第十五章 人类疾病动物模型复制汇编.docx

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第十五章人类疾病动物模型复制汇编

第十五章人类疾病动物模型复制

第一节概述

由于人类疾病的复杂性，医学研究中必须对疾病过程进行各种观察、分析和实验。

这些工作大多不可能在人体上进行，必须借助于适当的动物及其器官、组织和细胞进行研究。

供医学研究用的这些动物具有与所研究的人类疾病相似的特点，故称之为人类疾病动物模型（animalmodelsofhumandiseases）。

人类疾病动物模型通常可以通过人工诱发，或选择具有相应特点的自然动物而获得。

人类疾病动物模型通常依照研究目的而设计，不同的研究选用的动物模型可有很大差别，所以人类疾病动物模型很多，也很复杂。

许多人类疾病的动物模型可以自然获得，即利用动物自发性的遗传特性或通过育种手段培育遗传特性建立而成，如裸鼠、肥胖症小鼠、自发性高血压鼠、自发性高胆固醇血症鼠等。

更多的人类疾病实验动物模型是用人工方法，将致病因素作用于动物，诱发动物特定器官、组织、细胞或全身的损害，造成与所研究的人类疾病相似的机能、代谢和形态学的改变。

可用于诱发疾病模型的方法和因素很多，包括物理因素、化学因素、微生物因素以及基因工程技术等。

近年随着生物技术的发展，越来越多地应用生物工程技术方法制作动物模型，包括利用动物卵或胚胎移植、胚胎嵌合、细胞核移植、转基因或基因敲除和克隆等技术制作人类疾病的动物模型。

复制的人类疾病动物模型是否能真正地、客观地反映人类疾病是能否作为研究对象而用于医学研究的关键。

但动物与人类之间存在着很大的差异，任何一种人类疾病的动物模型不可能与人类疾病完全相同，而且影响因素很多，所以在选择和设计动物模型时要尽可能力求全面周密，在分析实验结果时要充分考虑动物模型的局限性。

复制人类疾病动物模型有三点最基本的要求：

一是复制模型选用的动物应尽可能接近人类，建立的模型必须尽可能地与所研究的人类疾病有相同的或相近的机能、代谢和形态学变化特点，病变发生机理应尽量与相应的人类疾病相同；二是选用的方法要保证疾病动物模型复制有较高的成功率，具有较好的可重复性和一定的稳定性，以供他人应用和验证；三是复制成功的动物模型应有明确而可靠的测量或观察的指标，以供判断病变的轻重程度和病程的缓急。

应该强调指出的是，动物模型的设计和选择都要适合于研究的目的，即便研究同一疾病，但因研究的发病环节不同也不可套用同一动物模型。

本章节选择性的介绍几种严重威胁人类生命的疾病和综合征的动物模型复制方法，供学生在探索性实验阶段参考。

第二节动脉粥样硬化模型

动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）性疾病是目前危害人类健康的“头号杀手”，动脉粥样硬化斑块的形成最常见于大、中动脉。

动脉粥样硬化斑块的发生发展过程大致如下：

由于血浆脂质水平的升高或同时有其他危险因子的存在，使动脉内皮发生了某种损伤性变化，使血浆脂质易于通过动脉内膜进入内膜下间隙并沉积。

同时血流中的单核细胞易与内皮细胞发生粘附，并通过内皮细胞间隙跨过内皮进入内皮下，摄取大量脂质而转化成泡沫细胞，形成脂质条纹，随后血管平滑肌细胞向内膜方向迁移，并摄入脂质和合成大量细胞间质，导致动脉粥样硬化斑块形成。

