乳腺癌相关miRNA的研究进展.docx

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乳腺癌相关miRNA的研究进展

乳腺癌相关微小RNA的研究进展

乳腺癌发生机制和癌细胞耐药机制至今仍尚未完全阐明；近年来科研工作者对乳腺癌相关组织或细胞中微小RNA（microRNA,miRNA）进行了研究，为阐明乳腺癌的发生、发展机制，并对其治疗提供了崭新的思路。

　　1 miRNA简介

　　miRNA是一类长度约为18～25个核苷酸（nucleotide，nt）（平均22nt）的非编码小RNA分子，通过与mRNA的3端非翻译区（3′untranslatedregion，3′UTR）结合而介导翻译水平的调控。

miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ的指导下，转录成命名为primiRNA的初级转录物。

然后primiRNA进入由Drosha酶和辅助因子DGCR8（Disgorgesyndromecriticalregiongene8）／Pasha所构成的复合体中，在细胞核中被剪切成长约60～70nt）、具有发夹结构的miRNA前体（precursormicroRNA，premiRNA）。

在核膜转运蛋白（exportin）5（Exp5）的协助下，premicroRNA从核内被转运到胞质中，经Dicer酶的作用被进一步剪切成21～25nt的成熟miRNA。

成熟的miORNA整合入基因沉默复合体（RNAinducedsilencingcomplex，Rlsc）形成miRISC复合物，通过直接剪切靶mRNA或者与靶mRNA的非翻译区互补结合，抑制靶mRNA的翻译、影响蛋向质的合成，从而来调控多种生物学行为。

miRNA涉及的主要生物学领域有：

干细胞的分化〔1〕，细胞的凋亡〔2〕，出生缺陷〔3〕以及肿瘤的发生〔4〕。

　　2 miRNA的研究方法

　　mRNA的研究方法主要包括两大类，即生物信息学分析和生物学实验方法。

在miRNA研究的初期，生物信息学方法发挥了非常重要的作用，可为miRNA研究提供有益的线索，指导实验的进行。

而生物学实验则能提供直接而有力的证据，对预测结果加以确认。

二者各有优势，互为补充，有机地将miRNA的生物信息学分析方法和生物学实验方法相结合，是miRNA研究的合理选择。

　　2.1 生物信息学分析方法

　　2.1.1 miRNA基因预测 miRNA克隆是发现miRNA基因的主要方法，但该方法存在许多缺陷，比如由于受所选取的组织样品量的限制，一些低表达量的miRNA可能会被遗漏，出现假阴性的结果。

随着人们对miRNA结构特点及保守性的逐渐了解，依据miRNA在进化过程中的保守性及其茎环结构的前体结构特点编写计算机程序，对miRNA进行预测正成为寻找新miRNA基因的主要方法。

Lim等使用MjrScan软件，分别在线虫和人中鉴定了30个和38个新的miRNA基因〔5〕。

MirScan采用了一种独特的算法，即首先通过RNAfold软件寻找保守的并且可以形成茎环结构的序列作为候选miRNA前体，然后再与已知miRNA进行相似性比较，对候选前体评分，得分超过某一设定域值者作为候选的miRNA基因〔6〕。

但只有少数候选miRNA基因已被实验确证：

还有些候选基因的表达模式尚未知晓，未检测出其表达，因而出现假阳性结果〔7〕。

　　2.1.2 miRNA靶基因预测 成熟的miRNA通过其序列5′端的2～8个碱基（seed区）与mRNA上的相应靶点结合，发挥其抑制翻译和诱导mRNA降解的功能〔8〕。

人们只有先对miRNA靶基因进行预测，才能对miRNA靶基因开展鉴定和功能研究等后续工作。

从已知的miRNA与靶基因的相互作用中，人们发现miRNA5′端的seed区可以与靶mRNA3′端UTR区或者CDS区结合。

因此，这一特点被各种靶基因预测方法广泛采用。

同时结合miRNA与靶基因形成二聚体的热力学稳定性和二级结构分析软件，如MFold、RNAFold和RNAhybrid等，以及将miRNA的57端与靶基因的互补情况等作为其他限制条件来进行miRNA靶基因预测。

