抗狂犬病病毒中和抗体效价快速荧光灶抑制试验RFFIT的建概要.docx

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抗狂犬病病毒中和抗体效价快速荧光灶抑制试验RFFIT的建概要

20世纪60年代初,WHO开始推荐使用小鼠脑内中和法（Mouseneutralizationtest,MNT测定抗狂犬病病毒中和抗体。

但自80年代中期开始,发现MNT法实验时间较长（至少需14d,受动物质量、攻击病毒的滴度、实验人员的操作技术和经验等多种因素的影响,重复性、一致性和灵敏性均较差,而

且需要使用大量动物,不符合国际上动物实验3R的原则[1]。

为此,WHO在许多国家实验的基础上,推荐快速、精确和重复性好的体外检测抗狂犬病病毒中和抗体的方法,即快速荧光灶抑制试验（Rapidflu-orescencefocusinhibitiontest,RFFIT和荧光抗体病毒中和试验（Fluorescentantibodyvirusneutralization

test,FAVNT[2,3]

。

本文对RFFIT法与MNT法的相关

性进行了分析,现将结果报道如下。

作者单位:

1中国药品生物制品检定所病毒一室（北京

100050;2InstitutPasteur,Paris,France.

通讯作者:

董关木,E-mail:

gmdong@

中国图书分类号R392Q33文献标识码A文章编号1004-5503（200911-1145-04

【实验技术】

抗狂犬病病毒中和抗体效价快速荧光灶抑制试验（RFFIT的建立及应用

吴小红1李加1唐建蓉1HervéBourhy2刘景华1曲效民1曹守春1董关木1

【摘要】目的

建立抗狂犬病病毒中和抗体效价的快速荧光灶抑制试验（RFFIT,验证其与小鼠脑内中和法（MNT的相

关性,并用于马抗狂犬病病毒血清（ERIG和人狂犬病免疫球蛋白（HRIG及狂犬病疫苗免疫后血清中和抗体效价的测定。

方法待测血清或免疫球蛋白在96孔板中作3倍系列稀释,与能感染80%~95%细胞量的攻击病毒混合后,37℃体外中和1h,接种BSR细胞,

培养24h后荧光染色,荧光显微镜下读取结果。

用建立的RFFIT法与MNT法同时标定狂犬病免疫球蛋白国家标准品,并检测ERIG和HRIG以及疫苗免疫后血清样品的抗狂犬病病毒中和抗体效价,以比较两种方法的精密度和相关性。

结果采用MNT法和RFFIT法检测我国抗狂犬病免疫球蛋白国家标准品的GMT分别为21.4和23.8IU/ml,两种方法的变异系数分别为62.3%和13.3%;两个实验室用RFFIT法测定我国国家标准品的结果分别为21.71和23.81IU/ml。

两种方法测定ERIG和HRIG及疫苗免疫后血清中和抗体效价的结果差异无统计学意义,相关系数为0.976,两种方法的检测结果之间呈良好的正相关性。

结论RFFIT法可替代MNT法检测抗狂犬病病毒中和抗体效价。

【关键词】狂犬病;中和抗体;快速荧光灶抑制试验;小鼠脑内中和法

DevelopmentandApplicationofRapidFluorescenceFocusInhibitionTest

（RFFITforDeterminationofPotencyofNeutralizingAntibodyagainstRabies

WUXiao-hong△,LIJia,TANGJian-rong,etal（△NationalInstitutefortheControlofPharmaceuticalandBiologi-calProducts,Beijing100050,China

【Abstract】ObjectiveTodeveloparapidfluorescencefocusinhibitiontest（RFFITfordeterminationofpotencyofneutrali-zingantibodyagainstrabiesandinvestigateitscorrelationtomouseneutralizationtest（MNT

aswellasitsapplicationtodeterminationofserumneutralizingantibodypotenciesinequinerabiesimmunoglobulin（ERIG,humanrabiesimmunoglobulin（HRIGandhumanseraimmunizedwithrabiesvaccine.Methods