AS研究领域中经常使用动物模型作为实验对象，获得大量实验结果，大大促进了人们对AS的认识。

本节主要介绍实验性动脉粥样硬化动物模型和泡沫细胞模型的复制方法。

一、动脉粥样硬化动物模型的复制

（一）家兔

家兔是复制动脉粥样硬化模型最常用的动物，它对外源性胆固醇的吸收率高，可达75～95%，静脉注入胆固醇后高脂血症可持续3～4天。

只要给兔含胆固醇较高的饲料，不必附加其它因素，经3～4月即可形成明显的动脉粥样硬化病变，而且与人体发生的病变相似，取血检查也较方便。

通常选用体重2kg左右的新西兰白兔或日本大耳白兔，每天喂服基础饲料加胆固醇0.3g，4个月后肉眼可见主动脉粥样硬化病变；若每天胆固醇剂量增至0.5g，3个月后可出现病变；若增至每天1g，可缩为2个月。

在基础饲料中加入15%蛋黄粉、0.5%胆固醇和5%猪油，经3周后，将饲料中胆固醇减去，再喂3周，可使主动脉病变发生率达100%，血清胆固醇可增高至2000mg%。

促进病变形成的方法：

1．在高脂饲料中还可加入甲基硫氧嘧啶、丙基硫氧嘧啶、甲亢平、苯丙胺、维生素D、烟碱或蔗糖等；

2．预先用Fogarty球囊导管插入主动脉，造成内皮细胞剥脱的浅表损伤，再喂高脂饲料；

3．静脉滴注去甲肾上腺素引起血管壁中层弹性纤维拉长、劈裂或断裂；

4．皮下注射同型半胱氨酸硫代内脂（dl-homocysteinethiolactone）可明显促进动脉粥样硬化病变。

（二）其他动物

除田鼠和地鼠外，一般温血动物只要用适当的方法，都能形成动脉粥样硬化的斑块病变。

已经用于复制动脉粥样硬化模型的动物除兔以外，还有鸡、鸽、猴、猪等。

具体选取哪种动物来复制模型，需要根据实验目的及观察指标、实验时间等。

（三）动脉粥样硬化动物模型的鉴定

处死动物，选取观测的动脉，剪开剖面，用苏丹Ⅳ或者油红O染色，使病变面积呈现红色，用计算机图像处理系统或求积仪计算病变面积百分比。

根据病变面积百分比进行病变分级，判断粥样硬化病变的程度。

按病变面积百分比分级标准见表15-1。

表15-1按病变面积百分比分级标准

分级病变面积（%）

Ⅰ<5

Ⅱ6-15

Ⅲ16-33

Ⅳ34-50

Ⅴ>50

二、泡沫细胞模型的复制

巨噬细胞和增殖移行的中膜平滑肌细胞表面存在有清道夫受体（scavengerreceptor），能无反馈地摄取大量修饰变性的低密度脂蛋白（LDL），特别是氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL），使细胞内充满大量脂滴，呈泡沫状，称为泡沫细胞。

泡沫细胞是动脉粥样硬化病变重要的特征性细胞，所以常用Ox-LDL与巨噬细胞或血管平滑细胞共孵育，形成泡沫细胞，作为动脉粥样硬化研究的实验模型。

（一）LDL的制备和氧化修饰

1．LDL的制备：

见有关专业书籍。

2．Ox-LDL的制备（LDL的氧化修饰）：

在氧化前，LDL先用无EDTA的PBS液透析24小时，以除去EDTA；再将LDL在含10μmol/LCuSO4的PBS中，于37℃氧化12小时；然后于4℃，在含100mg/LEDTA的PBS中透析，每8小时换液一次，透析24小时；最后过滤除菌，4℃保存。

（二）巨噬细胞的培养

细胞培养是把从人体或动物体上取得的组织用机械或消化的方法分散成单个的细胞悬液，然后在模拟体内生理环境等特定的体外条件下，进行孵育培养，使之生存并生长。

泡沫细胞模型的细胞来源于单核巨噬细胞或血管壁平滑肌细胞。

通常多用小鼠腹腔巨噬细胞与OxLDL共孵育以培养泡沫细胞。

步骤如下：

选取8周龄、无感染的小鼠，眼球放血或颈椎脱位致死；用70%酒精消毒腹部皮肤，在无菌条件下，用镊子提起腹部皮肤剪去约3～5厘米长的皮肤，暴露去皮的腹壁；再用注射器将3～4ml无血清的1640培养液注入腹腔，轻揉片刻后抽出腹腔液；将其注入离心管，于4℃，1000rpm/min离心10分钟，去上清液，加同样培养液调整细胞数为1～5×106/ml。

