青岛科技发展计划项目可行性报告中国临床试验注册中心.docx
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青岛科技发展计划项目可行性报告中国临床试验注册中心
青岛市公共领域科技支撑计划
项目申报书
项目名称:
双歧杆菌四联活菌片补充对2型糖尿病患者肠道菌群及血清miR-103表达的影响
申报技术领域:
人口与健康
主管部门:
青岛市卫生和计划生育委员会
承担单位:
(盖章)
协作单位:
(盖章)
项目负责人:
徐倩
起止时间:
2016年1月-2017年12月
青岛市科学技术局
填表日期:
2016年1月25日
1、研究的立项依据
1.国内外研究概况、水平和发展趋势及存在问题
肠道微生物菌群的鉴定和特征已经成为人类疾病的一个主要研究领域,包括世界范围内最常见的内分泌疾病-2型糖尿病。
2型糖尿病是一种受遗传和环境条件影响的复杂疾病,在世界范围内已成为一种主要的公共健康问题。
中国深圳华大基因研究院李英睿教授及其团队进行了一项研究,该研究发现2型糖尿病患者特征为中度肠道微生物菌群失调,肠道微生物指标可帮助区分2型糖尿病[1]。
肠道菌群失调不仅会产生多种胃肠道疾病如腹泻、便秘、肠炎等,还会诱发肥胖、心血管病、糖尿病和代谢综合征等慢性疾病。
近年来关于肠道菌群与2型糖尿病的关系的研究已经成为内分泌代谢领域的热点问题。
2型糖尿病是由遗传和环境因素共同作用引起的一组以糖代谢紊乱为主要表现的临床综合征,其发生的病理生理机制是胰岛素抵抗和胰岛B细胞分泌胰岛素功能障碍,病因仍未完全明确。
临床以慢性高血糖为主要特征,可并发多种急慢性并发症,导致器官功能障碍和衰竭,甚至致残致死。
目前研究认为,2型糖尿病患者存在一种基本的病理生理改变,即慢性低度炎症状态,具体表现为患者血中的脂多糖(1ipopolysaccharide,LPS)浓度升高,但其滴度远小于败血症状态。
这种慢性低度炎症状态通过TLR4/Myd88等经典信号通路介导肝脏、脂肪组织炎症状态,引起胰岛素抵抗,而肠道菌群在这一过程中起着关键作用[2]。
肠道菌群失调通过内毒素导致炎症而引起胰岛素抵抗,是否还影响MicroRNA(miRNA)-103的表达,加重胰岛素抵抗,未见相关的报道。
通过对肠道菌群和2型糖尿病关系的研究不断开展,有学者提出干预肠道菌群可能是今后糖尿病防治领域的重要手段之一。
目前研究较多的是生活方式干预或补充有益菌群来影响肠道菌群,从而改善2型糖尿病患者的胰岛素抵抗和高血糖水平。
1.1肠道菌群
肠道菌群(intestinalflora)指寄居于人体肠黏膜表面的细菌和古生菌,与人类共同进化,作为与人类紧密联系的环境因素,参与人体生长发育、生理过程,甚至疾病状态。
成人正常肠道菌群由约100~150个种属的细菌组成,其中绝大多数(90%)属厚壁菌门及拟杆菌门,其次是变形菌门,还有少量分属微疣菌门、放线菌门、梭菌、蓝藻菌门、螺旋体门、VadinBE97菌门和古生菌等[3]。
肠道菌群通过与人体相互作用,影响人体的营养、物质代谢、免疫系统发生与免疫功能调节、炎症反应、肠道功能,以及血管形成、骨代谢、神经生物行为等,是人类在后天获得并发挥巨大作用,影响人体自稳平衡的重要“器官”[4]。
目前文献证实,肠道菌群可通过影响机体能量平衡,引起全身慢性低度炎症状态,影响肠促胰素分泌等机制,对糖尿病等代谢性疾病的发生产生重要影响[5]。
1.2肠道菌群与2型糖尿病
Larsen等[6]研究发现,2型糖尿病患者肠道内拟杆菌门与硬壁菌门的比值以及普氏拟杆菌与肠球菌的比值与血糖水平呈正相关,与体重指数无关。
而且与正常人相比,糖尿病患者粪便中的B-变形菌丰度明显增加。
新近利用肠道基因组测序方法(MGWAS)研究了342例中国2型糖尿病患者的粪便发现,糖尿病患者的肠道菌群发生了中度紊乱,某些产丁酸盐细菌丰度降低、条件致病菌增加,而具有硫酸盐还原能力及抗氧化功能的细菌增多[1]。
最近Karlsson等[7]对145名欧洲女性(包括血糖正常、糖耐量异常及糖尿病患者)肠道菌群研究发现,糖尿病患者肠道菌群的结构和功能与其他组不同。
2型糖尿病人群的肠道菌群发生了异常变化。
