用MEGA构建进化树.docx

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用MEGA构建进化树

如何用MEGA构建进化树

MEGA3.1是一个关于序列分析以及比较统计的工具包，其中包括有距离建树法和MP建树法；可自动或手动进行序列比对，推断进化树，估算分子进化率，进行进化假设测验，还能联机的Web数据库检索。

下载后可直接使用，主要包括几个方面的功能软件：

i）DNA和蛋白质序列数据的分析软件。

ii）序列数据转变成距离数据后，对距离数据分析的软件。

iii）对基因频率和连续的元素分析的软件。

iv）把序列的每个碱基/氨基酸独立看待（碱基/氨基酸只有0和1的状态）时，对序列进行分析的软件。

v）绘制和修改进化树的软件，进行网上blast搜索。

用MEGA构建进化树有以下步骤：

1.16SrDNA测序和参考序列选取

从环境中分离到单克隆，去重复后扩增16SrDNA序列并测序，然后与数据库http:

//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi比对，找到相似度最高的几个序列，确定一下你分离的细菌大约属于哪个科哪个属，如果相似度达到百分之百那基本可以确定你分离得到的就是Blast到的那个，然后找一到两个同科的，再找一到两个同目的，再找一到两个同纲的细菌，把序列全部下下来，以FSATA形式整合在TXT文档中，如

>TS1

GCAGTCGAACGATGAAGCCCAGCTTGCTGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGACCTCGGGATGCATGTTCCGGGGTGGAAAGGTTTTCCGGTGCAGGATGGGCC

>gi|117572706|gb|EF028124.1|Rhodococcussp.Atl2516SribosomalRNAgene,partialsequence

CGATTAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAAGCCCAGCTTGCTGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGAT

>TS2

TGCAAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACT

>gi|56383044|emb|AJ809498.1|Bacilluscereuspartial16SrRNAgene,strainTMW2.383

GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACYGCATGGTTC………………………….

………………………….

参考序列选择有几个原则：

a，不选非培养（unclutured）微生物为参比；b，所选参考序列要正确，里面无错误碱基；c，在保证同属的前提下，优先选择16SrDNA全长测序或全基因组测序的种；d，每个种属选择一个参考序列，如果自己的序列中同一属的较多，可适当选择两个参考序列。

2.序列比对

将整理好的序列导入clustalx1.83，如图

接着

程序自动运行，得出结果，自动输出.aln和.dnd为后缀的两个文件。

序列比对也可以直接用MEGA来做。

3.打开程序MEGA，如下图所示：

4.MEGA3.1只能打开meg格式的文件，但是它可以把其他格式的多序列比对文件转换过来，用.aln格式（Clustal的输出文件）转换.meg文件。

点File:

ConverttoMEGAFormat，打开转换文件对话框，从目的文件夹中选中Clustal对比分析后所产生的.aln文件，点击打开。

5.转换好的meg文件，会弹出一个提示信息，点击ok。

查看meg序列文件最后是否正常，若存在clustal.*行，即可删除。

点存盘保存meg文件，meg文件会和aln文件保存在同一个目录。

6.关闭转换窗口，回到主窗口，现在点面板上的“Clickmetoactivateadatafile”打开刚才的meg文件。

如果为蛋白质序列，选择“proteinsequence”，电击“OK”，得到以下图示，数据输入之后的样子，窗口下面有序列文件名和类型。

而在另外一个窗口内，出现以下数据文件点击选择和编辑数据分类图标，可对所选择的序列进行编辑，完成后点击close即可。

序列编辑完成后，可进行保存，点击保存后出现以下界面，点击ok即可。

7.构建进化树的算法主要分为两类：

独立元素法（discretecharactermethods）和距离依靠法（distancemethods）。

所谓独立元素法是指进化树的拓扑形状是由序列上的每个碱基/氨基酸的状态决定的（例如：

一个序列上可能包含很多的酶切位点，而每个酶切位点的存在与否是由几个碱基的状态决定的，也就是说一个序列碱基的状态决定着它的酶切位点状态，当多个序列进行进化树分析时，进化树的拓扑形状也就由这些碱基的状态决定了）。