若需要的细胞数多，可将数只小鼠的细胞收集在一起。

而豚鼠、家兔腹腔巨噬细胞的取得，需在数日前于腹腔注射石蜡油诱发巨噬细胞在腹腔聚集。

由于巨噬细胞有很强黏附能力，要分离它最常用的方法是贴壁法，即将含有巨噬细胞的悬液加到盖玻片上、培养瓶或培养板内，于37℃培养30～60分钟，巨噬细胞开始贴壁，此时用Hanks液冲洗5次，以洗去未贴壁的其他细胞，最后得到较纯的巨噬细胞，加含10%小牛血清的1640培养液，置37℃培养箱。

由于巨噬细胞是终末细胞，故不能长期传代培养。

血管平滑肌细胞的培养可参阅有关书籍。

培养的腹腔巨噬细胞或血管平滑肌细胞传至3～5代，培养瓶换培养液后，加入已制备好的Ox-LDL，培养48～72小时，观察细胞形态的改变及测定细胞内胆固醇的含量。

（三）细胞形态学的观察

将贴壁于盖玻片的细胞取出，以PBS液冲洗3次，于10%甲醛中固定24小时，用油红O方法染色。

在倒置显微镜下观察，并以10×100倍彩色照相。

（四）细胞内胆固醇（Ch）和胆固醇酯（ChE）的测定

用0.25%胰酶消化1min，收集细胞，以1000rpm/min离心10min，弃去上清液，用PBS液冲洗一次，加入异丙醇0.5ml，在超声波清洗器上震动10s/min×3次，再以1000rpm/min离心15min。

吸取上清液用TC试剂药盒及FC试剂药盒分别测定其总胆固醇（TC）和游离胆固醇（FC），并将其离心沉淀物用0.1mol/LNaOH0.5ml裂解细胞，用Lowry法测定细胞蛋白含量。

细胞内的胆固醇含量以TC/g细胞蛋白和FC/g细胞蛋白表示，两者之差即为ChE/g细胞蛋白含量。

（杨永宗）

第三节糖尿病动物模型

糖尿病（diabetesmellitus）是一种古老的疾病，关于糖尿病的记载，最先见于文明古国中国、印度、埃及等国家，约有一千余年至数千年的历史。

近年来糖尿病（diabetesmellitus）的研究进展迅速，虽然许多新的发现和成就充实了对本病的认识，但病因及发病机理方面仍未完全阐明。

糖尿病以持续高血糖为基本生化特征，其病因目前尚无定论。

糖尿病不是单一原因与发病机制引起的疾病，而是由不同原因引起的体内胰岛素缺乏或胰岛素效应降低，临床以糖代谢紊乱为主的一组代谢性疾病的总称。

按WHO1985年的分型标准，它分为：

胰岛素依赖型（IDDM，Ⅰ型）、胰岛素非依赖型（NIDDM，Ⅱ型）、营养不良性糖尿病（Ⅲ型）和其它类型。

IDDM患者的基础及葡萄糖负荷后胰岛素分泌均呈现低水平状态，反映了胰岛素的完全缺如或严重缺乏。

NIDDM患者胰岛素分泌功能障碍较轻，表现在第一时相缺如及分泌高峰后移，该类患者基础胰岛素分泌常增高或正常，而胰岛对葡萄糖刺激的反应减弱，在葡萄糖负荷后胰岛素分泌水平较相应体重为低。