究竟是肠道菌群异常引发了糖尿病,还是在糖尿病的发生、发展过程中宿主代谢的紊乱导致肠道菌群异常还需进一步明确。
研究发现,高脂饮食诱导肠道菌群失调,内毒素血症,引起炎症反应,导致胰岛素抵抗,启动了2型糖尿病的发生。
2型糖尿病是结直肠癌的危险因素。
NonakaR等[8]研究发现,miR-103在结直肠癌病人的血清中高表达,可作为生物标志物之一。
目前,肠道菌群、miR-103、2型糖尿病、胰岛素抵抗之间的关系,未见相关报道。
1.3肠道菌群与microRNAs
人体肠道菌群在肠腔内形成3个生物层:
深层的紧贴黏膜表面并与黏膜细胞粘连形成膜菌群,主要有双歧杆菌和乳酸杆菌组成,属肠共生菌,对宿主健康起重要作用;中层为厌氧菌,包括消化链球菌、韦荣球菌、优杆菌等;表层为腔菌群,主要是大肠杆菌、肠球菌等需氧和兼性厌氧菌,是维持机体稳态的必要组成成分[9]。
肠道菌群在宿主体内构成一个极其复杂的微生态系统,它们以一定的数量和比例,存在人体的肠道中,起营养代谢、生物拮抗、免疫、促进生长、抗肿瘤和防止衰老的作用[10]。
国外WielandA等[11]报道,肠道菌群与体重及胰岛素抵抗也密切相关。
近年来研究发现,微小RNA(microRNAs,miRNAs)通过调控靶基因mRNA的表达,参与胰岛素抵抗的形成。
miRNAs是大小约20-25个碱基的非编码RNA中一类研究最活跃、最深入、发展最快的调控性miRNAs,其对基因表达的主要调控机制已经明确。
参与细胞的分化、凋亡、增值及器官的发育。
miRNAs通过与靶基因3'端非翻译区(3'-UTR)的不完全碱基配对发挥基因调控作用,使mRNA降解或抑制靶mRNA翻译。
其表达异常,参与多种疾病的发生。
miRNAs非常稳定,不容易降解,能顺利进入血液,并长期滞留,发挥调控作用。
Trajkovski等[12]在高脂喂养糖尿病小鼠及非酒精性脂肪肝病人中的实验中证实:
miR103在胰岛素抵抗小鼠及非酒精性脂肪肝病人的肝脏中高表达,CAV-1表达下调,导致胰岛素的信号转到通路障碍,肝糖输出增多,血糖升高,miR-103的表达量与胰岛素抵抗指数呈正相关。
本课题组前期的研究也发现,miR103在胰岛素抵抗为主的超重或肥胖2型糖尿病病人血清的表达水平明显高于正常人群,且与胰岛素抵抗指数呈正相关,是胰岛素抵抗的独立影响因素[13]。
研究证实,益生菌能够调节宿主上皮组织miRNA的表达,促进宿主健康;肠道微生物的代谢产物调控宿主细胞miRNA的表达,影响肠道上皮等组织的功能。
XueX等[14,15]在研究小鼠炎症性肠病时发现,肠道共生菌负调节miR-10a和miR-107在树突状细胞的表达。
miR-103与miR-107的基因是旁系同源基因,二者通过下调靶基因小窝蛋白-1诱导胰岛素抵抗,参与多种疾病的发生,如2型糖尿病、恶性肿瘤、脂代谢的紊乱等。
1.4益生菌与肠道菌群
益生菌,是一类对宿主有益的活性微生物,是定植于人体肠道、生殖系统内,能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称,主要有双歧杆菌、乳酸杆菌等。
既往文献表明糖尿病患者存在肠道菌群失调的情况,糖尿病患者肠道菌群与健康人肠道菌群相比,在数量上发生了较大变化。
糖尿病患者的肠杆菌、肠球菌、梭杆菌、韦荣球菌及葡萄球菌数量均比正常人升高,这些升高的组分多是条件致病菌和过路菌,而酵母菌、链球菌、类杆菌、乳酸杆菌、消化球菌和双歧杆菌与正常人比较有下降的趋势,特别是益生菌的代表双歧杆菌显著降低,并发现糖尿病患者的空腹血糖值(FPG)与双歧杆菌(BS)的对数值呈负相关[16]。
同样有研究表明,糖尿病大鼠肠道益生菌(双歧杆菌和乳酸杆菌)的数量减少,并随降糖治疗的血糖下降而升高[17],这说明在疾病发生发展过程中,机体的微生态平衡也发生相应的调整。
此外,双歧杆菌还能改善糖耐量和葡萄糖诱发的胰岛素分泌功能,降低高脂饮食诱导的糖尿病小鼠内毒素血症和血浆脂肪组织的促炎症因子水平,使小鼠的低浓度炎症好转,从而改善糖尿病代谢紊乱的状态[18]。
另有研究发现,在服用双歧杆菌制剂后,糖尿病患者肠内细菌群结构发生了变化,各项生化指标也有一定程度的改善[19],说明双歧杆菌能改善糖尿病的肠道菌群紊乱。
