β葡萄糖苷酶产生菌的分离鉴定及酶学性质分析.docx
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β葡萄糖苷酶产生菌的分离鉴定及酶学性质分析
学科分类号:
081801
本科学生毕业论文
题目（中文）：
β-葡萄糖苷酶产生菌的分离鉴定及酶学性质分析
（英文）：
Isolationandidentificationofβ-glycosidase-producing
strainandresearchontheenzymaticcharacteristics
姓名
学号200907002134
院（系）生命科学与化学工程系
专业、年级生物工程专业2009级
指导教师
2013年05月10日
目录
摘要I
AbstractII
第1章绪论1
1.1β-葡萄糖苷酶介绍1
1.2β-葡萄糖苷酶的酶族分类1
1.3产β-葡萄糖苷酶的分布来源1
1.4β-葡萄糖苷酶的理化性质2
1.5β-葡萄糖苷酶的应用及前景展望2
1.6国内外有关本选题的研究动态2
1.7本选题的意义3
第2章材料与方法4
2.1材料、仪器与试剂4
2.1.1材料4
2.1.2实验仪器4
2.1.3试剂及药品4
2.2实验方法4
2.2.1实验步骤4
2.2.2菌种鉴定5
2.3酶学性质实验6
2.3.1酶的最适反应pH6
2.3.2酶的最适反应温度6
2.3.3金属离子对酶活的影响6
第3章结果与讨论7
3.1β-葡萄糖苷酶产生菌的初筛7
3.2β-葡萄糖苷酶产生菌的复筛和酶活测定7
3.2.1复筛7
3.2.2β-葡萄糖苷酶酶活测定7
3.3菌种鉴定8
3.3.1显微形态观察8
3.3.2菌落形态观察8
3.3.3生理生化实验9
3.3.4革兰氏染色反应9
3.4酶学性质的研究9
3.4.1β-葡萄糖苷酶的最适pH9
3.4.2β-葡萄糖苷酶的最适温度10
3.4.3金属离子对酶活的影响11
第4章结论与讨论13
4.1讨论13
4.2结论14
参考文献15
致谢17
β-葡萄糖苷酶产生菌的分离鉴定及酶学性质分析
摘要
β-葡萄糖苷酶（EC.3.2.1.21）又称纤维二糖酶,它属于纤维素酶类，是纤维素分解酶系中的重要组成成分。
本实验的目的是分离获得β-葡萄糖苷酶高产菌株，确定该菌类的分类地位，并对其所产的β-葡萄糖苷酶的酶学性质进行初步研究。
本实验是采用七叶灵显色法从土壤样品中筛选β-葡萄糖苷酶产生菌,再用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）显色法进行复筛；通过形态特征、生理生化特征等方法确定其分类学地位；以PNPG为底物,测定β-葡萄糖苷酶的最适反应pH及最适反应温度。
实验发现从土壤样品中筛选出的高产菌株ZF-6C，初步鉴定为Bacilluskorlensis。
芽孢杆菌中ZF-6C，最适反应pH和温度分别为7.0和40℃；金属离子Ca2+、Pb+增加酶活，而Cu2+、Fe2+抑制酶活。
从芽孢杆菌中分离得到β-葡萄糖苷酶，芽孢杆菌ZF-6C所产β-葡萄糖苷酶从最适合的反应条件pH和温度方面，分析可能为一有高催化效率β-葡萄糖苷酶。
【关键词】β-葡萄糖苷酶；分离鉴定；芽孢杆菌；酶学性质
Isolationandidentificationofβ-glycosidase-producing
strainandresearchontheenzymaticcharacteristics
Abstract
Beta-glycosidaseenzymes（EC.3.2.1.21）alsocalledcellobiase,itbelongstothecelluloseenzyme,istheimportantcomponentofcellulolyticenzymes.Thediscretionoftheenzymeactivitydirectlyaffecttheoverallofcelluloseenzymeactivity.Thepurposeofthisexperimentisseparationofbeta-glycosidase-productionstrainsfromsoil,toclarifythetaxonomicstatus,andtostudytheenzymaticcharacteristicsoftheβ-glycosidaseAβ-glycosidase-producingstrainwasisolatedfromsoilsampleusingesculinand4-nitrophenyl-β-D-glycopyranoside（PNPG）colorationmethods;thetaxonomicstatusofstrainZF-6Cwasclarifiedbymorphological,physiological,chemotaxonomiccharacteristics;withPNPGasthesubstrate,theoptimalreactionpHandtemperatureofβ-glycosidaseweredetermined.Astrain,whichproducedβ-glycosidaseathighlevel,wasisolatedfromsoilandidentifiedasBacilluskorlensis,theoptimumreactionconditionsforthisenzymewerepH7.0and40°C.MetalionsCa2+andPb2+enhancedenzymeactivity,Cu2+andFe2+inhibittheenzymeactivity.Itisolatedfrombacillusbeta-glycosidaseenzymes,BacilluskorlensisZF-6Cproducedbeta-glycosidaseenzymesfromtheaspectsofthemostsuitablepHandtemperatureofthereactionconditions,theanalysismayhaveahighcatalyticefficiencybeta-glycosidaseenzymes.