一般认为IDDM和NIDDM的发病与自身免疫、遗传、病毒感染、胰岛素抵抗等有关，继发性糖尿病的病因多数较清楚。

在这些因素的作用下，发生了胰岛素的缺乏和作用减低，从而引起体内代谢紊乱，导致血糖升高。

对糖尿病研究的重要方法之一是复制糖尿病动物模型，目前能够用来复制糖尿病模型的动物有地鼠（Carpenter,1970）、大鼠（Maner,1972）、小鼠（Butler,1972）、豚鼠（Munger,1973）、狗（Kramer,1980）、猫（Johnaon,1973）、兔（Roth,1980）、猪（Lang,1977）和灵长类（Howard,1980）。

复制糖尿病动物模型有多种，按产生原因分为：

（1）自发性动物模型（spontaneousanimalmodel），指实验动物在自然条件下自然产生的、或由于基因突变而出现的类似人类疾病的动物疾病；

（2）诱发性动物模型（experimentalartificialorinducedanimalmodel），指通过物理、化学、生物等致病手段，人为造成动物组织、器官或全身形成类似人类的疾病，动物在功能、代谢、形态结构等方面有相应的改变。

一、动物模自发性型

（一）小鼠

KK糖尿病小鼠是1941年K.Kondo用日本商人的kasukabe小鼠原种群培育而成的，属先天性遗传缺陷小鼠。

该动物对胰岛素不敏感、对葡萄糖耐性小、糖尿病发病率高、老年动物偶见肥胖。

（二）大鼠

BBWistar大鼠是一种典型自发遗传IDDM型糖尿病动物模型，85日龄出现症状，发病率为50％～70％，临床表现为多饮、多食、糖尿病、高血压、酮症，病鼠胰岛内β-细胞大量破坏，病理学改变为胰岛炎，伴有外周神经系统严重病变、睾丸萎缩、甲状腺炎、胃溃疡、恶性淋巴瘤等。

该型与人类发病年龄较早的少年型糖尿病极为相似。

NIH肥胖大鼠品系（SHR/N-cp）是新培育的一种用于肥胖症和糖尿病研究的遗传动物模型。

其特征主要是脂肪聚集层，脂肪细胞体积和数量增加并有损伤发热作用。

雄性肥胖大鼠有轻度高血压，当饲喂高糖饮食时，表现出与人NIDDM型糖尿病相似的代谢改变，包括胰岛素分泌过多、高血脂，不耐葡萄糖和糖尿病。

（三）地鼠

中国地鼠（黑线仓鼠）有50％自发性产生糖尿病，属多基因遗传，病鼠耐糖曲线似人类NIDDM糖尿病。

（四）新西兰白兔

美国退伍军人管理局医疗中心于1969年发现一只6～12月龄的雌性新西兰白兔有烦渴和多尿现象，血糖和尿糖均明显增高，确诊为糖尿病。

经连续几代近亲繁殖，遂形成具有自发性糖尿病的一个品系。

其中19％为显著高血糖及糖尿的显性糖尿病兔，另外27％的兔空腹血糖正常但处理静脉注射葡萄糖能力异常。

这两种兔的其他一些特征包括烦渴、多尿、贪食、胰岛素释放严重受损及胰岛β细胞颗粒增多。

这些兔不肥胖，且有轻度酮症酸中毒。

病理学发现，糖尿病兔的特殊损害局限在胰岛β细胞及肾脏。

本动物模型与人类的IDDM或青少年中成年发作型糖尿病极为相似。

二、诱发性动物模型

诱发性糖尿病动物模型的复制方法有多种，包括手术、化学物质损伤、微生物感染、营养源性诱导等等。

（一）手术

自从德国的VonMening将犬作胰腺全切除术造成糖尿病后，陆续报道猫、大鼠、兔、猪、猴等切除80％～90％胰腺并受到高糖饮食刺激后，出现β细胞退变衰竭而引起永久性糖尿病。