Theseraorimmunoglobulintobetestedwerediluted3-foldseriallyona96-well

microplate,mixedwithaconstantdosageofchallengeviruscausinginfectionof80%~95%ofcellsandincubatedat37℃for1hforinvitroneutralization,theninoculatedwithBSRcells,incubatedfor24handsubjectedtofluorescencestaining.Theresultwasob-servedbyfluorescentmicroscopy.NationalstandardsforrabiesimmunoglobulinweresimultaneouslycalibratedbythedevelopedRF-FITandMNT,andtheneutralizingantibodypotenciesinERIG,HRIGandhumanseraimmunizedwithrabiesvaccineweredeter-minedbythetwomethodsseparately,toevaluatetheirprecisionsandcorrelation.ResultsTheGMTsofnationalstandardsforrabiesimmunoglobulindeterminedbyMNTanddevelopedRFFITwere21.4and23.8IU/ml,withCVvaluesof62.3%and13.3%,whilethosebyRFFITbytwolaboratorieswere21.71and23.81IU/ml,respectively.Thedeterminationresultsofneutralizinganti-bodypotenciesinERIG,HRIGandhumanseraimmunizedwithrabiesvaccinebythetwomethodsshowednosignificantdifference,withacorrelationcoefficientof0.976,indicatingagoodpositivecorrelation.ConclusionThedevelopedRFFITmaybeusedforde-terminationofpotencyofneutralizingantibodyagainstrabiesinsteadofMNT.

【Keywords】Rabies;Neutralizingantibody;Rapidfluorescencefocusinhibitiontest（RFFIT;Mouseneutralizationtest（MNT

1.材料与方法

1.1病毒及细胞

BSR细胞和狂犬病病毒CVSIP10均来源于巴斯德研究所。

BSR细胞用含10%小牛血清的DMEM培养基培养,按1∶3比例传代扩增;狂犬病病毒CVSIP10由中国药品生物制品检定所病毒一室在BSR细胞中适应传代和扩增,并建立三级种子批,取工作种子CVS-9用于RFFIT检测。

1.2主要试剂

国家第4批抗狂犬病病毒抗体标准品由中国药品生物制品检定所以WHO第3批抗狂犬病血清标准品标定效价;FITC标记的小鼠抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体购自Chemicom公司（批号:

0605030729。

1.3待检血清及人抗狂犬病免疫球蛋白

接种人用狂犬病纯化疫苗（ChironVaccinesGmbHCo.,Germany生产前后的人血清由上海诺华贸易有限公司提供;马抗狂犬病病毒血清（ERIG及人狂犬病免疫球蛋白（HRIG为国内不同企业注册检验送检产品。

1.4快速荧光灶抑制试验

参照文献[4,5]方法进行。

将待检血清或免疫球蛋白、标准品及实验内部参考品分别作3倍系列稀释,加入96孔细胞培养板中;再加入50μl经预先滴定的病毒液（80%~95%的细胞可呈现荧光染色的病灶,同时设病毒回滴对照及细胞对照,37℃中和1h;每孔加入50μlBSR细胞（1×106个/ml,37℃,5%CO2孵箱培养24h;吸弃上清液,细胞用PBS洗涤1次,加入4℃预冷的丙酮,4℃固定30min;弃去丙酮,每孔加入50μlFITC标记的小鼠抗狂犬病病毒核蛋白单抗（1∶100稀释,37℃孵育30min;PBS洗涤3次,每孔加入2滴80%甘油,倒置荧光显微镜下观察每孔荧光病变情况。

结果判定:

病毒对照孔应达到80%~95%的细胞呈现荧光染色病灶;细胞对照应无荧光病灶;参考品A/B中和效价应在设定的范围内,依次读取待检样品各稀释度荧光病灶的百分率;记录标准品、参考品及血清或免疫球蛋白样品荧光病灶在50%上下的两个稀释度,并与已知效价的参考品对照,计算出待检血清效价,采用SPSS统计软件计算结果。

荧光灶模式见图1。

1.5小鼠脑内中和法

参照《中国药典》三部（2005版方法进行。

1.6RFFIT法与MNT法的精密性分析

分别用RFFIT法和MNT法对我国第5批狂犬病毒免疫球蛋白国家标准品（由国家第4批抗狂犬病病毒抗体标准品标定进行多次重复标定（以第3

批国际标准品为标准,其中MNT法进行25次重复测定,RFFIT法进行12次重复测定。

同时为验证RFFIT法在不同实验室间操作的重现性,由法国巴斯德研究所采用RFFIT法,对我国第5批狂犬病免疫球蛋白国家标准品进行10次重复标定（以法国国家抗狂犬病病毒血清标准品和第3批国际标准品为标准。