[Keywords]Beta-glycosidaseenzymes;isolationandidentification;Bacilluskorlensis;enzymaticcharacteristics
第1章绪论
1.1β-葡萄糖苷酶介绍
β-葡萄糖苷酶（β-D-Glycosidase，EC3.2.1.21），又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶（cellobias，CB或β-G）和苦杏仁苷酶。
它属于纤维素酶类，是纤维素分解酶系中的重要组成成分，能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。
1.2β-葡萄糖苷酶的酶族分类
根据氨基酸序列分类，人们将β-葡萄糖苷酶划分在糖苷水解酶家族l和3中。
家族l中的β-葡萄糖苷酶来源于细菌、植物；家族3中的酶来自真菌、细菌和植物。
家族l中的酶除有葡萄糖苷酶活性外。
还有很强的半乳糖苷酶活性[1]。
根据高级结构的相似性，糖苷酶家族可以被分成若干部族（Clan）。
糖苷水解酶家族l属于‘clanGH-A’．其特点是催化结构域具有（β∕α）桶状结构，2个羧基氨基酸参与催化反应，作为质子供体和亲核基团。
分别位于第4位和第7位的β折叠上[2]。
Moracci等通过比较11种糖苷族l的酶氨基酸序列发现-N-E-P-和-Y-I-E-N-两个保守列．并用定点突变的方法证明保守序列中的两个Glu分别是酸键集团和亲核集团。
也有试验通过自杀底物共价修饰和定点突变试验证明这种结论[3]。
1.3产β-葡萄糖苷酶的分布来源
1837年Liebig和Wohler首次在苦杏仁汁中发现了β-葡萄糖苷酶。
该酶在自然界中的分布广泛，在植物的种子和微生物中尤为普遍，在动物和真菌体内也发现该酶的存在。
β-葡萄糖苷酶的植物来源有人参、大豆等；微生物来源的报道较多，如原核微生物来源的有脑膜脓毒性黄杆菌（Flavobacteriummeringosepticum）、约氏黄杆菌（Flavobacteriumjohnsonae）等，真核生物来源的有清酒酵母（Candidapeltata）、黄孢原毛平革菌（Phanerochaetechrysosporium）等；β-葡萄糖苷酶的动物来源有蜜蜂、猪肝、猪小肠等。
目前已经发现的产β-葡萄糖苷酶的生物类群包括原核生物、真核生物。
β-葡萄糖苷酶普遍存在于植物、微生物和哺乳动物的肠道中。
植物中很多来源的β-葡萄糖苷酶被纯化和研究，这些来源有植物的种子、果实、叶苗、根和花。
微生物有约氏黄杆（Flavobacteriumjohnsonae）、多粘性芽孢杆菌（Bacilluspolyrnyxa）、肠膜明串珠菌（Leuconostoc
mesenteroides）、链霉菌（Streptomyces）、镰刀菌（Fusariumoxyspornum）、假丝酵母菌（Candidapeltata）、出芽短梗霉（Aureobasidiumpullulans）、汉逊德巴利酵母（Debaryomyceshanseni）、木霉（Trichodermakoningii）、青霉（Penincilliumaurantiogfiseum）、黑曲霉（Aspergillusniger）、米曲霉（Aspergillusotyzae）、干酪乳杆菌（1actobacilluscasei）等。
现在对真菌中β-葡萄糖苷酶产生菌研究较多的是丝状真菌，主要为曲霉属和木霉属。
而细菌中研究较多的是芽孢杆菌属。
1.4β-葡萄糖苷酶的理化性质
β-葡萄糖苷酶有胞内酶和胞外酶之分。
有些生物体内只含有胞内β-葡萄糖苷酶，也有只含胞外β-葡萄糖苷酶，但是有少部分微生物体内同时含有胞内和胞外β-葡萄糖苷酶。
β-葡萄糖苷酶的相对分子量一般在40-250KD之间。
不同来源的β-葡萄糖苷酶的相对分子量由于其结构和组成不同而差异很大。
大部分β-葡萄糖苷酶的最适pH值都在酸性范围，并且变化不大，但最适pH值可以超过7.0，而且酸碱耐受性强。
β-葡萄糖苷酶的最适温度在30-110℃之间都有分布，一般来说，来自细菌的β-葡萄糖苷酶其稳定性和最适温度要高于普通微生物来源的β-葡萄糖苷酶。
