Northern 杂交试验计划报告.docx

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Northern杂交试验计划报告

Northern杂交试验

一植物总RNA的提取

1）．准备工作

（1）RNase-free水的制备：

用去离子水加DEPC（焦碳酸二乙酯），使其终浓度为0.01%，过夜搅拌，121℃高温灭菌30min，烘干备用。

（2）枪头及离心管：

用含0.1%的DEPC的去离子水浸泡过夜，枪头盒及装离心管的容器用三氯甲烷擦拭2贬，121℃高温灭菌30min，烘干备用。

（3）研钵及其他所需玻璃器皿：

在180℃烘箱中烘烤4h.

（4）80%的乙醇：

用RNase-free配置即可。

（5）所使用的移液枪及其他无法灭菌的仪器均使用三氯甲烷擦拭几遍。

（6）所用到的其他试剂：

异丙醇和无水乙醇都应该是未开封的。

（7）其他所用到的溶液均用DEPC水配制。

主意：

试验操作整个过程中都要带上口罩和手套，接触到有可能造成RNase污染的物品时要黄手套，操作尽量迅速。

2）．实验步骤

（1）将-80℃保存的拟南芥植株称量后（约200mg）迅速转移至用液氮与人的研钵中，加入液氮，不间断的研磨植物组织直至成细粉末即可。

（2）加入400微升BufferR-I,继续研磨直至样品完全融化，并且裂解液呈透明状。

（3）见匀浆液转移至离心管中，加入150微升的BufferR-II，漩涡振荡15s/次，2次。

（4）12000rpm4℃离心5min。

（5）小心吸取上清液，转移新的离心管中（切勿吸取沉淀）。

（6）12000rpm4℃离心5min。

（7）加入250微升异丙醇，盖紧离心管盖，上下颠倒混匀，放置5min。

（8）转移溶液于复合离心管的内管中，6000rpm4℃离心1min。

（9）弃滤液，加入500微升BufferW1A于复合离心管的内管中，12000rpm,4℃离心1min。

（10）弃滤液，加入700微升BufferW2于复合离心管的内管中，12000rpm,4℃离心1min。

重复一次相同的操作。

（11）弃滤液，12000rpm,4℃离心1min。

（12）将内管转移到一新的离心管中，往内膜中央加100微升BufferTE。

室温放置1min后，12000rpm,4℃离心1min，洗脱液即为所提取的植物总RNA。

注：

脱盐液以上用到的溶液（试剂盒提供）

BufferR-I：

细胞裂解液

BufferR-II：

平衡液

BufferW1A：

清洗液，须实验前加相应量无水乙醇后使用

BufferW2：

，须实验前加相应量无水乙醇后使用

BufferTE：

10mMTris-HCl,0.1mMEDTA,PH7.5

RNA样品质量分析：

完整的总RNA样品应呈现出三条条带，分别为28SrRNA、18SrRNA、5SrRNA。

其中28SrRNA条带的亮度应约为18SrRNA条带亮度的2倍，这表明RNA样品比较完整，基本无降解。

如果两条带的亮度反过，则说明RNA样品已发生降解。

如果在点样槽内或槽附近有荧光区带，则表明RNA样品中有DNA污染。

植物总RNA中28SrRNA及来18SrRNA在变性胶上的迁移率相当于分子量5.1kb及2.0kbRNA的迁移率，以此可作为分子量的参考。

3）mRNA的纯化及cDNA的合成

（1）纯化

①DNaseI处理（DNaseI,RNaseFree）

在微量离心管中配制下列反应也，全量200微升。

总RNA50ug

10×DNaseIBuffer20ul

DNaseI（RNase-Free，5U/ul）8ul

RNaseInhibitor（40U/ul）2ul

DEPCH2Oupto200ul

37℃恒温，650rpm震荡反应30min（eppendorf,Thermomixercompact）

（以下用E.Z.N.A.TMmRNAEnrichmentkit,R6511-01进行纯化）

②加200ulmRNABindingbuffer,混匀。

③转移混合液于含50mgoligo（dT）纤维素的离心管中，充分混匀。

④70℃水浴孵育3min。

⑤室温26℃，1200rpm振荡孵育30min。

⑥将泥装混合物转入复合离心管的内管中，26℃，12000rpm离心1min。