（二）化学物质损伤

用化学物质损伤来复制糖尿病动物模型，可用的方法有：

1．注射致高血糖因子；

2．注射链脲佐菌素（streptozocin，STZ）；

3．注射环丙庚哌；

4．注射四氧嘧啶（alloxan）破坏胰岛β细胞，造成胰性糖尿病；

5．注射根皮苷。

一般以后两种方法最常用。

（1）

（1）   四氧嘧啶

①复制机理

用适量的四氧嘧啶注入动物体内，可选择性地损害胰岛的β细胞，使β细胞制造胰岛素的功能发生障碍而导致血糖过高和糖尿病。

这是由于四氧嘧啶化学性质极不稳定，易与巯基（主要是半胱氨酸）发生反应，而胰岛的β细胞中巯基含量较其他组织为多，故四氧嘧啶只选择性地损害胰岛的β细胞。

四氧嘧啶复制的糖尿病动物模型是目前研究人类糖尿病较好的方法，主要优点有：

（a）实验性糖尿病近似人类糖尿病；（b）体内代谢障碍时有可能产生此种衍生物；（c）胰岛外分泌部分不受损伤；（d）几乎所有常用实验动物都可用来进行实验研究；（e）胰岛的β细胞不是功能消失，而是功能不同程度的降低，有利于研究胰岛组织再生和功能恢复；（f）动物不必注射胰岛素可存活很久。

②复制方法

大白鼠实验前四天，给大白鼠腹腔内注射新鲜配制的四氧嘧啶（2.5％或5％生理盐水溶液），剂量为12mg/100g体重。

注射后血糖呈几个时相的变化，在注射第四、五天后即可造成持续高血糖。

实验中每天注意给动物充分供应饮水，以便获得较多尿量，用以测定尿中糖含量。

如在冬季，大白鼠饮水少，则可由食管插管按5ml/100g体重喂水。

家兔取体重1.5kg以上健康家兔，先测定正常血糖量，并检查尿内有无糖后，静脉注射四氧嘧啶溶液150～200mg/kg体重，然后有计划地观察血糖、尿糖、体重和食欲情况的变化。

有的家兔在注射后10～15天排除中毒现象后，即可正式进行四氧嘧啶性糖尿病的实验观察。

家犬实验前二周，静脉注入新鲜配制的四氧嘧啶溶液（1～3％），剂量为50～60mg/kg体重。

在注射后24～48小时，即可出现持久性的高血糖和糖尿。

注意事项：

四氧嘧啶模型与人的糖尿病类似，但注射药物后，血糖值迅速下降，继而又很快上升且有几次起伏，几天后方形成持久性高血糖。

另外，注射四氧嘧啶后，有时可在24小时以内死于低血糖昏迷，可用50％葡萄糖水溶液喂动物抢救。

（2）

（2）   根皮苷

①复制机理

根皮苷是一种配糖体，系由苹果树的根皮抽提而得。

其所以引起糖尿病，是因为根皮苷能使肾小管对糖的再吸收发生障碍（排糖阈降低）。

根皮苷可能有破坏酯酶的作用，致使葡萄糖磷酸化过程和脱磷酸过程障碍，引起糖尿病。

②复制方法

使用的动物为健康家兔，首先测定正常血糖含量和尿糖定性，在确定血糖含量处于正常范围内和尿内无糖时，以0.5％根皮苷按15ml/kg体重的剂量作皮下注射，同时收集24小时尿液，然后测定血糖含量和尿糖定性。

为了增加尿量，可多饲以白菜。

注意事项：

根皮苷溶液要新鲜配制，配时取0.5g根皮苷溶于100ml的1％NaHCO3溶液中。

（3）链脲佐菌素

一次性腹腔注射或静脉注射30mg/kg～100mg/kg，几天后使狗、大鼠等动物产生永久性高血糖，但链脲佐菌素（streptozocin，STZ）造成糖尿病的同时，还可造成白内障、冠状动脉粥样硬化斑块。

（4）环丙庚烷（cyproheptadine）

给大鼠连续给药4周后，可见高血糖症状，并出现胰岛素β细胞的分泌颗粒逐渐消失。

胰岛素分泌在安静时呈正常值，当补充葡萄糖过量时，则不能引起胰岛素的补充分泌，这与人类糖尿病患者动态极为相似，停药一周后，病态可自动恢复，该模型比上述模型更接近于人体发病形式。