对于工业应用来说。
酶的热稳定性越高越有利。
对来自嗜热性和非嗜热性β-葡萄糖苷酶的分析认为，两者在相互演化过程中的酶修饰作用并不改变酶的活性中心，也不改变其专一性。
只是将酶蛋白结构作部分调整以适应高温环境[4]。
1.5β-葡萄糖苷酶的应用及前景展望
β-葡萄糖苷酶在很多行业内广泛应用，具有巨大的商业价值，例如，作为饮料的前提物释放风味成分[5-7]，生产燃料乙醇[8]，作为洗涤剂的有效成分[9]。
β-葡萄糖苷酶广泛应用于牛仔裤产品的洗涤加工、纺织品抛光整理等纺织业加工中。
β-葡萄糖苷酶可以打断水果、鲜花、茶叶等植物中的糖苷键，使键合态的芳香组分释放出来，产生有天然香气的风味物质，可以改善食品的风味，在食品领域也有广泛的应用[10]。
目前，国内对黑曲霉中β-葡萄糖苷酶研究较多．但由于采用黑曲霉作为产酶菌株存在食品安全卫生方面的隐患．所以在食品加工中的应用受到限制。
目前有研究选用德氏乳杆菌亚种进行β-葡萄糖苷酶的分离和纯化，并应用于大豆异黄酮的水解过程中，制备大豆异黄酮苷元。
通过该菌株生产的β-葡萄糖苷酶具有高安全性的特点，为β-葡萄糖苷酶的应用和开发提供更广阔的空间。
1.6国内外有关本选题的研究动态
β-葡萄糖苷酶作为纤维素酶的一个重要组成部分，在医疗、食品、生物质转化中有重要的应用价值，特别是随着近年来环境能源等危机的加重，木质纤维素作为自然界最广泛的碳源受到各国政府的高度重视。
β-葡萄糖苷键的水解是纤维素彻底降解为单糖的一个瓶颈。
采用基因工程与蛋白质工程手段获得优良的β-葡萄糖苷酶已经成为研究热点。
国外许多研究机构正致力于β-葡萄糖苷酶的分子生物学研究。
从基础领域研究酶的催化机制及表达调控机制，以期望更好改善纤维素酶的催化效率。
随着表达系统的发展与完善，β-葡萄糖苷酶已经在大肠杆菌和酵母中得到高效表达。
近年来在芽胞杆菌、丝状真菌以及植物中都有β-葡萄糖苷酶重组表达的报道。
国内近年来研究β-葡萄糖苷酶已经成为热点，已由过去的研究β-葡萄糖苷酶的简单提取到现在的酶的培养条件优化以及粗酶液的纯化。
β-葡萄糖苷酶基因的克隆表达已经得到实现，新构建的工程菌已经应用到生产实践。
1.7本选题的意义
目前已知的纤维素酶产生菌株所产生的β-葡萄糖苷酶的酶活普遍偏低，对这些菌株进行分子改造又耗时耗力。
那么，从自然界中直接筛选β-葡萄糖苷酶的酶活较高的出发菌株，是获得β-葡萄糖苷酶高产菌株的最直接有效的方法。
此项实验就是从自然界中筛选出高产菌株从而研究其功能作用以及其酶学性质，以期更好的应用于生产实践。
第2章材料与方法
2.1材料、仪器与试剂
2.1.1材料
土壤样品采集自湖南科技学院西山树下泥土。
2.1.2实验仪器
培养皿、1000mL容量瓶、试管、烧杯、锥形瓶、电子分析天平（A15120）、恒温培养箱（HWS-270）、pH试纸、分光光度计、振荡培养箱、接种环、移液枪、玻璃棒、移液管等。
2.1.3试剂及药品
七叶灵、水杨酸、蛋白胨、酵母浸膏、酵母粉、NaCl、柠檬酸铁铵、琼脂、DNS试剂、柠檬酸、Na2HPO4、Na2CO3、MgCl2、CaCl2、FeCl2、KCl、MnSO4、Pb（NO3）2、CuSO4、ZnSO4、对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-glycopyranoside,PNPG）等。
注：
此实验所用药品皆为分析纯。
2.2实验方法
2.2.1实验步骤
2.2.1.1几种培养基配方
（1）LB培养基配方
蛋白胨10g/L
酵母提取物5g/L
氯化钠10g/L
pH=7.4
LB固体培养基配制：
100mlLB培养基加入1.5g琼脂粉
（2）牛肉膏-蛋白胨培养基配方
牛肉膏1.5g
蛋白胨5g
氯化钠2.5g
琼脂10g
水500g
pH=7.0-7.2
（3）无氮培养基配方
葡萄糖1%
K2HPO40.05%
MgSO40.02%
CaCO30.1%
酵母膏0.04%
玻璃粉0.1%
琼脂2%
pH=7.0
2.2.1.2初筛
取1g土样，加入10mL无菌水，充分打散，制成悬液，取1mL悬液于富集培养基中进行富集培养，37°C、180r/min培养24h。