⑦弃去外管中的滤液，加500ulMrnaWashingBuffer于内管中，用力上下颠倒混匀，26℃，1200rpm振荡孵育30min。

⑧弃去外管中的滤液。

转移内管于新的外管中，加400ulmRNAElutionBuffer（70℃预热）与内管中，用力上下颠倒混匀，26℃，12000rpm离心1min。

，收集滤除液于新的2ml离心管重中，重复相同一次操作。

⑨加1/10体积的3MNaAc（PH5.2）于洗脱液中，混匀。

再加入等体积异丙醇，混匀，-20℃放置30min.12000rpm，4℃离心30min。

⑩弃去上清液，12000rpm，4℃离心1min，用微量枪头吸去残留乙醇，通风橱，室温放置2到5min。

用20ulRNase-Free溶解。

（2）cDNA合成

（用PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit,TaKaRa,CodeD6110A,进行反转录）

A反转录

①在Microtube管中配制下列混合液

总RNA150ug

OligodTPrimer（50uM）1ul

dNTPMixture（10mM）1ul

DEPCH2Oupto10ul

混匀，PCR仪上按下列条件进行变性、退火反应

65℃5min,冰上急冻。

②在上述Microtube管中配制下列反转录反应液

上述变性、退火后反应液10ul

RNase-FreedH204.5ul

5×PrimeScriptTMBuffer4ul

RNaseInhibitor（40U/ul）0.5ul

PrimeScriptTMRTase（200U/ul）1ul

混匀，PCR仪上按下列条件进行反转录反应。

42℃60min

70℃15min1cycles

4℃hoid

BcDNA（反转录产物）的pcr检测

用takarataqTM,20ul体系，拟南芥基因组DNA为对照，cDNA为模板PCR产物检测：

用1.5%琼脂糖凝胶，10ulPCR产物加2ul6Xloadingbuffer上样，100V恒压电泳25min。

二、Northern印迹杂交

1原理知识及所用试剂

A．探针准备

DIG标记的RNA探针与DNA探针相比，显示较强的杂交信号和较地的非特异性背景，因此，只要可能选用RNA探针可以比DNA探针获得更好的杂交结果。

如果必须使用DNA探针，建议使用高SDS杂交缓冲液或DIGEasyHyb以减少背景。

在正式杂交试验之前，优化杂交探针浓度是避免颜色背景所必须的。

探针浓度的确定可通过模拟杂交进行。

取一小片空白膜，将其浸入不同探针浓度的溶液中（如：

1μl/ml、3μl/ml、5μl/ml…），可观察到背景颜色的浓度即可作为杂交探针浓度。

在采用荧光检测或采用CSPD化学发光检测时，建议试验探针浓度50－100ng/ml，如果采用CDP-Star化学发光检测，由于灵敏度很高，在此探针浓度下会产生很高的背景，因此，要适当降低探针浓度。

B.印迹条件

对于1%的变性琼脂糖胶向尼龙膜上印迹转膜，在10×和20×的SSC盐浓度下可以获得相同的结果，转膜时间是在4℃或室温下过夜。

C.试剂及其配制

MOPS缓冲液（10×）:

200mmol/LMOPS（pH7.0）（3-（N-吗啉基）丙磺酸）

50mmol/LNaAc

10mmol/LEDTA

配置方法：

准确称取41.86gMOPS,6.8gNaAc,3.72gEDTA，先用适量的用DEPC处理的水溶解NaAc，再将MOPS溶解其中，再加入已用同样方法处理水溶解的EDTA，混匀后用2mol/LdNaOH将调整pH至7.0，最后定溶至1000ml，过滤灭菌后避光保存。

上样染料：

50%甘油，

1mmol/LEDTA，

0.4%溴酚蓝，

0.4%二甲苯蓝

甲醛（37%溶液，13.3mol/L）

适量核酸染料（1ml染料中加5微升）。

染液：

0.5mol/LNaAc（pH5.2）

0.04%的亚甲蓝甲酰胺（去离子）

70%乙醇

SSC（20×）：

3mol/LNaCl（175g/L）

0.3mol/L柠檬酸三钠

用1mol/LHCl调整至pH7.0

Denhardt溶液（100×）：

0.1%Ficoll400（聚蔗糖400）+0.1%PVP（聚乙烯基吡咯烷酮）+0.1%BSA，用DEPC处理水溶解，定容至500ml，过滤后分装成每份25ml，于-20℃保存。