（三）微生物感染

脑炎心肌炎（EMC）病毒的M型变异株可在若干品系的成年小鼠中诱发糖尿病。

在DBA/2品系小鼠中发病率大于70％，而在CD-1小鼠中约为40％，在C3H、C57BL、BALB/CJ与A/J小鼠中发病率少于10％。

雌雄均能感染EMC病毒，雄性的发病率明显大于雌性。

皮下接种病毒4～7天后可出现明显的高血糖，伴有血中及胰腺组织中胰岛素含量降低。

高血糖通常为短暂性，但许多小鼠在恢复期仍显示糖耐量异常。

EMC病毒感染小鼠后出现的疾病在生化方面与人类青少年发病的IDDM糖尿病极为相似。

（四）营养源性

用含10％氧化的长颔竹刀鱼油的饲料喂养鲤鱼60天，即能诱发鲤鱼营养源性糖尿病。

本病的临床特征包括高血糖、糖尿、糖耐量降低与偶有酮尿。

组织学研究表明其胰岛、肾小球等部位的损害与人类糖尿病中所见者极相似。

该疾病模型与人类青少年发病的IDDM糖尿病极为相似。

最近有报道，用含10％猪油、37％蔗糖的饲料喂养新西兰白兔也能诱发糖尿病，但该模型尚在研究中。

（五）转基因糖尿病动物模型

虽然转基因动物这一生命科学研究的新体系引入到糖尿病的研究领域时间并不长，但已取得了惊人的成果。

转基因动物模型在糖尿病研究中的运用仍然方兴未艾。

1998年，Allison等在《Nature》上报道，第一类组织相容性抗原复合物（MHC-1）基因（H-2Kb），该基因是大鼠的胰岛素启动子，在小鼠的胰腺β细胞中高表达，复制成转基因小鼠。

这种动物模型的胰岛素分泌降低，与人类的IDDM糖尿病相似。

利用转基因的方法建立人类疾病动物模型和用其他方法相比具有许多优点。

诸如遗传背景清楚，遗传物质改变简单，建立的模型更自然和更接近病人症状；建立过程操作简单，周期短，而且建立的转基因动物模型不需要特殊的饲养条件即可保持疾病症状，按照孟德尔规律代代相传，维持费相对较低等等。

但是由于转基因方法和技术上的原因，目前转基因糖尿病动物模型尚处于研究阶段，相信随着转基因技术的不断完善，人类疾病的转基因动物模型会不断涌现。

（袁中华）

第四节心、脑缺血-再灌注损伤动物模型

心、脑血管缺血性疾病是严重威胁人类健康的一大类疾病，椐统计，我国每年新发生的脑卒中有150万人，每年死于心血管疾病的在200万人以上，恢复缺血组织的血液灌注是治疗的目的，但在某些情况下，再灌注会加剧组织的损伤，其发病机制至今尚未阐明。

因此，研究心、脑缺血-再灌注损伤的发病机制及其防治，具有重要的理论价值和实践意义。

一、在体心脏缺血-再灌注损伤模型

（一）实验目的

复制心脏缺血-再灌注损伤动物模型，观察再灌注过程中心功能的变化及再灌注性心律失常表现。

为研究心脏缺血-再灌注损伤的机制及其防治打下基础。

（二）实验动物

雄性健康大白鼠，体重200~300克。

（三）药品、器材

多功能生物信息采集仪或二道生理记录仪，小动物人工呼吸机，小动物常规手术器械，左心室导管，直径3mm、长2cm的充气硅胶管，小拉钩。

小圆针，5/0号线。

（四）观察指标

1．心电图

2．心功能检测指标：

左室内压（LVP），左室内压变化最大速率（±dp/dtmax），左室舒张末期压（LVEDP）

（五）实验步骤

1．动物称重后，腹腔内注射12%水合氯醛40mg/100g体重麻醉动物，并将其仰卧固定

于手术台上。

2．作颈部正中切口，分离气管并插入气管插管，分离右颈总动脉，结扎远心端，近心端用动脉夹夹闭，在靠近结扎线处剪口，插入左心室导管，用线轻扎固定后松开动脉夹，然后将导管缓慢插入左心室，双重结扎固定，并连接多功能生物信息采集仪或生理记录仪用于测定心功能，连接标准肢体Ⅱ导联记录心电图。