对结果进行统计学分析。

A:

阴性细胞对照;B:

与病毒对照相比较,能抑制50%病毒的最高稀释度血清;C:

病毒对照

图1单克隆抗体标记的荧光素染色的荧光灶模式

Fig1.ModeoffluorescencefocusofstainedMcAbagainstrabiesneucleoproteinlabeledwithfluorescence

1.7RFFIT法与MNT法的相关性分析

采用RFFIT和MNT两种方法检测19份ERIG和HRIG样品和15人接受人用狂犬病疫苗免疫前、免疫后14d、45d的45份血清样品的抗狂犬病病毒中和抗体效价,并采用秩和检验进行相关性统计学分析。

1.8统计学分析

采用SPSS11.0软件进行统计学分析,所得数据进行配对秩和检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1RFFIT法与MNT法的精密性

以第3批国际标准品为标准,分别用MNT法和RFFIT法对我国第5批狂犬病免疫球蛋白国家标准品进行重复标定,结果MNT法25次结果的几何均值（GMT为21.4IU/ml,RFFIT法12次结果的GMT为23.8IU/ml,两种方法的变异系数（CV分别为62.3%和13.3%,表明RFFIT法的精密性优于MNT法。

不同实验室间的重现性验证结果显示,法国巴斯德研究所和中国药品生物制品检定所测定我国第5批国家标准品,结果的几何均值差异无统计学意义（P>0.05,显示两研究所以不同的标准品分别对我国第5批狂犬病免疫球蛋白国家标准品的标定结果非常一致,其中法国巴斯德研究所测定的结果更接近我国以MNT法所标定的值,见表1

。

ABC

表1两个实验室使用不同标准品测定我国第5批狂犬病免疫球蛋白国家标准品的效价GMT值（IU/ml

Tab1.GMTsofthefifthbatchofnationalstandardforra-biesimmunoglobulindeterminedbytwolaboratoriesusingdifferentstandardsforrabiesimmunoglobulin（IU/ml

法国巴斯德研中国药品生物制

究所（n=10品检定所（n=12法国国家抗狂犬病21.36/

病毒血清标准品

第3批国际标准品21.7123.81

2.2RFFIT法与MNT法的相关性

RFFIT法与MNT法检测19份ERIG和HRIG样品的抗狂犬病病毒中和抗体效价,结果差异无统计学意义（P=0.059,见表2,相关系数为0.962,表明两种方法的检测结果之间相关性良好。

两种方法检测结果的散点图见图2。

两种方法检测15人接受人用狂犬病疫苗免疫前、免疫后14d和45d的45份血清样品的抗狂犬病病毒中和抗体效价结果见表3,将免疫后14d和45d的29份血清抗体检测结果（除去A1样品,因两种方法检测结果不一致与19份ERIG和HRIG样品效价数据合并分析,两种方法的检测结果差异无统计学意义（P=0.902,相关系数为0.976,表明两种方法检测结果之间呈良好的正相关性。

两种方法检测结果的散点图见图3。

表2RFFIT和MNT法测定ERIG和HRIG样品的抗狂犬病病毒中和抗体效价的比较

Tab2.DeterminationofneutralizingantibodypotenciesagainstrabiesvirusinERIGandHRIGbyRFFITandMNT

血清样品RFFIT法（IU/mlMNT法（IU/mlL1107.20131.0

L2108.11134.0

L3231.30195.2

L4158.20172.0

L558.5877.1

L680.3873.6

L758.5670.0

L864.2075.9

L994.3089.2

L1036.9537.2

L1127.8025.4

L1227.8025.5

L13114.00138.0

L14153.00143.0

L15146.00132.0

L1648.5069.0

L1751.5074.0

L18383.00537.0

L1952.5068.0表3RFFIT和MNT法检测免疫前后血清样品的抗狂犬病病毒中和抗体效价的比较

Tab3.DeterminationofneutralizingantibodypotenciesinhumanserabeforeandafterimmunizationbyRFFITandMNT

