细胞总蛋白提取考马斯亮蓝测蛋白含量.docx
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细胞总蛋白提取考马斯亮蓝测蛋白含量
蛋白样品的获得主要包括破碎法、沉淀法、蛋白溶解等，可以根据实验目前选择最合适的方法，本文主要总结了蛋白抽提的仪器和材料的准备，试剂溶液的配制以及具体的操作步骤。
蛋白提取方法
1材料和方法
1.1材料
1.1.1组织和细胞的来源：
1.1.2仪器设备
机械组织匀浆器
低温高速离心机（>40,000g）
超速离心机
超生细胞破碎仪
超纯水装置
1.1.3试剂
三氯醋酸（TCA）
丙酮
二硫苏糖醇（DTT）
尿素
CHAPS
PMSF
EDTA
乙醇
磷酸
考马斯亮蓝R350
抑肽素A
亮肽素
试剂纯度均应是分析纯或以上。
1.1.4溶液配制
（1）PBS：
NaCl8g,KCl0.2g,Na2HPO41.44g,KH2PO4，溶于800ml水中，用HCl调pH至7.4，用纯水定容至1L;
（2）EDTA储存液：
18.61gNa2EDTA•2H2O，溶于70ml纯水中，用10mol/LNaOH调节pH值至8.0（约需2gNaOH颗粒），定容为100ml。
可高压灭菌后分装备用;
（3）亮肽素储存液（50μg/ml，100×）
10mg/ml溶于水，-75℃保存;使用时配成50μg/ml储液，-20℃保存;
（4）抑肽素储存液（70μg/ml，100×）
1mg/ml溶于甲醇，-75℃保存;使用时配成70μg/ml储液，-20℃保存;
（5）PMSF储存液（10mM,100×）:
17.4mgPMSF，溶于1ml异丙醇中，-20℃保存。
DTT储存液（1M）:
0.31gDTT溶于2mlH2O中，-20℃保存（DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理，可过滤除菌）。
（7）裂解液:
LysisbufferA
（9Murea,4%w/vCHAPS,1%w/vDTT,0.5%CAandacocktailofproteaseinhibitors）
LysisbufferB
（7Murea,2Mthiourea,4%w/vCHAPS,1%w/vDTT,0.5%CAandacocktailofproteaseinhibitors）
LysisbufferC
40mMTris-base（pH9.5）inultrapureH2O
LysisbufferD
（8Murea,4%CHAPS,40mMTris（base）,40ml）
LysisbufferE
（5Murea,2Mthiourea,2%SB3-10,2%CHAPS,1%w/vDTT,0.5%CAandacocktailofproteaseinhibitors）
LysisbufferF
100μLSDSsamplesolution（1%w/vSDS,0.375MTris-HCl,pH8.8,50mMDTT,25%v/vglycerol）
●CA、蛋白酶抑制剂混合物和DTT在临用前加入。
蛋白酶抑制剂混合物[3]
成分终浓度
蛋白酶抑制剂混合物PMSF35μg/mlor1mM
EDTA0.3mg/ml（1mM）
抑肽素0.7μg/ml
亮肽素0.5μg/ml
1.2方法
1.1.1组织蛋白提取方法
1.2.1.1三氯醋酸/丙酮沉淀法[1]
（1）冰上取材，称湿重，置液氮中冻存或直接进行下一步;
（2）在液氮中研碎样品或使用机械匀浆器磨碎组织;
（3）将粉末悬浮于含DTT（0.2%w/v）的10%三氯醋酸（w/v）的丙酮溶液中;
（4）蛋白–20℃沉淀过夜;
（5）35000×g（6℃）离心30min;
将沉淀重悬于含0.2%DTT的预冷丙酮中;
（7）-20℃放置1h;
35000×g（6℃）离心30min;
（9）在通风橱中让丙酮充分挥发，得到干燥的沉淀;
（10）在裂解液中重新溶解沉淀（50-100mg组织需要1ml裂解液）;
（11）15℃,40000×g，离心1hr;
（12）用Bradford法[2]测定上清的蛋白浓度，分装后置–75℃保存。
1.2.1.2超速离心法
（1）取材;
（2）用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末，每1g样品加入0.5ml裂解液，使用组织匀浆器匀浆30s;
（3）组织悬液15℃，10000×g离心10min;
（4）上清液4℃，150000×g超速离心45min;
（5）小心避开上层漂浮的脂质层，吸取离心上清6℃40,000g再次离心50min;
取离心上清。
Bradford法定量，分装后置–75℃保存。
1.2.2培养细胞蛋白提取
1.2.2.1循环冻融法
（1）吸出培养液弃去，0.01mol/LPBS洗一次;
（2）加入PBS，用橡胶刮收集细胞于10ml离心管中;
（3）500×g，离心5min;
（4）弃上清，PBS洗三次（室温,500×g，5min），
（5）在离心管中加入1mlPBS，重悬细胞，用1ml微量加液器移入Eppendorf管中;
执行Biofuge存储程序8，500×g5min离心;
（7）用200μl微量加液器吸出PBS，弃去;
吸干残留的PBS，估计样品体积，加入5倍体积裂解液，巴氏滴管混匀，液氮中反复冻融三次（每次置液氮中3s，室温融化），DTT在第一次冻融后加入;
（9）执行Biofuge存储程序6，15℃，40000×g，离心1hr（Biofuge）;
（10）上清Bradford法定量，沉淀-75℃保存备用。
1.2.2.2超声破碎法
（1）取对数生长期的细胞，吸出培养液弃去，0.01mol/LPBS洗一次;
（2）加入PBS，用橡胶刮收集细胞于10ml离心管中;
（3）室温，500×g，离心5min;
（4）弃上清，PBS洗3次（室温,500×g，5min）;
（5）在离心管中加入1mlPBS，重悬细胞，用1ml微量加液器移入Eppendorf管中，500×g离心5min;
吸干残留的PBS，估计样品体积，加入5倍体积裂解液，混匀，移入1.5mlEppendorf管中，冰浴中以最大功率超声破碎细胞（3×10s）;