预杂交溶液：

5×SSC

5×Denhardt溶液

50%（w/v）甲酰胺

1%（w/v）SDS

杂交溶液：

探针用预杂交液稀释成适当浓度

2×洗膜缓冲液：

2×SSC加入0.1%SDS

0.5×洗膜缓冲液：

0.5×SSC加入0.1%SDS

0.1×洗膜缓冲液：

0.1×SSC加入0.1%SDS

2RNA变性琼脂糖凝胶电泳

（1）．将制胶用具用DEPC水冲洗一次，再用70%乙醇冲洗一遍，晾干备用。

每一步操作都要戴上手套，以免RNase的污染。

（2）．在通风橱中安置好电泳槽和成胶槽及其梳子，因为在灌胶过程中有甲醛蒸气释放出来，刺激眼睛。

配置琼脂糖凝胶：

称取0.5g琼脂糖，置于干净的烧瓶中，加入40ml蒸馏水，微波炉内加热溶化均匀。

（3）．待胶凉至60-70℃时，依次向其中加入9ml甲醛、5ml10×MOPS缓冲液，混合均匀后立即灌胶（注意避免产生气泡）。

拔出梳子前，在胶面上加入适量的1×MOPS缓冲液（电泳缓冲液）覆盖胶面，小心拔出梳子使样品孔保持完好。

（4）．样品制备：

取DEPC处理过的500μl小离心管，依次加入10×MOPS缓冲液2μl、甲醛3.5μl、甲酰胺（去离子）10μl、RNA样品4.5μl，混合均匀；将离心管置于60℃水浴中保温10min.，再置于冰上2min.；向每管中加入3μl上样染料，混匀。