血清样品RFFIT法（IU/mlMNT法（IU/ml1≤0.07≤0.2

3≤0.07<0.5

5≤0.07<0.5

6≤0.09<0.5

9≤0.07<0.5

10≤0.07<0.5

11≤0.09<0.5

210.13<0.5

29≤0.09<0.5

32≤0.09<0.5

39≤0.09<0.5

400.19<0.5

450.19<0.5

500.19<0.5

61≤0.09<0.5

A10.89≤0.3

A34.781.23

A54.120.66

A63.664.17

A94.8617.0

A105.211.32

A117.134.17

A216.511.66

A295.421.32

A3212.3613.5

A394.860.91

A405.421.32

A4519.5317.0

A508.791.91

A614.861.23

B12.382.09

B33.691.32

B52.772.63

B61.040.8

B92.770.8

B102.871.32

B117.962.63

B213.760.8

B2911.2921.4

B327.963.81

B396.726.61

B407.132.63

B4523.8930.2

B505.381.32

B613.691.32

注:

1~61:

免疫前的血清抗体效价;A1~A61:

免疫后14d的血清抗体效价;B1~B61:

免疫后45d的血清抗体效价

参照品

图2RFFIT法与MNT法检测19份ERIG和HRIG样品抗狂犬病病毒中和抗体效价结果的散点图

Fig2.Scatterdiagramofneutralizingantibodypoten-ciesagainstrabiesvirusin19ERIG/HRIGsamplesdeter-minedbyRFFITandMNT

图3RFFIT法与MNT法检测19份ERIG和HRIG及29份免疫后血清样品抗狂犬病病毒中和抗体效价结果的散点图

Fig3.Scatterdiagramofneutralizingantibodypoten-ciesagainstrabiesvirusin19ERIG/HRIGsamplesand29serumsamplesafterimmunizationdeterminedbyRFFITandMNT

3.

讨论

RFFIT法检测抗狂犬病病毒中和抗体的基本原理是将狂犬病攻击病毒与待检血清混合,体外中和一定时间,将混合物接种细胞,培养24h后,用荧光标记的抗狂犬病病毒核蛋白单抗进行染色,如待检样品中含具有中和活性的抗体,病毒可被中和而荧光染色呈阴性或减少,样品中无具有中和活性的抗体则荧光染色呈阳性。

该方法可在抗体标准品平行实验的基础上评价样品的中和抗体效价[6]。

狂犬病病毒在细胞中培养时的复制周期为16~20h,因此实验时检测到的病毒是未被中和、在细胞中培养的第1代子代病毒。

在实验时选择抗狂犬病病毒核蛋白的单抗,是由于狂犬病病毒的核蛋白在复制过程中最先被转录和复制,在病毒的复制过程中首先与病毒RNA结合,形成核糖核蛋白,结构稳定,而且核蛋白的量占狂犬病病毒总蛋白的36%以

上[7]

容易被检测到。

RFFIT法实验时采用96孔细胞培养板,为样品的稀释提供了条件,本文结果显示,其测定的抗体水平可达0.1IU/ml以下,而MNT法由于小鼠使用量的限制,待测样品稀释度同样受限,因此其抗体检测限只能达到≤0.2IU/ml的水

平,表明RFFIT法的敏感性较MNT法好。

本文对疫苗免疫后14d的血清抗体进行检测时,对疫苗应答水平较低的个体的血清样品（A1用MNT法检测达不到有效保护的水平（0.5IU/ml,但应用RFFIT法检测,该样品则达到了有效保护水平（0.89IU/ml,表明RFFIT法的敏感性高于MNT法,与文献报道

一致[5,8]

。

综上所述,RFFIT实验时间短（只需2d,可同时进行大量样本的检测,不需使用动物,符合动物实

验3R原则;

而且已经国际上众多实验室的验证,并得到WHO的强力推荐。

因此,该方法将成为我国检测ERIG/HRIG效价的法定方法,本研究为此提供了重要的数据支持。

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（收稿日期:

2009-02-23

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（IU/mlRFFIT法（IU/ml

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RFFIT法（IU/ml

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