而距离依靠法是指进化树的拓扑形状由两两序列的进化距离决定的。

进化树枝条的长度代表着进化距离。

独立元素法包括最大简约性法（MaximumParsimonymethods）和最大可能性法（MaximumLikelihoodmethods）；距离依靠法包括除权配对法（UPGMAM）和邻位相连法（Neighbor-joining）。

（1）phylogeny→UPGMA

（2）用Bootstrap构建进化树，MEGA的主要功能就是做Bootstrap验证的进化树分析，Bootstrap验证是对进化树进行统计验证的一种方法，可以作为进化树可靠性的一个度量。

各种算法虽然不同，但是操作方法基本一致。

进化树的构建是一个统计学问题。

我们所构建出来的进化树只是对真实的进化关系的评估或者模拟。

如果我们采用了一个适当的方法，那么所构建的进化树就会接近真实的“进化树”。

模拟的进化树需要一种数学方法来对其进行评估。

不同的算法有不同的适用目标。

一般来说，最大简约性法适用于符合以下条件的多序列：

i所要比较的序列的碱基差别小，ii对于序列上的每一个碱基有近似相等的变异率，iii没有过多的颠换/转换的倾向，iv所检验的序列的碱基数目较多（大于几千个碱基）；用最大可能性法分析序列则不需以上的诸多条件，但是此种方法计算极其耗时。

如果分析的序列较多，有可能要花上几天的时间才能计算完毕。

过程如下

①参数的设置：

phylogeny→bootstraptestofphylogeny→NJ

②系统进化树的测试方法，可以选择用Bootstrap，也可以选择不进行测试。

重复次数（Replications）通常设定至少要大于100比较好，随机数种子可以自己随意设定，不会影响计算结果。

一般选择500或1000。

有许多Model供选择，默认为Kimura2-parameter，不同的Model有不同的算法，具体请参考专业的生物信息学书籍。

设定完成，点compute，开始计算。

②结果输出：

这个过程所耗时间和序列的数量和长短成正比，程序就会产生这么一个树，该窗口中有两个属性页，一个是原始树，一个是bootstrap验证过的一致树。

树枝上的数字表示bootstrap验证中该树枝可信度的百分比。

结果如下：

8.进化树的优化：

１）利用该软件可得到不同树型，如下图所示：

除此之外，还可以有多种树型，根据需要来选择。

２）显示建树的相关信息：

点击图标i。

３）点击优化图标，可进行各项优化：

􀀹Tree栏中，可以进行树型选择：

rectangulartree/circletree/radiationtree。

每种树都可以进行长度，宽度或角度等的设定

􀀹Branch：

可对树枝上的信息进行修改。

􀀹Lable：

可对树枝的名字进行修改。

􀀹Scale：

标尺设置

􀀹Cutoff：

cutoffforconsensustree。

一般为50%。

9、进化树的分类优化

􀀹Placerootonbranch：

可以来回转换。

􀀹Flipsubtree：

180度翻转分枝，名字翻转180度。

􀀹Swabsubtree：

交换分枝，名字不翻转。

􀀹Compress/expandsubtree与Setdivergenttime：

可以把同一分枝的基因压缩或扩展。

点击Compress/expandsubtree后，在要压缩的分枝处点击，出现以下界面，在name/caption中输入文件名（例如wwww），其他还有很多的选项，设置好了，点击OK。

所得到的结果，可以在压缩和扩展之间转换。

10.调整进化树

根据所的进化树的效果，要进行调整，包括多余序列删除、不足序列添加、种属名称标注等等，还要根据投稿杂志要求在PHOTOSHOP中修改等。

完成后的进化树应包含充足的信息。

本人所做进化树完成图如下：