Northern 杂交试验计划报告.docx
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Northern杂交试验计划报告
Northern杂交试验
一植物总RNA的提取
1).准备工作
(1)RNase-free水的制备:
用去离子水加DEPC(焦碳酸二乙酯),使其终浓度为0.01%,过夜搅拌,121℃高温灭菌30min,烘干备用。
(2)枪头及离心管:
用含0.1%的DEPC的去离子水浸泡过夜,枪头盒及装离心管的容器用三氯甲烷擦拭2贬,121℃高温灭菌30min,烘干备用。
(3)研钵及其他所需玻璃器皿:
在180℃烘箱中烘烤4h.
(4)80%的乙醇:
用RNase-free配置即可。
(5)所使用的移液枪及其他无法灭菌的仪器均使用三氯甲烷擦拭几遍。
(6)所用到的其他试剂:
异丙醇和无水乙醇都应该是未开封的。
(7)其他所用到的溶液均用DEPC水配制。
主意:
试验操作整个过程中都要带上口罩和手套,接触到有可能造成RNase污染的物品时要黄手套,操作尽量迅速。
2).实验步骤
(1)将-80℃保存的拟南芥植株称量后(约200mg)迅速转移至用液氮与人的研钵中,加入液氮,不间断的研磨植物组织直至成细粉末即可。
(2)加入400微升BufferR-I,继续研磨直至样品完全融化,并且裂解液呈透明状。
(3)见匀浆液转移至离心管中,加入150微升的BufferR-II,漩涡振荡15s/次,2次。
(4)12000rpm4℃离心5min。
(5)小心吸取上清液,转移新的离心管中(切勿吸取沉淀)。
(6)12000rpm4℃离心5min。
(7)加入250微升异丙醇,盖紧离心管盖,上下颠倒混匀,放置5min。
(8)转移溶液于复合离心管的内管中,6000rpm4℃离心1min。
(9)弃滤液,加入500微升BufferW1A于复合离心管的内管中,12000rpm,4℃离心1min。
(10)弃滤液,加入700微升BufferW2于复合离心管的内管中,12000rpm,4℃离心1min。
重复一次相同的操作。
(11)弃滤液,12000rpm,4℃离心1min。
(12)将内管转移到一新的离心管中,往内膜中央加100微升BufferTE。
室温放置1min后,12000rpm,4℃离心1min,洗脱液即为所提取的植物总RNA。
注:
脱盐液以上用到的溶液(试剂盒提供)
BufferR-I:
细胞裂解液
BufferR-II:
平衡液
BufferW1A:
清洗液,须实验前加相应量无水乙醇后使用
BufferW2:
,须实验前加相应量无水乙醇后使用
BufferTE:
10mMTris-HCl,0.1mMEDTA,PH7.5
RNA样品质量分析:
完整的总RNA样品应呈现出三条条带,分别为28SrRNA、18SrRNA、5SrRNA。
其中28SrRNA条带的亮度应约为18SrRNA条带亮度的2倍,这表明RNA样品比较完整,基本无降解。
如果两条带的亮度反过,则说明RNA样品已发生降解。
如果在点样槽内或槽附近有荧光区带,则表明RNA样品中有DNA污染。
植物总RNA中28SrRNA及来18SrRNA在变性胶上的迁移率相当于分子量5.1kb及2.0kbRNA的迁移率,以此可作为分子量的参考。
3)mRNA的纯化及cDNA的合成
(1)纯化
①DNaseI处理(DNaseI,RNaseFree)
在微量离心管中配制下列反应也,全量200微升。
总RNA50ug
10×DNaseIBuffer20ul
DNaseI(RNase-Free,5U/ul)8ul
RNaseInhibitor(40U/ul)2ul
DEPCH2Oupto200ul
37℃恒温,650rpm震荡反应30min(eppendorf,Thermomixercompact)