目前，不同研究小组已开发出多个miRNA靶基因预测软件，如TargetScan、miR。

anda、Pictar、DIANAMicr。

oT和miRBaseTargets等。

　　不同的预测方法，其程序算法不尽相同，结果很可能有较大偏筹；为减小不同方法带来的偏差，在实际应用中，需要多种算法联合分析。

例如〔9〕：

当分析miRNA在人血管紧张素I型受体（hAT1R）基因上的靶位时，miRanda软件预测出27个结合位点，TargetScan预测结果超过37个结合位点，其中有8个位点与miRanda结果重复：

而应用PicTar算法，却未找到结合位点。

也有观点表明：

至少应由上述两种算法预测出的miRNA的结合位点，才对后续的miRNA靶位的证明实验有较大意义〔10〕。

　　2.2 miRNA靶标基因的体外验证 在生物信息学软件预测之后，为了排除预测的无功能位点和进一步对miRNA进行功能研究，还需进行miRNA靶标基因的确认和鉴定。

该实验过程需先将靶mRNA完整的3′UTR序列克隆至SV40启动子驱动的报告基因（通常为萤火虫荧光素酶）的下游，如果一个特定miRNA可以与这个靶mRNA3′UTR相结合，就会抑制报告蛋白的生成，因此可通过检测被抑制的报告蛋白的活性（或表达程度），来判断miRNA／mRNA之间的交互作用〔10〕。

该方法简单易行，但其只是一种体外验证方法，不能完全模拟体内真实的调控环境。

因此，当探讨特意miRNA在某一生理或病理过程中的功能、宣召其靶基因时，应选择合适的细胞膜性或其他有效的实验工具。

　　2.3 miRNA与mRNA的共表达及miRNA对靶蛋白的作用 一种miRNA只有与其靶基因mRNA在生物体内共表达（coexpression），才能发挥其抑制靶基因表达的功能。

miRNA与其靶基因是否共表达，可以简单地通过northernblot或者荧光定量PCR（qPCR）来证实。

由于TaqMan定量PCR方法操作简便，可重复性强，被推荐为分析特定miRNA与靶mRNA的常用方法。

例如，生物信息学预测hATlR基因的3′UTR区存在miR155的结合位点，研究者提取了血管平滑肌细胞（VSMCs）的总RNA，并以此为模板进行qPCR检测，分析hATlR和miR.155二者是否在特定细胞中存在共表达的现象。

研究结果表明hATlR和miR155均在VSMCs细胞中有表达，并且hATIR的表达水平受miR155的抑制〔11〕。

　　此外，研究者还可以利用miRNA对靶蛋白的调控，来证实miRNA对靶点的作用。

通常是先将存在miRNA／mRNA共表达的细胞暂时过度的表达所要研究的miRNA，利用Western印迹方法分析靶基因所编码蛋白的表达变化，从而进一步验证miRNA对靶蛋白的作用。

除Westernblot以外，ELISA或者免疫化学荧光试验方法也可以用来对蛋白质的表达进行定量的研究。

　　2.4 miRNA生物学功能的研究 如果通过实验能够证实某个miRNA可以对其靶基因进行相应的调控，则需进一步研究miRNA的生物学功能。

主要包括细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、细胞迁移等常规生物学方法，还可以通过检测细胞表型改变等间接方法研究miRNA对蛋白质的影响〔12〕。

　　3 乳腺癌细胞中miRNA的相关特征

　　研究者以乳腺癌细胞系、正常乳腺组织和乳腺癌组织作为研究对象，利用不同方法检测出众多与乳腺癌相关的miRNA，然后利用某些分子生物学标记和细胞代谢活动的相关数据，推测这些miRNA的功能。

在乳腺癌中各种miRNAs的功能不尽相同，对于其功能的分类也会因需要而有所差异；这里我们把乳腺癌相关miRNA分为癌基因miRNA和抑癌基因miRNA两类：

当某些miRNA的表达在肿瘤中升高时，就被看做是癌基因；反之，则为抑癌基因〔14〕。

　　3.1 抑癌基因miRNA

　　3.1.1 miR206 miR206是Iorio等比较正常乳腺组织与癌组织中miRNA表达差异时，最早发现的与乳腺癌发生相关miRNA〔14〕。

miR206在乳腺癌中的表达水平和ER的表达成负相关，机制比较复杂，包括蛋白质的磷酸化、乙酰化、SUMO化修饰、多泛素化修饰等。

在ERα阴性乳腺癌细胞中，其表达量有所上升，提示miR206的功能可能与下调ERα基因的表达有关。

Adams等发现：

miR206可以与ERα受体mRNA的3′UTR端两个特异序列结合，下调ERQ的翻译，而不会影响ER13基因的表达；同时发现雌二醇（E2）或特异性ERα激动剂PPT也能明显下调miR206的水平。

