Agilent气质联用仪软件定量方法图示.docx
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Agilent气质联用仪软件定量方法图示
实验室练习6：
数据定量分析
在这个实验中,您将建立具有三个浓度级别的校正数据库,并将其保存为方法的一部分。
该方法用于未知物的定量计算。
在这个实验中：
∙获取所需信息以设置校正方法
∙建立一个5个浓度级别的含内标的校正数据库
∙定量一个未知化合物
对以下化合物进行定量：
内标
目标化合物
Tributylphosphate
Acetamide,N-phenyl
phenacetin
caffein
积分
精确定量的重要因素之一是正确积分。
1）通过选择File/LoadDataFile…调用C:
\MSDCHEM\1\DATA\VOADATA\CLWV020.D文件，选择Method/LoadMethod…调用DEFAULT.M方法。
2）选择Chromatogram/SelectIntegrator及RTEIntegrator单击OK。
OK对积分来说只是临时选择。
现在让我们对caffein设定积分参数。
3）选择Chromatogram/ExtractIonChromatograms…完成图1所示的需要输入的项目（注意时间范围）单击OK。
图1
4）现在编辑RTE的缺省积分参数。
选择Chromatogram/MSSignalIntegrationParameters…完成图2所示的要输入的项目。
须知当欲在最小峰面积（minimumpeakarea）中添入大于100的数之前必须选中AreaCounts选项框。
图2
5）单击OK接受所做的改变。
现在通过选择Chromatogram/Integrate用这些参数做积分。
注意离子194被积分，而离子67没有被积分。
让我们降低最小面积来解决这一问题。
6）选择Chromatogram/MSSignalIntegrationParameters…完成图3中所示的各项内容。
图3
7）单击Save…和OK输入积分文件名字VOLATILE.P，单击OK。
图4
8）在积分参数框中单击OK返回离子质量色谱。
在Chromatogram/Integrate用降低后的最小峰面积参数做积分。
注意此时离子67和194都被积分了。
现在我们建立并保存了积分参数，它将被用于定量数据库。
9）选择Chromatogram/DrawChromatogram查看当前数据文件的TIC图。
建立校正曲线：
无论SCAN和SIM方式，用提取离子质量色谱做校正和定量比用总离子流色谱峰要好，因为能提高信噪比。
用提取离子定量比用TIC精度更高。
TIC则用于开始设置校正参数时确定保留时间。
10）选择Calibrate/SetUpQuantitation...。
11）QuantitationDatabaseGlobals对话框会显示出来。
完成图5中所需填入的内容。
图5
注意标有NOTICE处用了RTE积分参数文件。
12）完成后单击OK。
EditCompounds框（图6）会显示出来：
图6
13）单击InsertAbove，图7会显示出来：
图7
注意:
必须首先输入内标。
所有在内标之后输入的化合物都用它定量，直到遇到下一个内标。
14）将7-13分钟范围内的色谱图放大在窗口中。
对准窗口2中10.7分钟处双击鼠标右键。
在屏幕上会出现什么信息？
_______________________________________________________________
注意保留时间（箭头在X轴的位置）被填写在QuantSetup窗口。
同时所指定保留时间的质谱显示在窗口1。
15）输入化合物名称。
填入化合物名称。
第二个化合物是Tributylphosphate大约在10.7分钟。
注意如果使用氘代内标时区分定量，化合物是靠信号而不是保留时间，因为内标和要定量的化合物共流出，因此峰会重叠。
ISTD选项被选中。
16）将箭头移到窗口将箭头放在M/Z93上同时击鼠标左右键。
会发生什么？
_______________________________________________________________
17）用同样方法输入一个或几个特征离子。
对于Tributylphosphate，特征离子是135。
18）全部输入之后，在QuantSetup窗口底部击Save键。
这就完成了需要在定量数据库中添加单个化合物的任务。
19）重复以上步骤，把表1中每个化合物输入定量数据库。
（注意Tributylphosphate已经输入了。
）
化合物名称
内标
近似的保留时间
目标离子
特征离子
Tributylphosphate
Yes
10.7
99
155、211
Acetamide,N-phenyl
8.5
93
135
phenacetin
11.1
108
109、179、137
caffein
12.2
194
109、67
表1
20）最后一个化合物输入并保存之后,在定量设置栏目击Exit。
EditCompounds画面（图9）再次显现。
注意此时化合物的列出顺序。
定量化合物永远在内标之后（不管保留时间！
）有4个化合物列于表中。
如有遗漏，点击遗漏的化合物，然后单击InsertAbove...。
当定量设置栏再次出现时输入化合物名字，保留时间，目标/特征离子。
然后单击Save并单击Exit。
一旦4个化合物全部输入，单击Exit退出编辑化合物对话框（图9）。
21）系统提示目前的文件尚未定量。
单击Yes对文件定量。
我们已经添加了化合物信息，现在要添加校正信息。
22）UpdateCalibration对话框（图8）如下：
