PCR临床基因扩增程序文件.docx
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PCR临床基因扩增程序文件
在控
临床基因扩增检验实验室
程序文件
文件编号：
WH5Y-5-PCR-201～218
B版
编制：
审核：
批准：
生效日期：
2011年9月20日
武汉市医院检验科
序号
主题内容
文件编号
页码
1
各区域日常工作程序
WH5Y-5-PCR-201
2
2
温度、湿度监控和记录程序
WH5Y-5-PCR-202
4
3
清洁消毒程序
WH5Y-5-PCR-203
5
4
生物安全及防护程序
WH5Y-5-PCR-204
6
5
废弃物处理程序
WH5Y-5-PCR-205
7
6
人员培训程序
WH5Y-5-PCR-206
8
7
数据保护程序
WH5Y-5-PCR-207
9
8
试剂和实验用品购买、验收和储存程序
WH5Y-5-PCR-208
10
9
样本管理程序
WH5Y-5-PCR-209
12
10
样本采集运送程序
WH5Y-5-PCR-210
13
11
样本接收程序
WH5Y-5-PCR-211
14
12
样本的保存和安全处置程序
WH5Y-5-PCR-212
15
13
纸型记录和电子记录控制程序
WH5Y-5-PCR-213
16
14
报告单管理程序
WH5Y-5-PCR-214
17
15
保密和保护所有权程序
WH5Y-5-PCR-215
18
16
室内质量控制程序
WH5Y-5-PCR-216
19
17
室间质量评价程序
WH5Y-5-PCR-217
22
18
抱怨处理程序
WH5Y-5-PCR-218
23
修订页
日期
文件标题
文件编号
页码
修改者
审阅者
批准者
各区域日常工作程序
1目的实验室各区域的各项工作有序进行、在控。
2范围临床基因扩增检验实验室的各工作区域。
3职责
3.1责任人当班工作人员。
3.2完成时间每一工作日。
4工作流程
本临床基因扩增实验室分为①试剂准备区；②样本处理区；③扩增分析区。
4.1每周一下午准备本周使用的灭菌离心管和吸头、清洁消毒药品、手套、鞋套、工作帽和口罩等一次性消耗品,分装好放至各工作室。
每工作日离开工作区域前进行实验台面的移动紫外线消毒，时间为60min。
4.2样本收集
4.2.1在样本接受处按WH5Y-5-PCR-212《样本保存和安全处置程序》清理门诊、病房样本，接收临时送到实验室的样本；不合格样本退回。
注：
此过程不可以打开样本盖；
4.2.2将样本编号离心,按顺序登记在WH5Y-5-PCR-412《样本接收、拒收与报告单放送记录》中，并做好唯一性标识，然后将样本信息按序输入LIS系统中；
4.2.3将清理好的样本转到免疫室冰箱冷藏室中，2～8℃存放时间不超过3天；
4.2.4工作日取出标本，进行检测。
4.3试剂准备
4.3.1进入本室时穿白色工作服,戴帽子和手套，穿鞋套；
4.3.2按当天工作量准备所需试剂；
4.3.3收拾实验台面，并在作相应记录；
4.3.4将试剂送至样本处理区门外台面上，脱掉手套、帽子、工作服和鞋套。
4.4样本处理
4.4.1进入本室时穿蓝色工作服,戴帽子和手套，穿鞋套；
4.4.2将样本按序排放并核对；
4.4.3对不同的样本类型及申请项目按相应的样本处理作业指导书进行处理；
4.4.4实验过程中随时对物表进行清洁。
有泄露发生时应立即对实验室进行清洁消毒,并记录；
4.4.5加完质控品、对照品及待测模板后,瞬时离心放入冰箱,收拾实验台面,清洁、消毒，并作相应记录；