（5）．上样：

将制备好的凝胶放入电泳槽中（上样孔一侧靠近阴极），加入电泳缓冲液（1×MOPS缓冲液），液面高出胶面1～2mm。

用微量移液器将制备好的样品加入加样孔，每孔上样20～40μl。

（6）．电泳：

盖上电泳槽，接通电源，样品端接负极，于7.5V/ml2的电压下电泳2小时左右，当溴酚蓝到达凝胶底部时停止电泳。

电泳结束后，即可在紫外灯下检测结果

3转膜

（1）．在一个标准变性凝胶电泳完成后，凝胶用DEPC-H2O淋洗，以除去甲醛，然后置于2×SSC（20×SSC用DEPC-H2O稀释）中浸泡15～30min.。

（2）．构建转移平台：

在塑料盒上横放一块玻璃板，玻璃板应比塑料盒长，但比塑料盒窄。

剪一块与盒子等宽但长度是盒子长度2倍的滤纸，将其横放在玻璃板上，滤纸两头垂入盘中，用20×SSC浸湿滤纸，并向盘中加入足量的20×SSC。

（3）．用锋利的小刀将凝胶边缘无用部分修去，并在靠加样孔的一放左上角切去一小块作为凝胶方位的记号。

将凝胶置于平台中央，用玻棒滚动除去气泡，然后用石蜡膜封住凝胶四周边缘，避免覆盖样品部位。

（4）．剪一片与凝胶暴露面同样大小的尼龙膜，在无RNase的水中浸泡5min.，然后将其放置在凝胶上面，膜的一条边缘应刚好重叠覆盖于加样孔的边缘。

膜置于凝胶表面后即不应轻易挪动，膜与凝胶之间不应留有气泡。

（5）．取两张与尼龙膜同样大小的滤纸，用20×SSC浸湿后置于膜的上方，用玻棒赶出气泡。

切一叠略小于滤纸的纸巾，将其置于滤纸上方，在纸巾上平放一玻璃板，然后在玻璃板上压一重物，室温下转膜4～6小时或4℃过夜。

在转膜过程中，要保证塑料盘中有足够的20×SSC，当纸巾浸湿后，要及时更换。

（6）．拆卸转膜装置，翻转凝胶和膜使凝胶的一面朝上，置于一张干的滤纸上，用软铅笔在膜上标记凝胶加样孔的位置。

（7）．取下凝胶，用2×SSC洗膜，再置于两张干滤纸上使膜晾干。

（8）．紫外交联：

将膜置于一可透过紫外线的塑料保鲜膜中，将有RNA的一面朝下，用紫外透射仪照射5min。

带正电荷的尼龙膜适度照射可促进RNA上小部分碱基与尼龙膜表面带正电荷的胺基形成交联结构，从而增强杂交信号。

但过度照射确会使RNA上更大一部分胸腺嘧啶共价结合于尼龙膜表面，导致杂交信号减弱。

对于湿润的尼龙膜，总照射剂量为1.5J/cm2，而干燥尼龙膜总照射剂量为0.15J/cm2。

（9）．转膜效果检测：

如果需要，可对转移上RNA的膜进行染色检查转膜效果。

将交联后的膜浸入5%冰醋酸中，于室温浸泡15min.，再将膜转移至亚甲蓝染液中，室温下浸泡5～10min.。

可见明显的5s和18s两条RNA带，mRNA呈现模糊带型。

4．杂交

建议杂交条件：

探针浓度50-100ng/ml，温度68℃过夜。

（1）．将印迹膜置于装有预杂交液的杂交袋中（每100cm2膜20ml预杂交液），封好杂交袋，在设定的杂交温度下预杂交至少1小时。

（2）．将探针在沸水浴中变性10min.（探针一经变性，立即使用），用预杂交液稀释成设定浓度。

（3）．将杂交袋中预杂交液弃去，加入稀释好的含有探针的杂交液，在设定杂交温度条件下（68℃）杂交过夜。

（4）．杂交完成后，将杂交液回收置于一可耐低温又可沸水浴的试管中，贮存于-70℃以备重复使用。

重复使用时，解冻并在68℃下变性10min。

（5）．洗膜：

杂交膜取出后用2×洗膜缓冲液室温下洗膜2次，每次15min.，除去非结合探针以减少背景。

接下来用0.5×洗膜缓冲液洗膜2次，每次15min.，洗膜温度42℃，然后再在0.1×洗膜缓冲液中洗膜2次，每次15min.，洗膜温度68℃。

当探针长度小于100bp时，最后一次的洗膜温度要经过预备试验确定。

5化学发光法生物素标记的探针的检测：

（以下试剂用量以10X10的膜面积为准。

其他面积的膜另行计算）

A.37-50℃水浴完全溶解封闭液（Blockingbuffer）和洗涤液（4×washingbuffer）。

注意：

封闭液和洗涤液必须完全溶解后方可使用，封闭液和洗涤液可以在室温至50℃之间使用，但必须确保这两种溶液中均无沉淀产生，在冬天需特别注意。

B.取一合适的容器加入16ml封闭液，再放入交联过的含有样品的尼龙膜。

在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。

C.取50μlStreptavidin-HRPConjugate加入到16ml封闭液中（1:

300稀释），混匀备用。

D.去除用于尼龙膜封闭的封闭液，加入上一步中配制的16ml含有Streptavidin-HRPConjugate的封闭液。

在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。

E.取40ml洗涤液（4X），加入120mlDEPC水，混匀配制成120ml洗涤液。

F.将尼龙膜转移至另一装有20ml洗涤液（1X）的容器内，在侧摆摇床或水平摇床缓慢上洗涤5分钟，洗涤四次，每次洗涤时间都约为5分钟。

G．将尼龙膜转移至另一装有30ml检测平衡液的容器内，在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动5分钟。

H.取6mlBeyoECLPlusReagentA和6mlBeyoECLPlusReagentB混匀，配制成BeyoECLPlusReagent工作液。

注意：

BeyoECLPlusReagent工作液必须现配现用。

说明：

从本步骤起操作方法和注意事项同Western实验的荧光检测。

I.取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。

立即将膜的样品面向上，放置到处于水平桌面上的洁净容器内或保鲜膜上。

J.在尼龙膜的表面小心加上步骤J配制好的共10mlBeyoECLPlusReagent工作液，使工作液完全覆盖尼龙膜。

室温放置5分钟。

K.取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。

将尼龙膜放在两片保鲜膜或其它适当的透光薄膜中间，并固定于压片暗盒（也称片夹）内。

L.用X光片压片1-5分钟。

可以先压片1分钟，立即显影定影，然后根据结果再调整压片时间；也可以直接分别压片30秒、1、3、5分钟或更长时间，然后一起显影定影观察结果。