科研教学实验内容.docx
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科研教学实验内容
实验1复方罗布麻片中山奈酚的含量测定
[实验目的]
1.掌握Waters2695型高效液相色谱的操作方法。
2.掌握用高效液相色谱测量主要化合物含量。
[实验原理]
复方罗布麻片是复方中药制剂，临床用于降血压，罗布麻叶是该复方君药（主要药材），山奈酚是主要活性物质，因此检测复方罗布麻片中山奈酚含量对该药品的质量控制起到重要的作用。
山奈酚结构如图1所示。
图1山奈酚结构
高效液相色谱法是一种分离和检测方法，由进样系统，色谱柱，流动相泵和检测系统组成，主要用于单体化合物的分离和检测。
高效液相色谱系统分离的关键部分是固定相和流动相。
固定相为固体，用于吸附物质，流动相由乙腈和水组成，乙腈是有机溶剂，极性偏弱，洗脱能力强，水极性强，洗脱能力弱。
通过调整乙腈和水的比例，以控制流动相的洗脱能力，首先将极性化合物洗脱出来，之后再将弱极性化合物洗脱出来，以达到分离化合物的目的。
试验过程中，首先，仪器将样品溶液注入色谱柱内，色谱柱内的C18硅胶会将样品吸附在色谱柱内的前端，以乙腈和水作为流动相，洗脱色谱柱内的化学成分。
柱内的化学成分会依据极性大小而被逐个洗脱出来。
不同的进样量会产生不同的峰面积。
因此，以山奈酚对照品的进样量为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
通过样品的峰面积计算样品中山奈酚含量。
山奈酚对照品及样品高效液相色谱图如图2和图3所示
图2山奈酚对照品高效液相色谱图图3样品高效液相色谱图
[仪器与试剂]
Waters2695高效液相色谱仪（美国，Waters公司）；
超纯水（18.2Ωpa），实验室自制，（德国，Siemens公司）；
旋转蒸发仪（日本，EYELA公司）；
BS-124S电子天平（德国，SartoriusAG公司）；
乙腈和醋酸为色谱纯（美国Thermo-Fisher公司）
乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和乙酸等为分析纯试剂（北京化工厂）；
复方罗布麻片购自北京同仁堂长春店。
[实验步骤]
1.样品溶液和对照品溶液的制备：
用天平称取2g样品，用甲醇定容至100mL量瓶中，备用，制得0.02g/mL样品溶液。
精密量取4mg山奈酚对照品，用甲醇定容至10mL量瓶中，制得0.4mg/mL对照品溶液。
将上述两份溶液过0.45μm微孔滤膜，滤至液相色谱瓶中，备用。
2.高效液相色谱法检测对照品及样品溶液：
首先建立高效液相色谱分析方法，设置的参数包括：
温度：
30oC，洗脱时间：
5min，洗脱方法：
乙腈（A）：
0.05%醋酸溶液（B）=55:
45，等度洗脱模式，流动相流速1.0mL/min。
对照品进样量分别为：
1μL、2μL、3μL、4μL和5μL，以进样量为横坐标，色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线。
样品进样量为10μL，通过液相色谱保留时间识别样品中山奈酚，读取峰面积，代入标准曲线中，计算样品中山奈酚含量。
[思考题]
1.为什么在流动相中加入乙酸。
2.高效液相色谱的梯度洗脱和等度洗脱的区别是什么，并阐明各自的优点和缺点。
实验2高效液相色谱测定糖果中香兰素
[实验步骤]
1.进一步掌握高效液相液相色谱原理和操作方法
2.进一步掌握标准曲线制作方法，测量主要化合物含量。
[实验原理]
香兰素是一种人工合成香料，化学名称：
4-羟基-3-甲氧基苯甲醛。
结构式如图1所示。
图1香兰素结构式
该香料稳定性优良，可安全地用于食品、饮料、化妆品的增味剂和调味剂。
据欧盟专家委员会2000年2月24日报导，大剂量可导致头痛、恶心、呕吐、呼吸困难，甚至损伤肝肾等。