4.4.6将反应管送至样本处理区门外台面上，脱掉手套、帽子、工作服和鞋套。
4.5产物扩增分析
4.5.1进入本室时更换红色工作服,戴帽子和手套，穿鞋套；
4.5.2依次打开电脑显示屏、主机开关，DA7600扩增仪开关；打开软件，机器预热15～20min；
4.5.3关闭软件，将反应管按预定位置放入反应槽内相应位置；
4.5.4按DA7600作业指导书进行编程、运行；
4.5.5检测结束时先将数据存盘,再进行分析后传入LIS系统；
4.5.6收拾台面，并作相关记录；
4.5.6脱掉本室工作服,脱掉手套、帽子、工作服和鞋套；
4.6签发报告单
4.6.1评价样本及质控数据,制作质控图表，并分析质控数据；
4.6.2若出现不符合检测工作数据,则要查找原因,及时与临床联系,或进一步证实。
对难以判断需复查的结果，登记清楚并简要写明原因；
4.6.3核对检验结果，审核检验报告单；
4.6.4收拾实验台面，并作相应记录。
5.引用表格和文件
5.1WH5Y-5-PCR-426《工作日志》
温度、湿度监控和记录程序
1目的为确保样本、试剂始终处于指定环境，实验过程及仪器运行处在合适的环境条件，必须对实验室温度、湿度；冰箱、温箱的温度加以维持、监控，并作详细记录。
2范围监控温度或湿度的实验室、各温控设备。
3职责
3．1责任人当班工作人员。
3．2完成时间实验室温度、湿度，温控设备温度，每工作日进入该区域工作时记录1次，冰箱温度每天记录1次，干热恒温器每次试验前10分钟记录1次。
3．3目标湿度、所有检测温度都在控制范围内。
4工作流程
4．1监控实验室温度、湿度：
实验室温度应在15℃～30℃之间；湿度应在45％～80％（但30℃以上应低于70％）。
温湿度计垂直挂在无阳光直射的地方；
4.1.1读取温度、湿度，并记录在WH5Y-5-PCR-405《实验室温度、湿度监控记录》中；
4.1.2如超出范围，此次记录用红色笔标记，并作相应处理；1小时后复查一次，如仍超出，暂停所有实验，报告上级采取相应纠正措施；
4.2监控冰箱温度：
冰箱冷冻室温度在15℃～－20℃、冷藏室温度在2℃～8℃等依具体贮存物品而定。
4.2.1确认温度计水平放置于冰箱中,否则应放置1小时后补测一次温度；
4.2.2读取即刻温度，并记录在WH5Y-5-PCR-406《控温设备温度监控记录》中；
4.2.3如超出范围，此次记录用红色笔标记，并作相应处理，1小时后复查一次，如仍超出，将冰箱中物品移至另一合格冰箱中，填写WH5Y-5-PCR-411《设备故障报修申请及维修记录表》申请维修并报告上级。
5引用表格和文件
5.1WH5Y-5-PCR-405《实验室温度、湿度监控记录》
5.2WH5Y-5-PCR-406《控温设备温度监控记录》
5.3WH5Y-5-PCR-411《设备故障报修申请及维修记录表》
清洁消毒程序
1目的确保临床基因扩增检验实验室各个工作区始终保持无核酸污染和其它生物污染，保持实验室清洁。
2范围临床基因扩增检验实验室各个工作区。
3职责
3.1责任人临床基因扩增检验实验室当班工作人员、保洁工人。
3.2时间工作结束时、实验材料出现外溅时立即进行。
3.3目标临床基因扩增检验实验室各个工作区始终保持无核酸污染和其它生物污染。
4工作流程
4.1当班工作人员完成如下清洁工作
4.1.1工作区工作结束后必须立即对该区进行清洁消毒。
带上乳胶手套，先用有效氯浓度为1500mg/L～2500mg/L的消毒液擦拭实验台面，再用75%酒精消毒液擦拭台面，再将移动紫外灯车的紫外灯调至实验台面上60cm，打开紫外灯定时照射至少30分钟；