值得注意的是，ERα激活剂可以抑制miR206的表达，ERβ激活剂或者黄体激素却没有抑制作用，这说   明miR206对ERα基因表达的调控网络中存在反馈调节。

此外他们还发现mir21、let27d也能调控ERαmRNA的表达水平，提示不同的miRNA可以调控同一个靶基因〔15〕。

在ERα阳性乳腺癌细胞中，miR206的表达量则明显下降，若再将miR206转入雌激素依赖的MCF7乳腺癌细胞中，癌细胞的增殖受到抑制，这同样说明miR206对乳腺癌细胞中ERα的表达的负调控作用〔16〕。

miR206可能在乳腺癌恶性转化及其转化过程中ER受体表达缺失导致非雌激素依赖性生长中起调控作用，但具体功能仍有待于进一步研究〔17〕。

　　3.1.2 miR175p miR175p是来源于经常发生杂合子丢失（LOH）的染色体13q31区域的一簇miRNA。

有学者通过生物信息学算法推测miR175p的潜在靶点为AIB1一种可以上调ERα和E2F1转录的转录辅助激活因子〔18，19〕。

miR175p通过抑制AIBl的表达，从而使ER和E2F的表达发生改变。

降低AIBl的表达可以使E2依赖性的乳腺癌细胞、非E2依赖性的乳腺癌细胞、ER菲依赖型的乳腺癌细胞的增殖速度下降〔20〕。

此外，miR175p／miR20a家族的表达水平与肿瘤细胞中cyclinD1的表达呈负相关性，miR175p／miR20a通过与cyclinD13′端UTR区保守序列结合，来抑制cyclinD1的翻译。

cyclinD1也可以反馈调节miR175p／miR20a的表达，miR175p对细胞周期的调控，可能是乳腺癌发生的原因之一〔21〕。

　　3.1.3 miR27b 功胞色素P4501Bl（cytochromeP450，family1，subfamilyb，polypeptide1，CYPIBI）是细胞色素氧化酶P450家族1Ⅱ家族B的惟一成员：

CYPlBl的作用是催化某些致癌物和17β的代谢；包括乳腺癌在内的众多肿瘤中都能检测到其过表达〔22〕。

CYPlBl基因mRNA序列中所预测的miRNA结合位点与miR27b的序列有良好的匹配关系。

与正常组织细胞相对比，miR27b在乳腺癌细胞MCF7中的表达水平明显下降，同时CYP1B1处于高表达水平，由此说明miR27b有下调CYPlBl表达的功能〔23〕。

　　3.1.4 miR125a和miR125b 这组miRNA在过度表达HER2的乳腺癌细胞中显著下调〔24〕。

通过生物信息学方法在HER2和HER3基因3′UTR区域发现了miR125的靶点。

在乳腺癌细胞中，高表达的HER2基因和其蛋白产物，可导致乳腺肿瘤进一步的恶化〔25〕。

在细胞实验中，SKBR3（一种ErbB2依赖性的人类乳腺癌细胞系）细胞中miR125a和miR125b过表达，可以抑制HER2、HER3的转录、表达，从而降低SKBR3细胞的附壁生长能力、细胞转移能力、侵袭力，起到了抑制肿瘤的作用。

但miR125a、miR125b过表达对HER2非依赖性的乳腺癌细胞系MCF10A的抑制作用却不明显〔26〕。

　　3.1.5 miR200c Hurteau等应用生物信息学方法和定量RTPCR技术发现miR200c的靶位之一是一种重要的肿瘤延长因子TCF8（也称作σEF1），该因子介导上皮钙黏蛋白抑制物的转录和乳腺癌上皮细胞的可塑性调定〔27〕。