因此检测食品中香兰素的含量至关重要。
试样加入蒸馏水溶解，提取液以乙酸乙酯萃取，取上层溶液，蒸干，用甲醇溶解，滤过后进样，经高效液相色谱分析，根据液相色谱峰面积进行香兰素含量检测。
[试剂与仪器]
Waters2695高效液相色谱仪（美国，Waters公司）；
超纯水（18.2Ωpa），实验室自制，（德国，Siemens公司）；
BS-124S电子天平（德国，SartoriusAG公司）；
乙腈和醋酸为色谱纯（美国Thermo-Fisher公司）
乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和乙酸等为分析纯试剂（北京化工厂）；
香兰素对照品。
[实验步骤]
1、试样前处理
糖果：
称取1块，记录质量（g），放入小烧杯中，加入40mL蒸馏水，60oC水浴加热并搅拌30分钟，冷却，用40mL乙酸乙酯萃取1次（除去糖分），上层溶液蒸干，用甲醇定容至10mL量瓶中，摇匀，溶液经0.45µm滤膜过滤，进行HPLC分析。
2、高效液相色谱测定
（1）.高效液相色谱检测条件：
色谱柱：
Waters-C18（4.6mm×150mm,5μm）；流动相：
甲醇（A）:
0.5%乙酸溶液（D）（60:
40）；流速：
1.0mL/min;检测波长：
230nm，运行时间：
6min。
（2）.含量测定
取标准使用液，置高效液相色谱仪中，分别进样1μL（100ng）,2μL（200ng）,3μL（300ng）,4μL和5μL，以香兰素含量（将含量计算为纳克,1mg=1.0×106ng）为纵坐标，以峰面积为横坐标绘制标准曲线。
取处理液，置高效液相色谱仪中，进样量为10μL，将峰面积代入标准曲线中，计算香兰素含量（ng）。
3、结果计算
试样中香兰素含量按下式进行计算
X=（m·k1·k2）/g
X——试样（糖果）中香兰素含量，单位为（mg/g）；
m——经标准曲线计算得到的香兰素含量（ng）；
k1——单位换算系数，本实验k1=1000（1mL=100·10μL，样品以10mL甲醇溶解，故系数为100×10）
k2——单位换算系数，本实验k2=0.001，（1ng=0.001mg）
g——样品质量（g）
注：
计算结果保留三位有效数字。
[思考题]
1.制作标准曲线时为什么将香兰素含量计算为纳克，而不是毫克或者其它单位？
实验3原子吸收光谱法测定食品中铜的含量
[实验目的]
1.掌握含铜样品的前处理方法；
2.掌握原子吸收光谱法测定铜的原理和过程。
[实验原理]
铜是人体必需的微量元素，它在人体内主要以铜酶的形式参与机体一系列复杂的生化过程。
它参与血细胞中铜蛋白的组成，与微量元素铁有相互依赖的关系，是体内铁元素吸收、利用、运转及红细胞生成等生理代谢的催化剂。
此外，铜还参与造血和铁的代谢过程，如果缺少它，就会导致造血机能发生障碍。
这时，即使机体内有充足的铁，也会引起贫血。
因此，铜在食物中含量至关重要。
含铜丰富的食物包括蛋黄、豆类、核桃、花生、葵花子、芝麻、蘑菇、菠菜、杏仁、茄子、稻米、小麦、牛奶等。
本实验以东北道地植物胡桃楸的种仁核桃为研究对象，利用原子吸收光谱法测定核桃中铜含量。
试样经处理后，导入原子吸收分光光度计中，原子化以后，吸收324.8nm共振线，其吸收值与铜含量成正比，与标准系列比较定量。
[仪器和试剂]
10%硝酸溶液：
取10ml硝酸置于适量水中，再稀释至100mL。
硝酸（1+4）：
取100ml硝酸，加入到400ml水中。
铜标准溶液：
准确称取0.1965gCuSO4.5H2O固体，用蒸馏水溶解后，转移至1000ml容量瓶中，并稀释至1000ml，所得到的铜标准溶液浓度为50ug.mL-1。
铜标准使用液I：
吸取2.0mL铜标准溶液，置于100mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，如此多次稀释至每毫升相当于1.0ug铜。