（7）15℃,40000×g，离心1hr（Biofuge）;
上清Bradford法定量，沉淀-75℃保存备用。
2.结果和讨论
蛋白质提取的基本步骤包括清洗组织或细胞、裂解细胞、离心除去膜组分等获得溶解的蛋白质上清。
我们破碎细胞采用循环冻融法和超声波法;破碎组织采用液氮研磨法和机械匀浆法。
循环冻融法操作简便，比较适合提取培养细胞的稳定蛋白，我们后期实验对培养细胞主要采取这种破碎方式。
使用超声破碎必须注意的是控制强度在一定限度，即刚好低于溶液产生泡沫的水平。
因为产生泡沫会导致蛋白质变性，同时要注意散热。
匀浆是机体软组织破碎最常用的方法之一。
由于匀浆过程中蛋白质被蛋白酶降解的可能性较小，所以匀浆是简便、迅速和风险小的组织破碎方法，我们实验室在破碎脑和脊髓组织时常用此法;由于神经组织比较柔软，液氮研磨法也很适合，本实验中我们使用了这一方法破碎大鼠脊髓组织，中枢神经组织由于富含脂类，沉淀法和高速离心法可以使蛋白和脂类干扰物质有效分离，但沉淀法的缺点是再溶解时蛋白损失严重。
高速离心的缺点是需要样品量大，如BeckmanL7-65超速离心机的离心管容量为8ml，不适用小量样品的制备。
在众多的裂解液配方中，我们主要采用9M尿素,4%w/vCHAPS,1%w/vDTT,0.5%两性电解质加蛋白酶抑制剂混合物，原因是这一配方经长期使用很稳定，裂解效率也较高，非常适合小量细胞蛋白提取要求。
针对富脂的中枢神经组织中脂类物质与蛋白相互作用，高浓度的尿素可以造成强变性条件（但如果再提高尿素浓度，尿素就容易析出，影响蛋白的溶解），过量的去污剂也可以减少脂类的污染，两性电解质可以提高蛋白的溶解度，同时有利于等待聚焦。
早期我们加入Tris碱以防止蛋白的水解，但是由于盐离子的引入，导致IEF电压过低，影响聚焦。
蛋白抽提纯化过程中务必保证实验的试剂、仪器等整个实验过程中没有蛋白酶的作用，一定要抑制蛋白酶的活性，可以通过加入苯甲基磺醯化氟PMSF和AEBSF抑制苏氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶活性、加入EDTA抑制金属蛋白酶活性，高的pH可以抑制大多说蛋白酶活性。
、
细胞总蛋白的提取及裂解液
一．悬浮细胞计数107重悬于0.5mlPBS（0.01M）中，加入饱和浓度一抗（1/10）或
（10ug/ml）4℃15-30min后，短暂离心4000转×3分，用PBS0.4-0.5ml重悬（室
温）,加入饱和浓度二抗（1/100）或（20ug/ml）,迅速置于37℃水浴中2-5分后
（迅速加入终止液0.5ml（冷pbs中含有400uMNa3VO4
5mMEDTA,10mMNaF））,
离心4000转×3分，弃上清,置于冰浴中,加入裂解液0.2-0.3ml（裂解浓度
108/ml？
）吸管轻轻混匀，冰点缓慢震摇孵育30分钟后加入10ul浓度为10mg/ml
的PMSF储存液，冰点孵育30分钟。
4度离心15000g20min。
上清液即为全部细
胞溶解成分。
二．裂解缓冲液：
50mMTris-HClpH7.6或20mMHepespH7.4
150-300mMNaCl
1％（w/w）NP-40（0.5%Triton-X100）
5mMEDTA（现加1ml加10ul）
临用前加入蛋白酶抑制剂：
Na3VO4
钒酸钠1mM（75mM—13.3ul/ml）
（用0.2mol/L储存液配制）
PMSF苯甲酰氟1mM（10mg/mlPMSF用量：
10ul/ml）
或10-20ug/mlSoybeanTrypsininhibitor（加10-20ul）
Aprotinin抑肽酶10ug/ml（10ul/ml）
（Leupeptin亮肽素10ug/ml未加）Westernblotting
三．给你介绍一个裂解液：
50mMTris-HCl（PH8.0）缓冲液，含：
NaCl150mM
叠氮钠0.02%
SDS0.1%
NP-401%
PMSF100ug/ml（使用前临时加入）（10mg/mlPMSF用量：
10ul/ml）
尽量用少的裂解液裂解细胞，取上清电泳，最好用6xSDS上样buffer。
四．我的样品蛋白是这样制备的：
１．将与腺病毒转染液共培养２４小时的细胞消化下来
２．离心收集细胞
３．向离心管里加入４０微升１×PBS缓冲液，随后再加入４０微升2×Lamily
buffer（由tris碱和SDS组成）裂解细胞
４．将细胞裂解液放入沸水中加热五分钟，放冷后离心．
５．测定蛋白浓度，加样电泳
我所说的前沿有蛋白是指胶的底端，不是指加样孔下面有蛋白．胶的浓度应该没
问题。
五．碧云天公司技术支持
Western及IP细胞裂解液的主要成分为20mMTris（pH7.5），150mMNaCl，1%
TritonX-100，以及焦磷酸钠,β-glycerophosphate，EDTA，Na3VO4，leupeptin
等多种抑制剂。
可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。
（-20
℃保存，一年有效。
）
如果是贴壁细胞，按照6孔板每孔加入100微升裂解液的比例（即细胞培养液量
的1/20）加入裂解液。
六．军科院技术支持
裂解液（50mmol/LTris?
HClpH8.0，150mmol/LNaCl，1％TritonX－100，100ug/ml
PMSF）：
1mol/LTris?
HCl（pH8.0）2.5ml
NaCl0.438g
TritonX－1000.5ml
蒸馏水至50ml
混匀后，4℃保存。
使用时，加入PMSF至终浓度为100ug/ml（0.87ml裂解液
加入1.74mg/mlPMSF50μl）。
七．操作方法：
蛋白样品制备：
（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：
1、倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置
一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