(以下用E.Z.N.A.TMmRNAEnrichmentkit,R6511-01进行纯化)
②加200ulmRNABindingbuffer,混匀。
③转移混合液于含50mgoligo(dT)纤维素的离心管中,充分混匀。
④70℃水浴孵育3min。
⑤室温26℃,1200rpm振荡孵育30min。
⑥将泥装混合物转入复合离心管的内管中,26℃,12000rpm离心1min。
⑦弃去外管中的滤液,加500ulMrnaWashingBuffer于内管中,用力上下颠倒混匀,26℃,1200rpm振荡孵育30min。
⑧弃去外管中的滤液。
转移内管于新的外管中,加400ulmRNAElutionBuffer(70℃预热)与内管中,用力上下颠倒混匀,26℃,12000rpm离心1min。
,收集滤除液于新的2ml离心管重中,重复相同一次操作。
⑨加1/10体积的3MNaAc(PH5.2)于洗脱液中,混匀。
再加入等体积异丙醇,混匀,-20℃放置30min.12000rpm,4℃离心30min。
⑩弃去上清液,12000rpm,4℃离心1min,用微量枪头吸去残留乙醇,通风橱,室温放置2到5min。
用20ulRNase-Free溶解。
(2)cDNA合成
(用PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit,TaKaRa,CodeD6110A,进行反转录)
A反转录
①在Microtube管中配制下列混合液
总RNA150ug
OligodTPrimer(50uM)1ul
dNTPMixture(10mM)1ul
DEPCH2Oupto10ul
混匀,PCR仪上按下列条件进行变性、退火反应
65℃5min,冰上急冻。
②在上述Microtube管中配制下列反转录反应液
上述变性、退火后反应液10ul
RNase-FreedH204.5ul
5×PrimeScriptTMBuffer4ul
RNaseInhibitor(40U/ul)0.5ul
PrimeScriptTMRTase(200U/ul)1ul
混匀,PCR仪上按下列条件进行反转录反应。
42℃60min
70℃15min1cycles
4℃hoid
BcDNA(反转录产物)的pcr检测
用takarataqTM,20ul体系,拟南芥基因组DNA为对照,cDNA为模板PCR产物检测:
用1.5%琼脂糖凝胶,10ulPCR产物加2ul6Xloadingbuffer上样,100V恒压电泳25min。
二、Northern印迹杂交
1原理知识及所用试剂
A.探针准备
DIG标记的RNA探针与DNA探针相比,显示较强的杂交信号和较地的非特异性背景,因此,只要可能选用RNA探针可以比DNA探针获得更好的杂交结果。
如果必须使用DNA探针,建议使用高SDS杂交缓冲液或DIGEasyHyb以减少背景。
在正式杂交试验之前,优化杂交探针浓度是避免颜色背景所必须的。
探针浓度的确定可通过模拟杂交进行。
取一小片空白膜,将其浸入不同探针浓度的溶液中(如:
1μl/ml、3μl/ml、5μl/ml…),可观察到背景颜色的浓度即可作为杂交探针浓度。
在采用荧光检测或采用CSPD化学发光检测时,建议试验探针浓度50-100ng/ml,如果采用CDP-Star化学发光检测,由于灵敏度很高,在此探针浓度下会产生很高的背景,因此,要适当降低探针浓度。
B.印迹条件
对于1%的变性琼脂糖胶向尼龙膜上印迹转膜,在10×和20×的SSC盐浓度下可以获得相同的结果,转膜时间是在4℃或室温下过夜。
C.试剂及其配制
MOPS缓冲液(10×):
200mmol/LMOPS(pH7.0)(3-(N-吗啉基)丙磺酸)
50mmol/LNaAc
10mmol/LEDTA