本课题组已研究miR-103在胰岛素抵抗、2型糖尿病并绝经后乳腺癌及非酒精性脂肪肝中起到了一定的作用。
肠道菌群失调参与胰岛素抵抗、2型糖尿病及恶性肿瘤等疾病的发生。
益生菌制剂改善肠道菌群紊乱,能否影响miR-103的表达,目前未见相关报道。
参考文献
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2.本研究特色、创新性及立题依据(与国内外类似研究比较)
2.1本研究特色
根据糖尿病患者存在肠道菌群紊乱及益生菌制剂能改善肠道菌群的文献报道,选择2型糖尿病患者作为研究对象,观察补充双歧杆菌四联活菌片对2型糖尿病患者血糖、HbA1c及血清中miR-103表达的变化,研究肠道菌群与糖尿病的关系及相关性的分子机制。
2.2本研究的创新
1)2型糖尿病存在肠道菌群失调,本研究通过补充双歧杆菌四联活菌片,观察血糖变化,研究肠道菌群与2型糖尿病的关系。
2)本研究观察双歧杆菌四联活菌片补充对肠道菌群及miR-103表达等指标的变化,研究肠道菌群与2型糖尿病相关性的机制。
2.3立题依据
肠道微生物菌群的鉴定和特征已经成为人类疾病的一个主要研究领。
研究发现,糖尿病患者存在肠道菌群失调,主要为双歧杆菌及乳酸杆菌减少;高脂饮食诱导肠道菌群失调,内毒素血症,引起炎症反应,导致胰岛素抵抗,启动了2型糖尿病的发生。
糖尿病患者服用益生菌制剂后,其肠内细菌群结构发生了变化,各项生化指标也有一定程度的改善。
提示改善肠道菌群有可能成为治疗糖尿病的新靶点,但两者之间的关系及机制仍未完全明确。
肠道菌群失调与肥胖、糖尿病、心血管疾病、肿瘤的关系是目前研究的热点,但它们的机制仍未完全阐明。
高脂饮食引起肠道菌群失调,增加上述疾病的发生。
研究显示:
肠道共生菌调控miRNAs的表达,维持肠道稳态。
提示高脂饮食可能通过肠道菌群调控miRNAs的表达,参与上述疾病并存的发生。
研究发现,微小RNA(microRNAs,miRNAs)通过调控靶基因mRNA的表达,参与胰岛素抵抗、糖尿病、肿瘤及脂代谢紊乱等疾病的发生。
已有的研究显示:
miR-103主要在肝脏细胞表达,肠道共生菌影响miR-103的表达,而高表达的miR-103能沉默CAV-1、Dicer、PTEN、FADD、DAPK、KLF4等基因的表达。
CAV-1的表达下调,影响胰岛素信号通路的传导,导致胰岛素抵抗。
同时miR-103作用的上述基因均参与了肿瘤的发生,因此,miR-103在胰岛素抵抗、糖尿病、肿瘤的发生中起到了重要的作用,有可能作为治疗糖尿病、肿瘤等疾病的靶点。
WangJX等研究发现,敲除miR-103/107基因的表达降低炎症因子TNF-α和IL-1β的表达。
提示miR-103/107参与炎症的发生。
而益生菌的治疗降低血清中炎症因子TNF-α的水平。
说明益生菌可能通过下调miR-103/107的表达,降低炎症因子。
研究显示:
长链非编码RNAH19能直接结合miR-103,限制其表达。
氧化应激产生的H2O2能降低H19基因的表达。
高脂饮食引起肠道大肠杆菌增多,产生内毒素血症,增加游离脂肪酸的形成,诱导氧化应激,H2O2生成增多。
提示高脂饮食可能通过降低H19的表达,增强miR-103的表达,参与炎症及胰岛素抵抗等疾病的发生。
Dicer酶是成熟miRNAs形成的关键酶,内毒素通过激活NF-kβ/p65,增加Dicer酶的活性,使miR-103的形成增多。
肠道菌群失调,引起内毒素血症,增加游离脂肪酸及NF-kβ/p65的活性。
过多的游离脂肪酸诱发氧化应激,H2O2增多,下调H19的表达,对miR-103的抑制减弱,增强其表达;NF-kβ/p65的活性增强,导致Dicer酶表达增强,miR-103形成增多及TNF-α表达减少。
同时,miR-103下调Dicer酶表达,减弱对TNF-α的抑制作用。
因此,当miR-103过表达时,诱导炎症反应,增加炎症因子TNF-α和IL-1β的表达[1-4]。
见图1
研究证实,高脂肪喂养的大鼠出现内毒素血症、血清中促炎性细胞因子水平升高,肠道菌群失调,胰岛素抵抗,肝细胞高表达miR-103,给予多酚可降低其表达。