4.1.2任何时候发生实验材料（原始血液样本、血清／血浆样本、提取中的样本与试剂的混合液等）的泄漏时立即带上乳胶手套，拿吸水纸吸干泄漏液体，将吸水后的纸按WH5Y-5-PCR-205《临床基因扩增检验实验室废弃物处理程序》处理；污染的地方用有效氯浓度为1500mg/L～2500mg/L的消毒液浸泡45分钟以上，并盖上纸片避免挥发，确保使传染物完全灭活，再用消毒液擦拭；将移动紫外灯车的紫外灯调至污染面上60cm，打开紫外灯进行照射至少30分钟。
在WH5Y-5-PCR-404《临床基因扩增检验实验室实验材料泄漏处理记录》中作相应记录。
4.2按①试剂准备区；②样本处理区③扩增分析区的顺序使用各工作区专用的工作服、工作帽、工作鞋、一次性手套及清洁工具清洁地面。
4.3有关实验器材周一消毒；工作服周四消毒洗涤；
4.4保洁工人每月例行清洁玻璃窗、墙面时应按4.2项进行。
5引用表格和文件
5.1WH5Y-5-PCR-205《临床基因扩增检验实验室废弃物处理程序》
5.2WH5Y-5-PCR-404《临床基因扩增检验实验室实验材料泄漏处理记录》
生物安全及防护程序
1目的确保临床基因扩增检验实验室及工作人员的安全。
2范围临床基因扩增检验实验室所有活动。
3职责
3.1责任人所有进入临床基因扩增检验实验室的人员。
4工作流程
4.1工作人员在任何时候应以安全和负责的方式开展工作。
非本室工作人员或未经实验室主任同意者，限制或禁止进入实验室；实验室入口处贴生物危险标志；
4.2进入各实验室前，必须穿专用实验服、鞋套。
试剂准备区着白色实验服、样本制备区着蓝色实验服、扩增分析区着红色实验服；
4.3操作过程中，应戴上手套；可能会出现危险物溅出时，应戴口罩和实验帽等；
4.4只能用机械装置移液，严禁用嘴吸移液管。
4.5防止实验室样品或试剂发生雾化或外溢污染。
所有的操作过程应尽量细心，避免产生和溅出气溶胶。
至少一天一次或在液体溅出时，都应进行台面消毒；
4.6所有污染物或重复使用的材料在丢弃或重复使用前必须按WH5Y-5-PCR-205《临床基因扩增检验实验室废弃物处理程序》进行处理；
4.7工作中发生内容物外溢或泄漏时，应对环境表面按WH5Y-5-PCR-203《临床基因扩增检验实验室清洁消毒程序》进行消毒处理。
所有突发事件或事故应立刻向上级报告,并按“应急预案”采取有效措施，防止再次发生类似事件；
4.8离开实验室时,所有实验人员要脱去专用实验服、手套、鞋套。
必须洗手；下班时应确认关好水、电、门、窗；
4.9所有生物污染废弃物在丢弃前，均应在室内使用可行的消毒方法进行预处理。
转移时应置于耐用、防漏容器内，与密封普通废弃物一道运出实验室由医院集中进行处理；
4.10当建立并进行PCR反应时，人员和物流应遵循单向走动的原则：
实验室工作人员按单一方向流动，即按“试剂准备区”—→“样本制备区”—→“扩增分析区”的方向单一流动，严格禁止反向进入各实验区。
即使是维护或服务人员，如果在一天内进入多区，也必须遵照此流动规则；
4.11各实验区的工作用品和清洁用具标明区域，不得混用；
4.12禁止在工作区域进行饮食、吸烟等非工作活动；工作区域冰箱内严禁存放非工作物品。
5引用表格和文件
5.1WH5Y-5-PCR-205《临床基因扩增检验实验室废弃物处理程序》
5.2WH5Y-5-PCR-203《临床基因扩增检验实验室清洁消毒程序》
废弃物处理程序
1.1目的确保临床基因扩增检验实验室的医疗废弃物对环境不产生污染。
实验室废弃物的安全处理是实验室工作的最重要方面之一,如果不能正确处理废弃物,实验室,其它医务人员或公众可能面临传染物的威胁并引起感染,因此任何时候执行严格的废弃物的处理规程对每个人都是有益的。