3．胸骨左侧旁约0.5cm处、第3~5肋间作切口开胸，立即行呼气末正压呼吸（吸室内空气，通气量为2ml/100g体重，呼吸频率50~60次/min），剪开心包膜暴露心脏，以左冠状动脉为标志，在左心耳根部下方2mm处用穿好5/0号线的无创小圆针穿过左冠状动脉下方的心肌表层，在肺动脉圆椎旁出针，将心脏放回原处。

4．待心电图稳定10分钟后记录心电图、LVEDP及±dp/dtmax。

5．静脉注入肝素100~200U,在左冠状动脉穿线上方放置硅胶管并结扎动脉，使之压迫血管造成血管闭塞和左室壁缺血5~10分钟，每隔2分钟记录心电图及心功能指标，然后剪开结扎线，移去硅胶管，恢复血液灌流，继续观察30~60分钟。

6．记录解除结扎即刻及随后动态的心电图和心功能指标变化。

二、离体心脏缺血-再灌注损伤模型

（一）实验目的

学习Lagendorff离体心脏灌流技术，复制离体心脏缺血-再灌注损伤模型，观察再灌

过程中心脏功能、代谢及心电图的变化。

为研究心脏缺血-再灌注损伤的机制及其防治打下基础。

（二）实验动物

健康雄性大鼠，体重200~300克。

（三）药品、器材

Lagendorff离体心脏灌流装置，超级恒温水浴，恒温水浴器，氧气袋，O2、CO2、N2钢瓶，721分光光度计，多功能生物信息采集仪，天平，小动物手术器一套，Krebs-Henseleit缓冲液（K-H液），水合氯醛，肝素，玻璃插管等。

（四）观察指标

1．冠脉流出量（ml/min/g组织湿重）；

2．乳酸脱氢酶（LDH）含量；

3．心电图；

4．心功能：

±dp/dtmax,LVP，LVEDP。

（五）方法、步骤

1．Lagendorff离体心脏灌流模型的制备

（1）物称重后用12%水合氯醛40mg/100g体重（或氯氨酮8~10mg/100g体重）腹腔注射麻醉，仰卧位固定于手术台上，经尾静脉或股静脉注入肝素钠100~150U/100g体重，注射完毕后2分钟开始手术。

（2）肋骨下缘横向剪开腹前壁，再纵向剪开两胸侧壁和横膈前缘，将胸壁向头端翻起分离出心脏后以左手姆指和食指轻轻提起，暴露出各大血管，在距主动脉起始部4~5mm处，用眼科剪将肺与心脏一同剪下，置于预冷的0оC~4оC的K-H液中。

（3）立即行主动脉插管、固定，并迅速经插管（可用注射器与之相连）注入K-H液，冲洗出冠脉血管内的残留血液，然后将主动脉插管与Lagendorff灌流装置相连，让心脏悬挂于灌流装置上,灌流约30秒。

（4）肺动脉圆锥处剪一小口，用线结扎肺门根部血管，剪去肺及纵隔组织。

（5）左心房插管与前负荷瓶相连，荷包缝合固定；调整左室前负荷为15cmH2O（147Pa）,待心跳规则后，即改为从左心房导管灌入K-H液，液体经左室收缩泵入主动脉，部分液体进入冠脉，流至右房，经右心室从肺动脉圆锥流出，收集在烧杯中，用来测定冠脉流出量及乳酸脱氢酶含量，左室后负荷为60~75mmHg（8~10kPa）。

持续向K-H液中通以（95%O2+5%CO2）混合气体。

灌注压为7.9kPa,灌注速度为10ml/min。

心脏