

10.流感嗜血杆菌基因鸟枪法测序无需任何关于遗传图及物理图的信息。

11.用于测序的流感嗜血杆菌基因组文库——构建了两套基因组文库，原因是：

1）1.6-2kb大小插入子基因组文库.①2kb大小插入子可减少扩增时的变异率.②此外,2kb大小降低了克隆片段含有完整基因的可能性,有些完整基因的表达产物对宿主菌是有害的.2）15-20kb大小插入子文库,用于支架搭建.上述两套基因组文库的克隆测序均为两端测序.

12.间隙：

测序后将DNA顺序进行组装，存在不连续的区段。

13.★间隙的类型（名解）：

1）顺序间隙：

因覆盖率的原因而留下的未能测序的顺序,仍存在于克隆文库中,这类间隙称为顺序间隙。

2）物理间隙：

因克隆载体自身的限制（库中）或DNA顺序特殊的组成等原因造成某些顺序丢失或未能克隆,这类间隙称为物理间隙。

14.流感嗜血杆菌基因组测序结果（看看即可）：

1）两端测序的结果称为读序（read）,每个读序长约400bp.2）在DNA顺序组装前,由自动测序仪给出的每个读序都必须经PhredII软件处理,以确定给出的顺序质量与可靠性.这一步为顺序认可（callingfor）.3）流感嗜血杆菌基因组测序共组装了24304个片段,建立了140个重叠群（contig）.根据某些克隆跨越不同的contig,再合并为42个支架（scaffold）.4）整个组装的基因组顺序存在42个物理间隙,98个顺序间隙.基因组全长1830137bp（1.8Mb）.

15.★基因组顺序组装的概念定义（名解）：

1）BAC末端顺序（BAC-endsequence）：

一个BAC克隆插入片段两端的已测序的顺序,不包括内部顺序.可用于确定BAC的排列方向以及重叠群（contig）在支架（scaffold）中的排列方向.2）重叠群（contig）：

一群相互重叠的克隆或DNA顺序,可以是草图顺序或精确顺序（finished）,包括连续的（内部无间隙）或不连续的（内部含间隙）DNA顺序.3）草图顺序（draftsequence）：

人类基因组测序计划定义为经PhredQ20软件认可覆盖测序克隆片段3-4倍的DNA顺序.含间隙或无间隙,排列方向和位置未定.4）精确顺序（finishedsequence）：

顺序差错率（错误碱基数）低于0.01%的DNA序列,排列方向确定,内部不含间隙,一般测序覆盖率在8-10个当量.5）支架（scaffold）：

一组已锚定在染色体上的重叠群,内部含间隙或不含间隙.

16.果蝇基因组测序：

第一个采取鸟枪法完成基因组测序的真核生物，基因组总长180Mb。

17.鸟枪法顺序组装流程图（看看即可）：

1）由自动测序仪记录的测序顺序经PhredQ20软件判断采用.2）筛查过滤重复顺序:

如rRNA基因,转座子等。

3）重叠顺序组装:

两段顺序重叠的认可标准为,至少40bp的重叠,差异率小于6%.4）Unitigger（重叠单元）建立:

一组彼此重叠的DNA顺序,其中不存在争议的或不确定的重叠关系,为独立的重叠群.5）支架（scaffold）搭建:

由一组Unitigger相互叠合以及由BAC克隆末端顺序指认彼此相邻的重叠群,内部可能有间隙.

18.定位克隆（即图位克隆，见前）：

首先找到与靶基因连锁的分子标记，然后构建基因组文库。

通过与靶基因连锁的分子标记筛选阳性克隆，再根据克隆插入子两端的DNA顺序查找与之连接的克隆建立重叠群，直到覆盖整个靶基因座位（染色体步移）。

17.线虫基因组测序策略：

图位法

18.★关于基因组测序顺序的概念（名解）：

㈠草图顺序（前有）：

1）达到普通质量但尚未完成的基因组DNA顺序,其精确度高于90%.所处染色体位置已知,一般长度约10kb.2）草图顺序可分为3个等级：

Phase0:

测序覆盖顺序一次的DNA序列;Phase1:

测序覆盖顺序4-10次的BAC克隆,BAC及内部片段的位置和排列方向未定.Phase2:

测序覆盖顺序4-10次的BAC克隆,BAC及内部片段的位置和排列方向已定.㈡完成顺序：

1）完成顺序系指已测序的,每10000个碱基中出现一个差错,且内部不存在间隙的DNA顺序.2）完成顺序也称为Phase3期顺序.