1.2范围临床基因扩增检验实验室所有的医疗废弃物。
1.3职责
1.4责任人当班工作人员、保洁工人。
1.5时间工作结束后。
2工作流程
2.1原始样本在2℃～8℃保存4周后废弃，由医院统一处理；
2.2检验过程中的样本、样本洗涤液、反应后离心的上清液等与样本接触的液体放入1500mg/L～2500mg/L的消毒液中，混匀反应45分钟以上，倒入下水道；
2.3与样本接触的固体物如移液器吸头、棉签、吸水纸等放入1500mg/L～2500mg/L的消毒液中冲洗混匀,确保固体物与消毒液完全接触，反应45分钟以上，固体物放放入垃圾袋内，液体排入下水道；
2.4扩增后的反应管严禁在实验室内打开，包于一次性手套中，放入黄色垃圾袋内；
2.5各室垃圾袋在下班前由保洁工人送出集中处理；
2.6除非确知不会发生化学反应，否则不得将化学物品进行混合。
人员培训程序
1目的旨在规范检验人员的技术要求和科内继续教育措施，确保其能力能胜任所担当的检验工作，提高学术水平。
2范围临床基因扩增实验室技术人员。
3职责
3.1技术人员每年应该至少接受一次新知识和新技能的培训，以新思维主导日常工作；
3.2在管理评审时制定人员培训年度计划，以确保从事检测工作的人、操作仪器的人、评价实验结果的人和审发检验报告的人的技术能力；
3.3对于新近分配的人员试用3个月、经考试合格后还必须经培训合格、持有省级以上卫生行政部门证书方能上岗；
3.4积极参与学术交流，至少实验室负责人至少每年1次参加省级学术会大会；
3.5能力监督评定办法
3.5.1工作量的增长率；纠纷、差错和事故的发生率；
3.5.2管理层对员工综合素质评分：
以年度计算、1年为周期；
3.5.3实验室负责人：
评定学术论文、科研成果数量和水平等；
3.5.4技术人员：
评定新技术和学术论文的数量和水平，参与科研的能力及日常工作和测试成绩，学术创新意识；
4工作流程人员培训程序工作流程见图。
人员培训程序工作流程图
数据保护程序
1目的保证数据（记录）的真实性、完整性和及时性。
2范围所有检测仪器产生的数据或检验结果以及相关的临床和技术参数。
3职责
3.1所有检测仪器产生的数据或检验结果确认后不能更改。
3.2检验科质量管理组数据以硬盘贮存检验结果及相关数据,实验室内以电子拷贝，技术质量主管负责保管。
3.3除非向临床检验中心汇报能力比对试验结果,检验数据不得在因特网发布.
3.5电子数据和记录的保存方法见“纸型记录和电子记录控制程序”。
试剂和实验用品购买、验收和储存程序
1目的规范试剂及实验用品采购管理工作，保证试剂和实验用品的供应，避免浪费。
2范围临床基因扩增检验实验室开展PCR临床检测项目的所有试剂盒及实验用品。
3职责负责该项工作的工作人员应及时清理实验室内的所有试剂和实验用品，定时作出采购申请，接收物品，进行验收，发出时做好登记，做到日清月结。
4工作流程
4.1申请：
每月下旬根据本室工作的需要，结合近期实验用品的消耗情况，作出采购申请，同时提供上月消耗量和库存量，经实验室负责人核准后，办理审批手续。
采购申请对品牌、性能、质量及时间提出具体要求。
4.2试剂盒包装质检
4.2.1外包装的质检：
检查外包装的生产厂家名称地址；试剂盒名称；规格；批准文号应与生产厂家提供的国家药品监督管理局的生产批文复印件上的记载一致；有产品批号；外包装封口完整无缺。
4.2.2内包装的质检：
查看试剂瓶是否漏液；试剂是否齐全;是否有使用说明书。
4.2.3以上4.2.1至4.2.2项如有缺陷部分,当日电话通知供货商补充完整。
如该批试剂使用前不能补充完整，判定此批试剂不合格。