图8
23）在UpdateCalibration选项框中，为该校正级别输入一个标识。
缺省值是数字（如“1”）但也可以输字母（如“Low”）。
为该级别输入化合物浓度（20）注意已经填入了ISTD浓度。
我们在哪里输入过这个量？
_______________________________________________________________
24）单击DoUpdate键。
定量更新程序会提取指定离子并对其进行RTE积分。
该信息存放在定量数据库中。
EditCompounds画面（图9）显示出来。
图9
25）单击View键查看三页定量信息。
在第3页对错误的值进行编辑。
26）Next键用来查看第二个化合物的条目。
单击OK离开该画面，而单击Exit退出EditCompounds面板回到数据分析。
现在我们拥有了含一个级别的校正数据库。
下一步是为校正数据库添加第二个浓度级别。
建立多－浓度级别校正数据库
27）调用数据文件C:
\MSDCHEM\1\DATA\VOADATA\CLWV050.D.。
28）选择Calibrate/Update…/UpdateOneLevel/OK系统将提示该数据文件未定量，单击Yes进行定量。
29）下一步进入UpdateCalibration对话框。
将浓度改为50，将校正级别改为2，单击DoUpdate…自动为数据库插入新浓度级别。
30）Exit退出editcompounds界面。
从这一标准校正曲线更换保留时间和离子比例，会改写原来用光标输入的和这一标准的微小差别。
31）选择Calibrate/Update…/UpdateOneLevel/OK填写图10所示各项内容，单击DoUpdate。
图10
32）按照1）至5）步骤输入下列浓度级别。
不必再次输入保留时间和离子比例。
数据文件和化合物浓度列于表2中：
数据文件
浓度
浓度级别号
CLWV100.D
100ppm
3
CLWV150.D
150ppm
4
CLWV200.D
200ppm
5
表2
内标浓度与前两个标样相同（50ppm）。
33）5个浓度级别输入之后，单击View以便检查浓度是否正确。
34）选择第一个化合物，单击Plot看它的标准曲线，包括其校正因子和相关系数。
出现什么信息？
_______________________________________________________________
由于画内标化合物的曲线是无意义的，您不可能画出内标化合物的校正曲线，为什么内标化合物曲线是无意义的？
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35）在Compound窗口单击Next（如必要击OK保存更改）画面，化合物#2以校验该化合物的第二个浓度级别的数据。
在Plot窗口单击Print打印（这是获得方法文件的较好途径）。
36）打印之后击OK，改变线性拟合方式取得最佳平均响应因子（AvgofResponseFactors），再做曲线。
反复用LinearRegr，Force（0,0）拟合包括原点在内的各点，加以比较。
重新设置拟合方式AvgofResponseFactors。
对本次分析何种拟合方式更可靠，为什么？
_______________________________________________________________
37）查看过三页化合物信息之后，选OK然后Exit退出该窗口。
该校正数据库当前存储在计算机RAM中，所以下一步是使其永久保存于硬盘中。
校正数据库作为方法的一部分保存。
38）选择Method/SaveMethod...。
39）为新方法命名为CLASSVOA.M。
建立了新方法，原来的方法（DEFAULT.M）未改变。
我们常用现有的方法作为模板建立新方法。
方法自动存储在缺省地址C:
\MSDCHEM\n\METHODS这里n是仪器编号。
使用自动定量设置
AutoQuantSetup（自动定量设置）提供了一种给定量数据库创建化合物列表的半自动方法。
下列指南可引导您使用AutoQuantSetup（自动定量设置）的全部步骤。
该指南使用化学工作站随附的演示文件。
在该指南中使用default.m和evaldemo.d之前，请先复制一份。
1.在DataAnalysis（数据分析）中，加载示范方法C:
\MSDCHEM\1\METHODS\DEFAULT.M和示范数据文件C:
\MSDCHEM\1\DATA\EVALDEMO.D。
2.在Spectrum/SelectLibrary（谱图/选择谱库）下选择DEMO.L。
3.选择Calibrate/AutoQuantSetu（校准/自动定量设置）。
4.出现QuantitationDatabaseGlobals（全局定量数据库）对话框时，进行如下更改：
校准标题—键入AutoQuantTutorial
使用RTEINT—选中该对话框来使用RTE积分器（不选则使用化学工作站积分器）。
单击OK（确定）。
5.出现Dodecane（十二烷）的ChooseCompoundName（选择化合物名称）对话框时，单击Skip（跳过）。
为了示范，您可以先跳过这个化合物，以后再把它添加到数据库中。
6.接下来出现Biphenyl（联苯）。
保持缺省名称，单击Add（添加）。
7.接着出现4-Chlorobiphenyl（4-氯联苯）。
保持缺省名称，单击Add（添加）。
8.接着出现Methylpalmitate（十六酸甲酯）。
要将它指定为内标，单击ISTD（内标）。
单击ISTD同时把化合物添加到数据库中。
9.当软件提示Quantitatenow?