2、每瓶细胞加3ml4度预冷的PBS（0.01MpH7.2～7.3）。
平放轻轻摇动1min
洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将
PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
3、按1ml裂解液加10ulPMSF（100mM），摇匀置于冰上。
（PMSF要摇匀至无
结晶时才可与裂解液混合。
）
4、每瓶细胞加400ul含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂
解培养瓶要经常来回摇动。
5、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪
将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行。
）
6、于4度下12000rpm离心5min。
（提前开离心机预冷）
7、将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于－20度保存。
考马斯亮蓝法
也称考马斯蓝染色法（coomassiebluestaining）又称Bradford法。
由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。
考马斯亮蓝G-250（CoomassiebrilliantblueG-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。
该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000μg/mL，最小可测2.5μg/mL蛋白质，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
考马斯亮蓝有G250和R250两种。
其中考马斯亮蓝G250由于与蛋白质的结合反应十分迅速，常用来作为蛋白质含量的测定。
考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程
该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。
如核糖核酸酶或溶菌酶。
去污剂的浓度超过0．2%影响测定结果。
如TritonX-100、SDS、NP-40等。
1．Bradford浓染液的配制：
将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然后，用蒸馏水补充至1000ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定。
2．标准曲线蛋白质样本的准备：
尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。
如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。
通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。
3．将待测样本溶于缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同（最好用PBS）。
4．按1：
5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。
5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min。
染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。
注意，显色反应不得超过30min．
6．根据标准曲线计算待测样本的浓度。
注意：
考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。
待一两周左右，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。
蛋白质浓度测定的方法有很多，考马斯亮蓝测定蛋白质是实验室最常见的一种方式，它利用比色法和色素法混合方法、操作简便，下文介绍了考马斯亮蓝测定蛋白质浓度的原理、优缺点、操作以及注意事项。
实验原理
考马斯亮蓝（CoomassieBrilliantBlue）法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。
这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰（lmax）的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。
通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
考马斯亮蓝染色法的突出优点是：
（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。
这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。
完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。
由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。
因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
（3）干扰物质少。
如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺点是：
（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：
去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠（SDS）等。