19.玉米基因组如何测序：

1）玉米基因组大小为2500Mb（2.5x10）,约80%DNA顺序由逆转座子组成.2）虽然利用EST（expressedsequencetag）可从基因组中抽提出基因组顺序,但因表达丰度过低或组织专一性表达的原因,ESTs库会丢失50%的基因成员.3）绝大多数逆转座子和非基因编码区都被甲基化,而95%的基因未甲基化.因此采用大肠杆菌McriA和McriB系统构建玉米基因组文库,用以富集基因顺序.

20.玉米基因组甲基化过滤测序法：

1）大肠杆菌McriA和McriB系统可以破坏入侵的含有胞嘧啶甲基化的外源DNA,动物和植物DNA对这一系统也很敏感.2）用甲基化敏感的限制酶切割玉米基因组DNA,将克隆载体转化大肠杆菌McriA和McriB系统菌系,凡是含有胞嘧啶甲基化的克隆均被淘汰,使基因富集7倍.3）采用甲基化过滤法可将玉米基因组中93%的甲基化顺序除去.经过滤后有24%的顺序与基因匹配,而未过滤的仅1.4%与基因匹配.

21.基因组序列诠释：

1）基因注释2）基因功能预测3）基因功能检测4）功能基因组研究

22.真核生物基因的一般结构：

外显子和内含子。

23.真核生物基因的组成特征：

1）外显子的组成2）内含子的组成3）碱基的分布规律

24.★内含子的组成特点：

1）内含子具有前体mRNA加工的特征顺序。

2）内含子含有高比例的三种读框的终止密码。

25.★外显子的组成特点：

1）CpG岛:

脊椎动物2）摇摆密码子的使用频率或密码子偏爱3）5’和3’非翻译区（UTR）碱基比率,水稻基因5’的高GC比4）不含或含有较少的终止密码。

26.密码子偏爱现象：

不同生物表达同种氨基酸的密码子的使用频率不同。

27.同源查询——DNA顺序和氨基酸顺序

28.★同源性,一致性和相似性：

1）同源性（homology）：

基因系指起源于同一祖先但顺序已经发生变异的基因成员,分布在不同物种间的同源基因又称直系基因（orthologousgene）.同一物种的同源基因则称水平基因（paralogousgene）,水平基因由重复后趋异产生.2）基因同源性只有“是”和“非”的区别,无所谓百分比.3）一致性（identity）：

系指同源DNA顺序的同一碱基位置的相同的碱基成员,或者蛋白质的同一氨基酸位置的相同的氨基酸成员,可用百分比表示.4）相似性（similarity）：

系指同源蛋白质的氨基酸顺序中一致性氨基酸和可取代氨基酸所占的比例.可取代氨基酸系指具有相同性质如极性氨基酸或非极性氨基酸的成员,它们之间的代换不影响蛋白质（或酶）的生物学功能.（注意区别一致性和相似性）

29.基因注释的方法：

1.目前基因注释的方法主要依赖于生物信息学方面的分析结论,它们包括以下自动注释内容:

1）abinition软件的预测,依据基因结构的特点.2）同源性比较3）基序（motif）或功能域（domain）分析预测基因功能.2.基因功能的分类主要采用ONTOLOGY标准.3.人工注释系指人为检测评价程序自动注释的结果并根据其它数据进行分析与校正.4.实验注释系根据实验结果进行注释.基因功能注释与调控顺序注释仍处于起始阶段.

30.基因注释标准—人类：

Knowngene:

与人类已知cDNA和蛋白质顺序同源的基因.Novelgene:

与脊椎动物cDNA或其它物种蛋白质同源的基因.Noveltranscripts:

与novel基因相似,但缺少明确的ORF.Putativegene:

有同源EST支持,但缺少cDNA或ORF.Predictedgene:

数据库中至少有一个外显子支持,但缺少cDNA或明确的ORF.Pseudogene（假基因）:

与已知蛋白质有50%的同源性,但cDNA残缺,在其它位点存在正常的同源基因的顺序.

31.水稻注释基因类群的划分标准（3种）：

Homology（同源的）:

与某一蛋白质氨基酸顺序完全一致或相当一致的基因,有两种水平:

一致的命名（samename）;可能的（putativeprotein）或类似的（-likeprotein）命名.Unknown（未知的）:

具有全长cDNA或EST（覆盖几乎整个基因范围）支持但没有任何同源蛋白质记录的基因.hypothetical（假定的）:

由一个或几个注释软件认可的蛋白质,但缺少cDNA或EST支持的基因.

32.人类基因总数的预测有三种方法:

①cDNA和ESTs顺序②机算机注释③比较基因组学（保守的ORF）。

33.几种模式生物注释的基因总数：

大肠杆菌（E.coli）:

4800酵母（yeast）:

6200线虫（nematode）:

19000果蝇（fly）:

13600拟南芥（Arabidopsis）:

25000水稻（rice）:

60000玉米（maize）:

59000（估计数）老鼠（mouse）:

30000。

34.功能域注释：

1）任何基因编码