填写临床基因扩增检验试剂实验用品退换货记录表后退、换货。
4.3.1将强阳性对照、临界阳性对照、阴性对照、质控物进行核酸提取与扩增检测。
荧光定量检测试剂盒除上述测试外还另加阳性工作标准品、稀释至最低检测限浓度的测试品进行扩增检测。
4.3.2分析Ct值：
蒸馏水和阴性对照应无典型的扩增曲线且Ct值＝30；阳性对照有典型的扩增曲线，强阳性对照的Ct值应≤21,临界阳性对照的Ct值应大于强阳性对照的Ct值，并且≤28.0。
4.3.3定量检测项目的阳性工作标准品的扩增曲线典型且Ct值都应＜28.0。
将阳性工作标准品的浓度（拷贝数）输入，仪器将自动以阳性参控品浓度的对数值为横坐标，以其实际测得的Ct值为纵坐标给出工作曲线，工作曲线的拟合度≤-0.980，斜率在－3.2至－3.6之间，截距≤35.0（当采用浓度单位copies/ml时，Ct≤45.0）。
4.3.4最低检测限浓度的测试品的Ct值应小于28。
4.3.5以上4.3.2至4.3.3项如有不符,填写临床基因扩增检验试剂实验用品退换货记录表后退换货；4.3.4项不符，及时与试剂生产商联系。
此试剂性能检测于日常工作中检测，如试剂不合格，同批标本结果暂缓发出。
4.4离心管、吸头验收：
4.4.1内外包装标识清楚无破损，离心管和吸头内无污渍、无破损。
4.4.2每批离心管取10支各加100μl水于沸水中加热10min,管盖应无曝开。
4.4.3每批吸头应抽查其滤芯的隔液效果：
调移液器吸液量比吸头容量多约5%至10%，吸水，滤心上应无
液体。
4.4.4每批任意抽取部分送供应室高压灭菌，应无破损及变形。
4.4.5上述4.4.1至4.4.4项如有不符，应退、换货。
4.4将以上验收情况记录在WH5Y-5-PCR-418《临床基因扩增检验实验室试剂及实验用品验收记录》中与试剂盒性能检测的数据一并存档。
4.5新购入试剂初次使用时,必须与原试剂平行检测样本,室内质控检测结果在允许区间中方可正式使用；否则启用《质量手册》中“内务管理”的“应急预案”。
4.7试剂物品储存应满足如下条件：
测定试剂盒应储存于－20℃冰箱内，其它试剂、物品应储存在阴凉干燥处。
5引用表格和文件
5.1WH5Y-5-PCR-418《临床基因扩增检验实验室试剂及耗材验收记录》
样本管理程序
1目的确保实验室在任何时候对样本的识别不发生混淆。
确保检验结果准确性与有效性。
2范围送检者送达的所有样本及对样本进行处理、贮存、安全处置全过程。
3职责
3.1责任人:
临床基因扩增检验实验室所有工作人员。
3.2工作流程
3.3样本的唯一性标识：
检验项目代码（2位）：
“BV”表示乙型肝炎病毒DNA；样本编号（2位）：
01～99；
实验室代码（1位）：
“P”表示临床基因扩增检验实验室；检验日期年份码（2位）：
00～99；检验日期月份码（2位）：
01～12；检验日期码（2位）：
01～31；以上字母及数字一次依序排列组合成11位代码即为该样本的唯一性标识。
3.4唯一性标识须字迹清晰明了，不得随意作任何涂改；必须时，在旧标识上划双线更改，更改后应保持旧标识可辩认。
若为分离的血清，请将唯一标识记录在相应的检验申请单上。
3.5样本采集、接收、运送、保存见相应的程序文件
3.6样本可能具有传染性，须严格遵守医院有关院内感染及医用垃圾的管理和处理规定，工作人员须注意保持并随时检查容器的完整和无样本外泄发生。
3.7检测前，工作人员须仔细核对标本与样本资料记录的一致性，准确无误时，方可进行处理；后续处理过程中发现样本不合格，应记录其状态并通知送检者重新送检。