在原本低表达miR200c的MDAMB231乳腺癌细胞中，增加miR200c的表达量后，TCF8的水平出现下降，钙黏连蛋白E的水平有所恢复，细胞异型性程度也有所下降〔28〕。

miR200c的这种作用机制，可阻止乳腺癌细胞“上皮间充质细胞（EMT）”的转变过程，也阻碍了细胞的恶变〔29〕。

　　3.1.6 miR335、miR126和miR206 miR335、miR126和miR206是一族可能与乳腺癌转移、扩散相关的miRNA。

通过与非选择性的乳腺癌MDAMB231细胞进行对比，研究者首先找出了六种 （rrliR335，miR126，miR206，miR122a，miR199a*，miR489）在高转移乳腺癌细胞系中表达量降低的miRNA。

在乳腺癌骨转移细胞和肺转移细胞中，恢复miR335、miR126、miR206的表达水平后，小鼠模型中肿瘤细胞的转移能力明显下降。

在培养的细胞中，过度表达miR126后可抑制细胞的增殖：

而在体外试验中，miR335和miR206的表达可使细胞的侵袭力降低；在乳腺癌临床标本中，低表达miR335和miR126的临床病例，因肿瘤的恶性侵袭而表现为极低的生存率。

研究者还在侵袭性细胞找出了四个miRNA335的直接作用靶点，它们分别是蛋白酪氨酸性磷酸酶 （PTPRN2），酪氨酸蛋白激酶（MERTK），成分同生蛋白C（TNC）和以SRY基因为基本成员的一类控制发育的SOX4。

这些靶点的表达水平可以作为精确判断肿瘤侵袭性依据〔17〕。

　　3.1.7 Let7家族 根据肿瘤干细胞假说，肿瘤干细胞与肿瘤的发生、进展、转移、耐药以及复发有直接关系〔30〕。

具有自我增殖能力的乳腺癌干细胞（BTIC）可以通过分选纯化的CD44+CD24/low细胞或者孤立悬浮培养的细胞球而获得。

有实验表明，从乳腺癌患者体内分离出来的细胞以及富含CD44+CD24/low细胞的Sk3rd细胞中，let7家族的miRNA在潜在的乳腺癌干细胞表达有显著的下降。

在小鼠模型内，过表达let7家族miRNA后，可以降低肿瘤细胞的增殖、形成乳腺球囊细胞团、生长和转移的能力，因此在今后的临床治疗中，Let7家族具有很大的应用前景〔31〕。

　　3.1.8 miR205 在乳腺癌细胞MCF7、MDAMB231中，miR205表达比良性乳腺肿瘤细胞和正常乳腺细胞低。

miR205可调控表皮生长因子ErbB3和血管内皮生长因子A（VEGFA），miR205通过直接与靶蛋白mRNA的3′UTR端结合，抑制靶蛋白的生成。

在肿瘤细胞中过表达miR205，可以抑制癌细胞的增殖、非停泊性生长和侵袭〔32〕。

因此在乳腺癌细胞中转染miR205可以在未来临床中，作为治疗乳腺恶性肿瘤的方法。

　　3.2 起癌基因作用的miRNA

　　3.2.1 miR21 科研工作者应用实时RPCR研究5种乳腺癌肿瘤中的157种miRNA时，发现miR21的表达明显升高〔33〕，并发现敲除miR21的MCF7乳腺癌细胞表现为敲除量依赖性的低生长、高凋亡；在小鼠转移模型中miR21有抑制肿瘤增殖和降低肿瘤标记物Ki67抗体结合能力的作用〔34〕。

为进一步了解miR21作用的分子生物学机制，应用蛋白质组学的方法，对比过表达的肿瘤细胞和miR21敲除的肿瘤细胞的蛋白质表达差异，发现具有抑制肿瘤作用的原肌凝蛋白（TPMl）是潜在靶点之一〔35〕。