配置方法:
准确称取41.86gMOPS,6.8gNaAc,3.72gEDTA,先用适量的用DEPC处理的水溶解NaAc,再将MOPS溶解其中,再加入已用同样方法处理水溶解的EDTA,混匀后用2mol/LdNaOH将调整pH至7.0,最后定溶至1000ml,过滤灭菌后避光保存。
上样染料:
50%甘油,
1mmol/LEDTA,
0.4%溴酚蓝,
0.4%二甲苯蓝
甲醛(37%溶液,13.3mol/L)
适量核酸染料(1ml染料中加5微升)。
染液:
0.5mol/LNaAc(pH5.2)
0.04%的亚甲蓝甲酰胺(去离子)
70%乙醇
SSC(20×):
3mol/LNaCl(175g/L)
0.3mol/L柠檬酸三钠
用1mol/LHCl调整至pH7.0
Denhardt溶液(100×):
0.1%Ficoll400(聚蔗糖400)+0.1%PVP(聚乙烯基吡咯烷酮)+0.1%BSA,用DEPC处理水溶解,定容至500ml,过滤后分装成每份25ml,于-20℃保存。
预杂交溶液:
5×SSC
5×Denhardt溶液
50%(w/v)甲酰胺
1%(w/v)SDS
杂交溶液:
探针用预杂交液稀释成适当浓度
2×洗膜缓冲液:
2×SSC加入0.1%SDS
0.5×洗膜缓冲液:
0.5×SSC加入0.1%SDS
0.1×洗膜缓冲液:
0.1×SSC加入0.1%SDS
2RNA变性琼脂糖凝胶电泳
(1).将制胶用具用DEPC水冲洗一次,再用70%乙醇冲洗一遍,晾干备用。
每一步操作都要戴上手套,以免RNase的污染。
(2).在通风橱中安置好电泳槽和成胶槽及其梳子,因为在灌胶过程中有甲醛蒸气释放出来,刺激眼睛。
配置琼脂糖凝胶:
称取0.5g琼脂糖,置于干净的烧瓶中,加入40ml蒸馏水,微波炉内加热溶化均匀。
(3).待胶凉至60-70℃时,依次向其中加入9ml甲醛、5ml10×MOPS缓冲液,混合均匀后立即灌胶(注意避免产生气泡)。
拔出梳子前,在胶面上加入适量的1×MOPS缓冲液(电泳缓冲液)覆盖胶面,小心拔出梳子使样品孔保持完好。
(4).样品制备:
取DEPC处理过的500μl小离心管,依次加入10×MOPS缓冲液2μl、甲醛3.5μl、甲酰胺(去离子)10μl、RNA样品4.5μl,混合均匀;将离心管置于60℃水浴中保温10min.,再置于冰上2min.;向每管中加入3μl上样染料,混匀。
(5).上样:
将制备好的凝胶放入电泳槽中(上样孔一侧靠近阴极),加入电泳缓冲液(1×MOPS缓冲液),液面高出胶面1~2mm。
用微量移液器将制备好的样品加入加样孔,每孔上样20~40μl。
(6).电泳:
盖上电泳槽,接通电源,样品端接负极,于7.5V/ml2的电压下电泳2小时左右,当溴酚蓝到达凝胶底部时停止电泳。
电泳结束后,即可在紫外灯下检测结果
3转膜
(1).在一个标准变性凝胶电泳完成后,凝胶用DEPC-H2O淋洗,以除去甲醛,然后置于2×SSC(20×SSC用DEPC-H2O稀释)中浸泡15~30min.。
(2).构建转移平台:
在塑料盒上横放一块玻璃板,玻璃板应比塑料盒长,但比塑料盒窄。
剪一块与盒子等宽但长度是盒子长度2倍的滤纸,将其横放在玻璃板上,滤纸两头垂入盘中,用20×SSC浸湿滤纸,并向盘中加入足量的20×SSC。
(3).用锋利的小刀将凝胶边缘无用部分修去,并在靠加样孔的一放左上角切去一小块作为凝胶方位的记号。
将凝胶置于平台中央,用玻棒滚动除去气泡,然后用石蜡膜封住凝胶四周边缘,避免覆盖样品部位。
(4).剪一片与凝胶暴露面同样大小的尼龙膜,在无RNase的水中浸泡5min.,然后将其放置在凝胶上面,膜的一条边缘应刚好重叠覆盖于加样孔的边缘。
膜置于凝胶表面后即不应轻易挪动,膜与凝胶之间不应留有气泡。
(5).取两张与尼龙膜同样大小的滤纸,用20×SSC浸湿后置于膜的上方,用玻棒赶出气泡。