马弗炉。
原子吸收分光光度计。
[实验步骤]
1试样处理
将核桃磨碎，过20目筛，混匀。
蔬菜、水果等试样取可食部分，切碎、捣成匀浆。
称取1.00g～5.00g试样，置于石英或瓷坩埚中，加5mI硝酸，放置0.5h，小火蒸干，继续加热炭化，移人马弗炉中，500℃士25℃灰化1h，取出放冷，再加1mL硝酸浸湿灰分，小火蒸干。
再移人马弗炉中，500℃灰化0.5h，冷却后取出，以1mI硝酸（1+4）溶解4次，移人10.0ml容量瓶中，用水稀释至刻度，备用。
取与消化试样相同量的硝酸。
按同一方法做试剂空白试验。
2测定
吸取0.0、l.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0铜标准使用液I（1.0μg/mL），分别置于10mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，混匀。
容量瓶中每毫升分别相当于0、0.10、0.20、0.40、4.60、0.80、1.00μg铜。
将处理后的样液、试剂空白液和各容量瓶中铜标准液分别导入调至最佳条件火焰原子化器进行测定。
3结果计算 试样中铜的含量按下式进行计算。
式中：
X——试样中铜的含量，单位为毫克每千克或毫克每升（mg/kg或mg/L）
A1——测定用试样中铜的含量，单位为微克每毫升（ug/mI）;
A2——试剂空白液中铜的含量，单位为微克每毫升（ug/mI）；
V——试样处理后的总体积，单位为毫升（mI）；
m——试样质量或体积，单位为克或毫升（g或mL）。
[思考题]
1.本实验为什么要先碳化才能测量铜含量？
2.本实验碳化过程为什么要用硝酸？
实验4原子吸收光谱法测量枸杞和大豆中锌的含量
[实验目的]
1.掌握药材和食品中锌的处理方法
2.进一步掌握和加强原子吸收光谱法的操作
[实验原理]
锌是人体必需成分，中药中的枸杞、熟地、桑椹、人参、杜仲等含锌量较高，锌对于肝炎病人的治疗很有效。
植物性食物中的各种豆类、坚果类含锌较多，蔬菜类以大白菜、白萝卜、紫萝卜、茄子青菜、豆荚、黄豆等黄绿色蔬菜里含锌较多。
此外，炒葵花子、炒南瓜子、山核桃、松子、酸奶、花生油、水果、花生等食物锌含量也较高。
本实验以东北道地药材和东北产的作物枸杞和大豆为研究对象，对样品处理，用原子吸收光谱法测量枸杞和大豆中锌含量。
试样经处理后，导入原子吸收分光光度计中，原子化以后，吸收213.8nm共振线，其吸收值食<<隐与锌含量成正比，与标准系列比较定量。
[仪器与试剂]
4-甲基酮-2（MIBK，又名甲基异丁酮）。
磷酸（1+10）。
盐酸（1+11）：
量取10mI．盐酸加到适量水中再稀释至120mL。
混合酸：
硝酸+高氯酸（3+1）。
锌标准溶液：
准确称取0.500g金属锌（99．99％）溶于10mL，盐酸中，然后在水浴上蒸发至近干，用少量水溶解后移入1000mL容量瓶中，以水稀释至刻度，贮于聚乙烯瓶中，此溶液每毫升相当0.50mg锌。
锌标准使用液：
吸取10.0mL锌标准溶液置于50mL容量瓶中，以盐酸（0.1mol/L）稀释至刻度，此溶液每毫升相当于100μg锌。
原子吸收分光光度计。
[实验步骤]
1试样处理
1.1枸杞：
去除枸杞上的杂物及尘土，置60oC烘箱中烘干，冷却、捣碎，过40目筛，混匀。
称取约5.00g～10.00g置于50mI瓷坩埚中，小火炭化至无烟后移人马弗炉中，500oC±25oC灰化约8h后，取出坩埚，放冷后再加入少量混合酸，小火加热，不使干涸，必要时加少许混合酸，如此反复处理，直至残渣中无炭粒，待坩埚稍冷，加10mI盐酸（1+11）溶解残渣并移入50mI容量瓶中，再用盐酸（1+11）反复洗涤坩埚，洗液并入容量瓶中，并稀释至刻度，混匀备用。
取与试样处理相同量的混合酸和盐酸（1+11），按同一操作方法做试剂空白试验。