3.8检测样本须随时置于实验室人员的监控下，样本必须是存放于实验室内冰箱中。
3.9废弃样本经确认后，保持容器完整，由检验科专门处理人员统一处理。
样本采集运送程序
1目的严格临床送检标本的采集、运送，保证样本的完整性和唯一性及时准确获得实验结果。
2范围全部临床基因扩增检验实验室检测样本。
3职责
责任人临床基因扩增检验实验室当班工作人员、门诊静脉采血室当班工作人员。
4工作流程
4.1样本的采集
4.1.1常用于基因扩增检测的临床样本包括血清、血浆、全血、骨髓、痰、脑脊液、尿及各种分泌物等。
全血和骨髓做抗凝处理时首选EDTA或枸橼酸钠，严禁使用肝素，因肝素是Taq酶的强抑制剂。
样本量不少于1.5ml。
4.1.2采集血液样本时，应使用一次性密闭容器（如无菌真空采血管）。
4.1.3当尿液、分泌物和骨髓等的采样必须打开一次性密闭容器盖时，要注意防止来自采样者的皮屑或分泌物的污染，采样时必须戴一次性手套；完成后立即加盖。
4.1.4玻璃器皿在使用前应高压处理，用250℃烘烤4小时以上，使器皿上的RNA酶被灭活。
4.2样本的运送
4.2.1用于DNA测定的被检者静脉血置密封的无菌无抗凝剂离心管中，于室温放置不超过4小时。
4.2.2采集有分泌物的棉拭子：
密封保存于25℃不超过24小时。
4.2.3痰液密封保存于25℃不超过24小时；加液化液后立即用生理盐水洗涤。
样本接收程序
1目的确保临床基因扩增检验实验室样本的正确接收。
2范围送检者送达的所有样本。
3职责
3.1责任人临床基因扩增检验实验室当班工作人员、门诊静脉采血室当班工作人员。
3.2完成时间送达当时完成。
4工作流程
4.1工作人员要热情接待送检者,并请其稍等。
4.2检查检验申请单上项目应填写全面而清楚,。
4.3检查盛样本所用容器应恰当。
4.4检查容器内样本及容器外标签上姓名、性别、科室等资料应与申请单一致。
4.5检查样本量应能适应检验项目的需要。
分泌物样本采样质检:
采用肉眼观察采样量或显微镜下观察所需类型细胞的组成及数量。
4.6检查使用抗凝剂的样本容器内应无凝块。
4.7样本在下列情况下视为不合格：
使用容器不当；容器有破损；样本外泄污染；样本严重溶血。
工作人员应拒收该样本。
4.8如4.2-4.6项符合要求或有缺点但当时已补救,记录合格或补充合格后接收该样本。
4.9如4.2-4.6项不符合要求且当时无法补救,记录缺点后退回该样本。
4.10如4.2-4.6项不符合要求且当时无法补救,但样本难以再次获得且有部分项目不受影响，记录缺点后接收该样本。
4.11如实填写WH5Y-5-PCR-411《临床基因扩增检验实验室样本接收、拒收与报告单发送记录》上，送检接收双方核对无误签名后，送检者方可离去。
急诊样本加签送检时间。
4.12临床基因扩增检验实验室当班工作人员按WH5Y-5-PCR-209《临床基因扩增检验实验室样本管理程序》在样本容器外壁及申请单上标出相同的唯一编号识别码。
5引用表格和文件
5.1WH5Y-5-PCR-411《临床基因扩增检验实验室样本接收、拒收与报告单发送记录》
5.2WH5Y-5-PCR-209《临床基因扩增检验实验室样本管理程序》
样本的保存和安全处置程序
1目的为保持标本的稳定状态，防止因外界条件改变对标本产生影响，保证检验结果的准确性。
2范围基因扩增检验实验室接收的标本。
3职责工作人员负责标本的贮存，保证标本状态的稳定。
4程序
4.1工作人员核对接收的标本，按检测项目将送检标本分类
4.1.1将样品
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