取富集培养液稀释50倍后涂布于初筛培养基平板，37°C培养24h，用接种环挑取周围有黑色水解圈的单菌落进一步划线纯化。
2.2.1.3复筛
将初筛到的菌株分别接种到LB培养基中，37°C、180r/min培养24−36h，发酵液12000r/min离心10min，收集上清液，进行酶活力测定，每个菌株重复3次。
2.2.1.4β-葡萄糖苷酶酶活测定[11]
取比色皿,加入发酵液上清10μL,0.1mol/LpH7.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（CP）80μL,50mmol/LPNPG10μL,于37°C保温15min。
空白对照以LB培养基代替发酵液上清,其余同上。
反应完毕后,加入100μL1mol/LNa2CO3显色,用分光光度计测450nm处吸光度（OD450）。
1个酶活力单位（U）定义为:
pH=7.0、37°C条件下,每分钟生成1μmolPNP所需的酶量。
2.2.2菌种鉴定
2.2.2.1菌落形态观察
在平板上划线接种，35°C培养，24-48h后观察菌落边缘和表面的质地、颜色、纹饰等形态变化。
2.2.2.2显微形态观察
用压片法，在光学显微镜下观察菌株的形态。
压片法：
取出一块载玻片，在载玻片的中央第一滴清水，将实验材料放入水滴中，用镊子捣碎，另取一块载玻片，呈十字交叉压在材料上，用拇指用力按压，将材料压散，小心将两块载玻片分开，注意移动材料的位置。
2.2.2.3生理生化实验
灭菌完毕后，取5支无菌试管，每支倒入9mL无菌水。
用一支1mL无菌吸管从中吸取1mL复筛后悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌试管从此试管中已无菌操作吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，依此类推制成不同稀释度的土壤溶液，比浓度分别为10-1,10-2,10-3,10-4,10-5。
8套培养皿，倒4个牛肉膏－蛋白胨培养平板，4个无氮培养平板。
采用涂布平板法接种。
其中必要的平板采用混悬法涂布，即先倒菌液再倒琼脂并混匀的方法，用于分离厌氧菌。
将平板倒置放入
30°C培养箱中培养3天。
2.2.2.4革兰氏染色反应
取载玻片用纱布擦干，载玻片的一面用marker笔画一个小圈（用来大致确定菌液滴的位置）。
涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。
左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。
让涂片在空气中自然干燥。
让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。
将固定过的涂片放报纸上，滴加草酸铵结晶紫液，染1min。
用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。
简单染色结束可观察细胞形态。
滴加1滴碘液，染1min，水洗。
吸去残留水，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水洗。
滴加蕃红复染3-5min，水洗。
2.3酶学性质实验
2.3.1酶的最适反应pH
用柠檬酸、Na2HPO4、NaOH、Na2CO3配制缓冲液,用此缓冲液配制pH2.0−11.0的系列梯度酶液，37°C条件下分别测定酶活，每组重复3次。
2.3.2酶的最适反应温度
在最适pH条件下，在20°C、30°C、40°C、50°C、60°C、70°C、80°C温度梯度下分别测定酶活，每组重复3次。
2.3.3金属离子对酶活的影响
在反应体系中添加一定浓度的金属离子Mg2+、Ca2+、Fe2+、K+、Mn2+、Pb2+、Na+、Cu2+、Zn2+至终浓度为1mmol/L，在最适反应条件下，以PNPG作为底物测定酶活。
以未加入金属离子的酶液为对照组，设其酶活为100%。
第3章结果与讨论
3.1β-葡萄糖苷酶产生菌的初筛
采用七叶灵平板显色法对来自土壤样品的菌落进行初筛，通过观察菌落周围黑色水解圈的有无，确定β-葡萄糖苷酶产生菌。