本课题组近来研究了miR-103/miR-107与胰岛素抵抗、2型糖尿病并绝经后乳腺癌及非酒精脂肪肝的相关性。
根据上述研究资料,本课题组申请者推测:
糖尿病患者存在菌群失调,补充双歧杆菌四联活菌片后改善肠道菌群,使肠道大肠杆菌数量减少,降低内毒素血症及游离脂肪酸水平,减轻氧化应激及NF-kβ/p65的活性,降低了血清中miR-103表达及TNF-a的水平,改善胰岛素抵抗,降低血糖及糖尿病相关的并发症及合并症。
申请者拟通过下列实验进行验证:
随机双盲安慰剂平行对照研究,筛选80例2型糖尿病患者,随机给予安慰剂及双歧杆菌四联活菌片制剂,治疗12周,观察糖尿病患者大便菌群结构、血清中内毒素、游离脂肪酸、miR-103、TNF-α、血糖、HbA1c等指标的变化,研究肠道菌群与2型糖尿病的关系及相关性的机制。
参考文献
1.Kim,K.A.;Gu,W.;Lee,I.A.;Joh,E.H.;Kim,D.H.Highfatdiet-inducedgutmicrobiotaexacerbatesinflammationandobesityinmiceviatheTLR4signalingpathway.PLoSOne2012,7,e47713.
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4.北京大学基础医学院徐国恒教授探明细菌内毒素升高血浆游离脂肪酸的机。
《北京大学学报:
医学版》2009,2:
211.
二、研究内容和预期成果
1.课题的研究内容和重点解决的关键问题
1.1研究内容
选择2型糖尿病患者为研究对象,在原有治疗方案的基础上,补充双歧杆菌四联活菌片,检测大便菌群、血清中内毒素、游离脂肪酸、miR-103、TNF-α、HbA1c、血糖、胰岛素等指标,研究肠道菌群与2型糖尿病的关系及分子机制。
1.2重点解决的关键问题
1.2.1双歧杆菌四联活菌片治疗糖尿病患者的机理及依据
研究发现,糖尿病患者存在肠道菌群失调,主要为双歧杆菌及乳酸杆菌减少;高脂饮食诱导肠道菌群失调,内毒素血症,引起炎症反应,导致胰岛素抵抗,启动了2型糖尿病的发生。
本次试验用的双歧杆菌四联活菌片是一种厌氧菌与需氧菌结合制成的复方微生态制剂,要成分为婴儿双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌和蜡样芽胞杆菌。
其中婴儿双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌属于人体胃肠道的正常菌群,可在胃肠道形成生物屏障,抑制某些致病菌的繁殖,减少细菌毒素的产生及代谢产物的吸收。
蜡样芽胞杆菌属于非人体胃肠道的正常菌群,可在胃肠道中定植并消耗氧气,为婴儿双歧杆菌等其他厌氧菌营造适宜环境,促进其生长和繁殖。
四种菌联用能补充人体正常菌群,促进生理性细菌的生长,迅速重建菌群平衡,维持肠道正常功能,坚固肠生物屏障,阻止致病菌定植和入侵,刺激抗原,提高机体免疫力。
1.2.2益生菌的干预及要求
采用随机安慰剂平行对照研究有利于分析益生菌对糖尿病患者的肠道菌群及血清中miR-103表达的变化,但从伦理学角度考虑,对糖尿病血糖控制不达标者,应及时调整治疗方案,防止并发症的发生。
由于选择的研究对象为2型糖尿病,自身胰岛还残存部分功能,且血糖为轻度不达标者,密切随访病人血糖及症状的变化,短期内病人不会发生急性和慢性并发症。
2.预期成果和提供方式、推广应用预测(如应用基础研究应说明其科学意义和应用前景)
2.1预期成果和提供方式
1)双歧杆菌四联活菌片改善2型糖尿病患者胰岛素的敏感性;
2)双歧杆菌四联活菌片降低血糖及HbA1c;
3)双歧杆菌四联活菌片降低2型糖尿病患者血清中炎症因子TNF-α的水平;
4)双歧杆菌四联活菌片通过改善肠道菌群,降低内毒素血症、游离脂肪酸,TNF-α的水平,下调miR-103的表达。
5)在国内核心期刊发表论文2-3篇,在国际期刊发表SCI论文1-2篇。
2.2推广应用的预测
我国糖尿病的发病率达到11.6%,已成为重大的公共卫生问题,直接影响了人们的生活质量及寿命。
糖尿病患者存在菌群失调,益生菌治疗改善肠道菌群,提示糖尿病患者