1.2大豆：
取大豆粉碎。
称取10.00g～20.00g置于瓷坩埚中，加1mL磷酸（1+10），小火炭化，以下按1.1自“然后移人马弗炉中……”起依法操作。
将处理后的样液、试剂空白液和各容量瓶中锌标准溶液分别导入调至最佳条件的火焰原子化器进行测定。
参考测定条件：
灯电流6mA，波长213.8nm，狭缝0.38nm，空气流量10L/min，乙炔流量2.3L/min，灯头高度3mm，氘灯背景校正，以锌含量对应吸光值，绘制标准曲线或计算直线回归方程，试样吸光值与曲线比较或代人方程求出含量。
注：
样品需酸化，液体不能浑浊。
2.结果计算
试样中锌的含量按式
（1）进行计算。
X=[（A1-A2）×V×1000]/[m×1000]
式中：
X——试样中锌的含量，单位为毫克每千克或毫克每升（mg/kg或mg/L）；
A1——测定用试样液中锌的含量，单位为微克每毫升（mg/mL）；
A2——试剂空白液中锌的含量，单位为微克每毫升（μg/mL）；
m——试样质量或体积，单位为克或毫升（g或mL）；
V——试样处理液的总体积，单位为毫升（mL）。
[思考题]
1.原子吸收光谱检测金属含量最需要注意的是什么？
实验5高效液相色谱-电喷雾质谱联用技术研究人参中皂苷
[实验目的]
1.掌握高效液相色谱-电喷雾质谱的基础原理及基础操作方法；
2.掌握人参中皂苷类成分的基本结构和检测方法。
[实验原理]
中药人参为五加科人参属植物人参（panaxginsengC.A.Mey）的干燥根，具有滋补、强壮、抗疲劳等多方面的药理和生物活性，为吉林省道地药材，在中药材的地位中较高。
人参主要成分为人参皂苷，常见皂苷有10种左右。
主要包括人参皂苷Ra1,Ra2,Rb1,Rb2,Rb3,Rc,Rd,Re,Rg1,Rg2,Rg3,Rk1,Rg5,Rg6和F4等。
检测各种人参皂苷最常用的方法为高效液相色谱和质谱联用方法，该方法在中药研究中日趋成熟。
首先，将人参样品进行提取，提取物进行液相色谱的分离，不同的皂苷类成分会依次地被液相色谱洗脱下来，通过质谱分析，可以得到其分子质量，进而分析不同皂苷的种类（图2）。
图1人参皂苷Re化学结构及分子量
图2:
人参质谱离子流图
[试剂和仪器]
FiniganLCQTM液相色谱电喷雾质谱仪，美国Thermo公司产品；
SanoriusBSl10S十万分之一分析天平；
甲醇与冰醋酸均为色谱纯，美国Fisher公司产品；
正丁醇、氯仿、甲醇均为分析纯，北京化工厂产品；
人参药材采自吉林抚松，经长春师范大学中心实验室张语迟鉴定。
[实验步骤]
1.样品处理方法：
精密称取人参粗粉2g,置于索氏提取器中,加入100ml三氯甲烷连续回流提取3小时,三氯甲烷冷却后,将装有样品粉末的纸包取出,挥干三氯甲烷后将样品连同纸包置于100ml锥形瓶中,加入50ml水饱和正丁醇溶液,在500W,30℃的条件下超声1小时.超声结束后滤过.滤液蒸干，残渣用水定容于20ml量瓶中，上10g大孔树脂中，先用30ml水洗脱，洗脱液弃去.继以100ml70%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，常压蒸干，残渣以甲醇加入4～8滴吡啶定容于10ml容量瓶中备用。
2.高效液相色谱和电喷雾质谱条件：
高效液相色谱条件:
CapcellPakC18色谱柱（4.6×250mm,5μm）（日本资生堂）,柱温35℃;采用二元线性梯度洗脱:
流动相:
（A）0.2%冰醋酸水溶液,（B）乙腈,洗脱条件为:
0min:
25%，120分钟内上升至100%。
流速0.5mL/min。
进样量为10μL
质谱条件：
喷雾电压：
4.5KV，金属毛细管温度：
250V，鞘气为N2，压力为6.8×102KV，辅助气体为He,其压力为1.0×102Kpa.分析条件采用负离子模式，扫描范围为：
m/z200～1500.