（现在定量？
）时，单击Yes（是）。
文件量化后，出现UpdateCalibration（更新校准）对话框。
10.选择AddNewLevel（添加新校准级），输入如下内容：
CalibLevelID=50
CmpdConc=50
ISTDConc=50
然后单击DoUpdate（执行更新）。
11.显示EditCompounds（编辑化合物）对话框时，注意十六酸甲酯处于列表顶端的正确位置，在其名称旁边有一个星号说明它是内标。
12.单击Exit（退出）关闭对话框，或单击View（查看）检查第1页、第2页和第3页中的各化合物参数。
13.要了解怎样向定量数据库中插入化合物，请选择AutoQuantSetup（自动定量设置）。
14.选择InsertCompoundsinDatabase（在数据库中插入化合物），单击OK（确定）。
15.出现QuantitationDatabaseGlobals（全局定量数据库）对话框时，不要更改参数。
单击OK（确定）。
软件会再次开始鉴定峰。
出现ChooseCompoundName（选择化合物名称）对话框。
16.对话框中出现Dodecan（十二烷）时，保持缺省名称并单击Add（添加）。
出现EditCompound（编辑化合物）对话框。
17.选中Biphenyl（联苯），选择一个插入点并单击InsertAbove（插入上文）。
18.ChooseCompoundNames（选择化合物名称）对话框中留存的3个化合物已经存在定量数据库中，因此单击Skip（跳过）。
跳过这3个化合物后，软件将问您是否StopNow?
（现在停止?
）单击Yes（是）。
这一特点在对大量化合物进行数据库操作时非常有用。
19.系统问您是否希望定量数据库时，单击Yes（是）。
20.出现UpdateCalibration（更新校准）对话框时，选择Recalibrate（重新校准）并对Responses（响应）和RetentionTimes（保留时间）字段选择替换。
单击DoUpdate（进行更新）。
21.出现EditCompounds（编辑化合物）对话框时，单击View（查看）并检查数据库中4个化合物中每个化合物的第3页。
注意您加入的Dodecane（十二烷）没有浓度值。
22.在Concentratio（浓度）字段对校准级50键入50。
单击OK（确定），然后单击Yes（是）保存更改后的数据。
23.单击Exit（退出）。
未知化合物定量
40）调用C:
\MSDCHEM\1\DATA\VOADATA\DLWV002.D.选择Quantitate/Calculate。
哪个窗口用来显示报告结果？
41）在Quantitate菜单条目下选GenerateReport…同时指定格式为Detailed，输出终端为Printer。
42）单击OK。
该报告与摘要报告有何不同？
_______________________________________________________________
当校正数据库中有大量被测物，而仅仅对其中之一感兴趣时使用详细报告（单一化合物）。
43）选择Quantitate/ReportOptions…填写下图所需要的内容，击OK。
图11
44）在Quantitate菜单下选GenerateReport...同时指定格式为Detailed，输出终端为Printer。
45）单击OK。
该报告与以前的详细报告有何不同？
_______________________________________________________________
46）选择Quantitate/ReportOptions…按图12完成面板，单击OK。
图12
47）在Quantitate菜单下选GenerateReport...同时指定格式为Detailed，输出终端为Printer。
48）单击OK。
该报告与以前的详细报告有何不同？
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