试剂与器材
一、试剂
考马斯亮蓝试剂：
考马斯亮蓝G―250100mg溶于50mL95%乙醇中，加入100mL85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL。
二、标准和待测蛋白质溶液
1.标准蛋白质溶液
结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/mL蛋白溶液。
2.待测蛋白质溶液。
人血清，使用前用0.15mol/LNaCl稀释200倍。
三、器材
试管1.5×15cm（×6），试管架，移液管管0.5mL（×2）;1mL（×2）;5mL（×1）;恒温
水浴;分光光度计。
操作方法
一、制作标准曲线
取7支试管，按下表平行操作。
试管编号
0
1
2
3
4
5
6
标准蛋白溶液（mL）
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.15mol/LNaCl（mL）
0.1
0.09
0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
考马斯亮蓝试剂（mL）
5mL
摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色
A595nm
绘制标准曲线：
以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
二、未知样品蛋白质浓度测定
测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。
根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/mL）。
注意事项
在试剂加入后的5-20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。
测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
利用考马斯亮蓝法分析蛋白必须要掌握好分光光度计的正确使用，重复测定吸光度时，比色杯一定要冲洗干净，制作蛋白标准曲线的时候，蛋白标准品最好是从低浓度到高浓度测定，防止误差。
考马斯亮蓝法测定牛血清蛋白的标准曲线？
一、标准曲线
一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。
因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。
二、蛋白质含量测定方法
1、凯氏定氮法
2、双缩脲法
3、Folin-酚试剂法
4、紫外吸收法
5、考马斯亮蓝法
三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作
（一）、试剂：
1、考马斯亮蓝试剂：
考马斯亮蓝G—250100mg溶于50ml95%乙醇，加入100ml85%H3PO4，雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。
最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。
2、标准蛋白质溶液：
纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。
（二）、器材：
1、722S型分光光度计使用及原理（）。
2、移液管使用（）。
（三）、标准曲线制作：
试管编号0123456
100ug/ml标准蛋白（ml）0.00.10.20.30.40.50.6
0.15mol/LNaCl（ml）10.90.80.70.60.50.4
考马斯亮蓝试剂（ml）5555555
摇匀，1h内以1号管为空白对照,在595nm处比色
A595nm
1、
2、以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20ug、30ug、40ug、50ug、60ug），在坐标轴上绘制标准曲线。
1）、利用标准曲线查出回归方程。
2）、用公式计算回归方程。
3）、或用origin作图，测出回归线性方程。
即A595nm=a×X（）+6
一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。
4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。
（四）、蛋白质含量的测定：
样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。
一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。
（五）、注意事项：
1、玻璃仪器要洗涤干净。
2、取量要准确。
3、玻璃仪器要干燥，避免温度变化。
4、对照：
用被测物质以外的物质作空白对照。
一、原理
考马斯亮蓝G-250（CoomassieG-250）是一种甲基取代的三苯基甲烷，分子中磺酸基的蓝色染料，在465nm处有最大吸收值。
考马斯亮蓝G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成蛋白质—考马斯亮蓝复合物蓝色溶液，引起该染料的最大吸收λmax的位置发生红移，在595nm处有最大吸收值。
由于蛋白质—考马斯亮蓝复合物在595nm处的光吸收远高于考马斯亮蓝在465nm处的光吸收，因此，可大大地提高蛋白质的测定灵敏度。
蛋白质—考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。
利用溶液颜色的差异进行比色测定，适合于蛋白质类的定量分析，尤其适合于稀有蛋白质的微量分析。
考马斯亮蓝G-250试剂呈色反应颜色稳定、灵敏度高，最低测试蛋白质量在1ug左右。
二、操作步骤
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