3.实验结果：
电喷雾质在HPLC-ESI-MS负离子条件下,皂苷化合物以[M-H]-、[2M-H]-、[M+AcO-H]-准分子离子形式存在，如下表所示
化学成分
负离子模式下质核比（m/z）
分子量
1
Re
945[M-H]-
946
2
Rf
799[M-H]-
800
3
Rg2
783[M-H]-
784
4
Rb1
1107[M-H]-
1108
6
Rc
1077[M-H]-
1078
7
Rb2
1077[M-H]-
1078
8
Rd
945[M-H]-
946
9
Rb3
1077[M-H]-
1078
10
Ro
955[M-H]-
956
11
Rs2
1119[M-H]-
1120
根据上表，在本实验结果中寻找人参皂苷Rb1，Rd和Ro。
[思考题]
1.同分异构体的化合物如何区分？
2.人参皂苷Rb1分子量为1108，质核比一般为1107，但为什么同时显示1167？
实验6高效液相色谱—电喷雾质谱法分析罗布麻叶提取物
[实验目的]
1.进一步掌握高效液相色谱―电喷雾质谱原理及操作方法
2.熟悉罗布麻叶回流提取法和超声波提取法，并分析其化学成分
[实验原理]
中药罗布麻叶（ApocynumvenetumL.）是夹竹桃科罗布麻属植物罗布麻的干燥叶。
其化学成分主要为黄酮及黄酮苷，临床常用于降血压，且具有肝保护，抗抑郁等功效。
当前的提取方式包括回流法和超声波提取法。
液相色谱—电喷雾质谱联用技术（HPLC-ESI-MS）同时具备液相色谱的高度分离性能及电喷雾质谱的高敏感性和检测能力，在天然药物化学的分析研究中具有独特的优势。
本实验采用HPLC-ESI-MS方法对回流法和超声波提取罗布麻叶得到的提取物进行分析检测，建立“罗布麻叶液相色谱电喷雾质谱联用技术”的系统的分析研究方法结果如图1所示。
图1超声波提取（a）和回流提取（b）罗布麻叶的HPLC/DAD色谱图
[试剂与材料]
乙腈和醋酸为色谱纯，均购自美国Fisher公司；
其他试剂为分析纯，购自北京化工厂；
水为超纯水（18.2MΩ•cm）；
罗布麻叶（产地:
新疆）购自北京同仁堂，经长春师范大学中心实验室张语迟鉴定。
[实验步骤]
1.样品溶液的制备：
回流法提取：
精确称取罗布麻叶粉末（过三号筛）1.00g，置500mL回流瓶中，加入200mL70%乙醇溶液，回流提取1h（从回流瓶内液滴开始滴下计时），滤过，同法提取两次，合并滤液，浓缩至干，残渣用50%甲醇定容至50mL量瓶中，试验前分别取10mL经0.45μm膜滤过，即得。
超声波法提取：
精确称取罗布麻叶粉末（过三号筛）1.00g，置500mL锥形瓶中，加入200mL水，加入200mL70%乙醇溶液，超声波法提取1h，滤过，同法提取两次，合并滤液，浓缩至干，残渣用50%甲醇定容至50mL量瓶中，试验前取10mL经0.45μm膜滤过，即得。
2.液相色谱与电喷雾质谱联用分析条件
高效液相色谱分析条件：
色谱仪为Waters2695HPLC，配备2996DAD型检测器（美国Waters公司）,检测条件:
AgilentC18色谱柱（250mm×4.6mm,5μm,美国Agilent公司）;柱温:
28℃;二元线性梯度洗脱:
流动相:
（A）0.2%醋酸水溶液;（B）乙腈;流动相梯度组成:
0～20min:
13%B;20～60min:
13～40%B;60～90min:
40～100%B;流速0.5mL/min;样品进样量10μL;检测波长:
360nm。
电喷雾质谱分析条件:
LCQTM电喷雾质谱仪（美国Thermo—Finnigan公司）;负离子模式;扫描范围:
m/z50～2000;离子阱的条件:
喷雾电压4.5kV;壳气（N2）6×105Pa;辅助气（N2）1×105Pa;金属加热毛细管温度250℃;毛细管电压10V。
3实验结果处理
分析罗布麻叶的回流法和超声波法提取罗布麻叶的HPLC-DAD图。
根据负离子模式下各成分的质核比（表1）确定化合物。
表1：
负离子模式下罗布麻提取物分析数据
m/z（－）