根据七叶灵在初筛中的作用，菌落周围有黑色水解圈，则该菌落为β-葡萄糖苷酶产生菌，初筛得到13株活性菌株。
3.2β-葡萄糖苷酶产生菌的复筛和酶活测定
3.2.1复筛
将初筛到的菌株分别接种到LB培养基中培养24−36h后，离心分离收集到含有β-葡萄糖苷酶的上清液。
3.2.2β-葡萄糖苷酶酶活测定
要进行β-葡萄糖苷酶酶活测定，首先要绘制葡萄糖标准曲线。
在不同葡萄糖浓度下测定其OD值，得到数据如表3.1所示。
表3.1不同浓度葡萄糖的OD值
葡萄糖浓度（mg/ml）
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
OD（A）
0
0.097
0.149
0.284
0.385
0.491
0.571
0.692
0.835
读取表3.1数据，以葡萄糖浓度为横坐标，A为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线（见图3.1）。
由图可知，葡萄糖浓度与A成一次函数关系。
其表达式为：
Y=0.0173X－0.0256，其中，R2=0.9866。
图3.1葡萄糖标准曲线
经过PNPG复筛后，测定初筛得到的菌株的酶活。
记录每种菌株的吸光度值，根据酶活计算公式，酶的活力=A×K×4／10×nU/g（ml）,其中，A：
样品平行试验的平均OD值K：
吸光常数4：
反应试剂的总体积10：
酶解反应时间n：
酶液稀释总倍数。
由公式得知，吸光度越高，酶活越高，得到如图3.2所示。
图3.2β-葡萄糖苷酶活性菌株复筛结果
3.3菌种鉴定
3.3.1显微形态观察
菌株细胞呈杆状。
如图3.3（A）。
3.3.2菌落形态观察
在营养琼脂培养基上菌落乳白色,圆形,扁平,湿润,表面光滑,不透明,边缘较整齐。
如图3.3（B）。
图3.3菌株的菌体及菌落形态
3.3.3生理生化实验
挑选出的菌落在牛肉膏-蛋白胨培养基和无氮培养基上均有生长，可认为该菌株为异养型菌株。
3.3.4革兰氏染色反应
通过对菌株进行革兰氏染色反应，镜检发现呈紫色，革兰氏反应为阳性。
3.4酶学性质的研究
3.4.1β-葡萄糖苷酶的最适pH
通过本实验可以看出，在不同pH条件处理下，β-葡萄糖苷酶的酶活性各不相同；对照组和实验组中的每个梯度统一在相同环境下实验，以PNPG为底物，于不同pH缓冲液体系中测定酶活，以对照组为最高酶活（100%），其余为相对酶活，记录不同变量下的数据，得到如表3.2所示。
表3.2不同pH值下的相对酶活（%）
组数/pH
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
1
0
0
10
83
97
106
75
58
51
8
2
0
0
11
75
101
108
66
59
53
9
3
0
0
9
82
103
116
69
63
46
13
平均值
0
0
10
80
100
110
70
60
50
10
读取表3.2数据所得，不同pH条件下，β-葡萄糖苷酶的活性各不相同；但是，随着pH的增加，β-葡萄糖苷酶的活性也在增加，达到一定上限后则开始下降，而这个临界pH值则是7.0。
根据表3.2数据处理后得到如图3.4所示结果。
图3.4不同pH下的相对酶活（%）
这表明，在一定范围内，中性PH值对β-葡萄糖苷酶的活性作用最高，而到达一定的上限后，高或者低的pH值则对β-葡萄糖苷酶的活性都有一定影响，相对酶活度降低。
从而得到β-葡萄糖苷酶的最适宜pH值为7.0。
3.4.2β-葡萄糖苷酶的最适温度
本实验的另一个因素是温度，从实验中可以看出，不同的温度下，β-葡萄糖苷酶的活性也是不同的；同样的在对照组和实验组中的每个梯度统一在相同环境下实验，在最适pH条件下，于不同温度下测定酶活，以对照组为最高酶活（100%），其余为相对酶活，记录不同变量下的数据，得到如表3.3所示。
表3.3不同温度下的相对酶活（%）
组数/温度（℃）
20
30
40
50
60
70
80
1
18
49
103
80
54
33
8
2
19
42
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