YanLX等检测了113例乳腺癌标本中miR21的表达情况，可知miR21高表达的患者由于早期症状不明显、癌细胞通过淋巴转移，表现为愈后较差、生存期较短。

因此miR21可以作为乳腺癌预后效果和疾病进展的一项监测指标〔36〕。

近期WickljamasingheNS等人发现，E2可以通过ER介导，使miR21的靶位丢失，从而抑制miR21在MCF7乳腺癌细胞中的表达〔37〕。

　　3.2.2 miR155、miR9和miR10 研究人员在筛选乳腺癌细胞和人正常乳腺上皮细胞之间差异表达的miRNA时，发现乳腺癌细胞中miR155、miR91、miR10b的表达量都有显著的上升。

不同于miR155和miR9的是，miR10b仅在转移的乳腺癌细胞中高度表达。

功能学研究表明，体外miR10b的过度表达可以促进细胞的迁徙和侵袭，在体内miR10b则可以启动肿瘤的侵袭和转移。

研究人员还发现，与浸润性小叶癌相关的转录蛋白Twist的高表达，可直接诱导miR10b的表达。

miR10b的推测靶点为转录因子的同源异型盒D10（HOXD10），miR10b抑制HOXD10的翻译，导致细胞在启动转移基因的产物RAs同源基因家族成员C的诱导下发生了一系列的异常变化〔38〕。

3.2.3 miR27 miR27a是对SKBr3细胞应用凋亡前计量的组胺脱乙酰激酶抑制剂LAQ824治疗后，表达下调的一种miRNA〔39〕。

miR27潜在的靶点是细胞转录因子ZBTB10／RINZF，一种调控细胞周期的特殊转录因子蛋白（SPl）的抑制物。

miR27作为一种肿瘤癌基因miRNA，通过调节ZBTB10表达后从而使SPl蛋白过度表达，引起细胞癌变；miR27也可使SP2和SP3过度表达，这同样具有引起癌变的作用〔40〕。

　　3.2.4 miR221／222 乳腺癌MCF7和T47D细胞中过表达miR221／222，使雌激素受体表达量下降，同时高度表达miR221／222的MCF7和T47D的细胞对于抗肿瘤药物他莫两芬（tamoxifen）有耐药作用。

由此推测miR221／222的靶位为雌激素受体修复基因和乳腺癌抗激素治疗的基因〔41〕。

　　3.2.5 miR210 miR210是FoekensJA等近期发现的与乳腺癌相关的miRNA。

miR210是在低氧环境下被诱导产生、从而引起细胞癌变〔42〕，并且与ER+／LNN和ER／LNN乳腺癌的转移复发有密切关系，也是非转移性乳腺癌预后较差的有效标志之一〔43〕。

　　4 展望

　　目前临床中，局部的手术范围日趋保守，化疗、放疗、内分泌治疗及生物治疗等综合治疗的有效性使得乳腺癌的长期生存率不断提高，生活质量也不断改善，但总生存率仍然不理想。

生物分子靶向治疗是一项十分有希望的治疗手段。

寻找新的治疗靶点，正是目前研究的热点。

FDA于2007年批准了GSK公司研发的针对HER2和EGFR的双靶点小分子靶向药物Lapatinib，在临床上取得了比较好的疗效。

miRNA的发现及其乳腺癌相关靶基因的确定，初步揭示了其在乳腺癌发生和发展中的调控作用，为寻找乳腺癌生物治疗的新靶标提供了很有希望的方向。

如本文所述，一种miRNA有多个相关的靶基因，如果以这些miRNA为治疗靶点，其效率可能远比针对单一的靶基因高。

同时恢复或沉默肿瘤相关的miRNA技术，在乳腺癌的治疗领域中将会有潜在的应用前景。

与miRNA功能相似的siRNA相关药物已经进入临床试验阶段，但miRNA是内源性的短链RNA，因此理论上针对miRNA的治疗将比siRNA具有更高的安全性。

目前miRNA在乳腺癌的研究刚刚起步，对其功能及其靶基因的认识还不清楚。

miRNA及其靶基因预测方法的日益成熟、检测技术的日新月异，一定能够极大地推动miRNA在多种生理学和病理学过程中的重要调控作用，而miRNA与肿瘤的相关研究为肿瘤的预防和治疗开辟了崭新的领域，miRNA的干扰技术有可能成为治疗乳腺癌的一种新的手段。

miRNA基因芯片技术也很可能成为肿瘤诊断的工具，以调控机体生命活动的miRNA为靶点或以miRNA为治疗手段的设想，以后可能会成为研究焦点。

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