化合物
463
异槲皮素
463
金丝桃苷
505
乙酰化异槲皮素
505
乙酰化金丝桃苷
447
紫云英苷
447
山奈酚-3-O-半乳糖苷
301
槲皮素
284
山奈酚
确定两份提取物中金丝桃苷，乙酰化金丝桃苷、紫云英苷、槲皮素和山奈酚
并比较两种提取方法所获得提取物中上述成分的含量大小。
（求比值）
[思考题]
1.超声波提取法和回流提取法的优点和缺点各是什么？
2.本实验中同分异构体的化合物在质谱中表现形式相同还是不同？
实验7应用高速逆流色谱分离罗布麻叶中黄酮类化合物
[实验目的]
1.掌握高速逆流色谱原理及操作方法，
2.掌握高速逆流色谱分离罗布麻叶中化合物的方法。
[实验原理]
中药罗布麻叶（ApocynumvenetumL.）是夹竹桃科罗布麻的干燥叶，具有广泛的药用价值，是中国药典中治疗高血压和肝病的法定用药。
黄酮类化合物是罗布麻叶中的主要成分。
目前，在罗布麻叶中已经能定性的黄酮类化合物包括槲皮素、异槲皮苷、金丝桃苷、白麻苷、芦丁、紫云英苷、山奈酚、芸香苷、新异芸香苷和双氢黄酮夹竹桃麻素等。
目前黄酮类化合物的的分离技术比较传统，如聚酰胺树脂，硅胶和SephadexLH-20等柱色谱。
应用此类方法溶剂消耗大，分离时间长，制备量小。
高速逆流色谱是一种现代的分离技术，基于液-液分配原理设计，使用液体作为固定相，利用被分离组分在互不相溶的两相中不同的溶解程度而达到分离的目，克服了固相载体对样品的不可逆吸附的缺点，化学成分的回收率可达100%。
同时具有制备量大，分离效果好，速度快等优势，在天然产物的分离工作中广泛应用。
本实验以东北道地药材罗布麻作为研究对象，采用高速逆流色谱对罗布麻叶中化学成分进行分离，分离结果如图1所示。
图1罗布麻叶黄酮类化合物高速逆流色谱图
[实验仪器和材料]
高效逆流色谱SpectrumHSCCC（DE，英国）；
检测器：
UVDetector-2500（Waters，美国）；
冷凝器：
LabTechH150，LCQFleet（Thermo，美国）；
甲醇、乙腈、冰醋酸等高效液相色谱仪所用试剂均为色谱纯试剂（加拿大，CaledonLaboratoriesL）；
乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和乙酸等为分析纯试剂（北京精细化工厂），超纯水（18.2Ωpa）；
0.45µm微孔滤膜（美国，Agilent公司）；
罗布麻叶药材购于长春吉林大药房，经长春师范大学中心实验室张语迟鉴定。
[实验步骤]
1样品制备
精确称取罗布麻叶粉末（过三号筛，孔径355μm）100.002g,置2500mL回流瓶中,加入2000mL70%乙醇溶液，回流提取1h，滤过,同法提取2次，合并滤液，浓缩至干，用200mL水溶解上D-101型大孔树脂柱，先用5倍柱体积的水洗脱，弃去，再用5倍柱体积的60%乙醇溶液洗脱，收集并浓缩至干，制得罗布麻叶粗提物。
精确称定总黄酮粉末10mg，分别取固定相和流动相各1ml完全溶解，作为样品溶液待用。
2溶剂系统的配制
按照乙酸乙酯-乙腈-水-乙酸为5：
0.8：
5：
0.02（v:
v:
v:
v），于500ml分液漏斗中，振荡摇匀，分层后静止15min，振荡3次。
再由下口放出下层溶液作为流动相，从上口倒出上层溶液作为固定相。
分别用0.22µm滤膜分别过滤上层和下层溶液，超声脱气30min，待用。
3逆流色谱分离制备
用10mL·min-1流速充入固定相，15min后，转动色谱柱，开启检测器，运行10min，以2.5mL·min-1冲入流动相，至固定相流出的体积不再增加时为止，柱体积为150mL，计算溶剂系统的固定相保留值。
样品溶液以2mL定量管注入样品。
从30min时开始接流分。
检测波长为360nm，转速1500r·min-1，柱温30℃，机器运行180min，分离得到明显的6个色谱峰，上样量150mg
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