切一叠略小于滤纸的纸巾,将其置于滤纸上方,在纸巾上平放一玻璃板,然后在玻璃板上压一重物,室温下转膜4~6小时或4℃过夜。
在转膜过程中,要保证塑料盘中有足够的20×SSC,当纸巾浸湿后,要及时更换。
(6).拆卸转膜装置,翻转凝胶和膜使凝胶的一面朝上,置于一张干的滤纸上,用软铅笔在膜上标记凝胶加样孔的位置。
(7).取下凝胶,用2×SSC洗膜,再置于两张干滤纸上使膜晾干。
(8).紫外交联:
将膜置于一可透过紫外线的塑料保鲜膜中,将有RNA的一面朝下,用紫外透射仪照射5min。
带正电荷的尼龙膜适度照射可促进RNA上小部分碱基与尼龙膜表面带正电荷的胺基形成交联结构,从而增强杂交信号。
但过度照射确会使RNA上更大一部分胸腺嘧啶共价结合于尼龙膜表面,导致杂交信号减弱。
对于湿润的尼龙膜,总照射剂量为1.5J/cm2,而干燥尼龙膜总照射剂量为0.15J/cm2。
(9).转膜效果检测:
如果需要,可对转移上RNA的膜进行染色检查转膜效果。
将交联后的膜浸入5%冰醋酸中,于室温浸泡15min.,再将膜转移至亚甲蓝染液中,室温下浸泡5~10min.。
可见明显的5s和18s两条RNA带,mRNA呈现模糊带型。
4.杂交
建议杂交条件:
探针浓度50-100ng/ml,温度68℃过夜。
(1).将印迹膜置于装有预杂交液的杂交袋中(每100cm2膜20ml预杂交液),封好杂交袋,在设定的杂交温度下预杂交至少1小时。
(2).将探针在沸水浴中变性10min.(探针一经变性,立即使用),用预杂交液稀释成设定浓度。
(3).将杂交袋中预杂交液弃去,加入稀释好的含有探针的杂交液,在设定杂交温度条件下(68℃)杂交过夜。
(4).杂交完成后,将杂交液回收置于一可耐低温又可沸水浴的试管中,贮存于-70℃以备重复使用。
重复使用时,解冻并在68℃下变性10min。
(5).洗膜:
杂交膜取出后用2×洗膜缓冲液室温下洗膜2次,每次15min.,除去非结合探针以减少背景。
接下来用0.5×洗膜缓冲液洗膜2次,每次15min.,洗膜温度42℃,然后再在0.1×洗膜缓冲液中洗膜2次,每次15min.,洗膜温度68℃。
当探针长度小于100bp时,最后一次的洗膜温度要经过预备试验确定。
5化学发光法生物素标记的探针的检测:
(以下试剂用量以10X10的膜面积为准。
其他面积的膜另行计算)
A.37-50℃水浴完全溶解封闭液(Blockingbuffer)和洗涤液(4×washingbuffer)。
注意:
封闭液和洗涤液必须完全溶解后方可使用,封闭液和洗涤液可以在室温至50℃之间使用,但必须确保这两种溶液中均无沉淀产生,在冬天需特别注意。
B.取一合适的容器加入16ml封闭液,再放入交联过的含有样品的尼龙膜。
在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。
C.取50μlStreptavidin-HRPConjugate加入到16ml封闭液中(1:
300稀释),混匀备用。
D.去除用于尼龙膜封闭的封闭液,加入上一步中配制的16ml含有Streptavidin-HRPConjugate的封闭液。
在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。
E.取40ml洗涤液(4X),加入120mlDEPC水,混匀配制成120ml洗涤液。
F.将尼龙膜转移至另一装有20ml洗涤液(1X)的容器内,在侧摆摇床或水平摇床缓慢上洗涤5分钟,洗涤四次,每次洗涤时间都约为5分钟。
G.将尼龙膜转移至另一装有30ml检测平衡液的容器内,在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动5分钟。
H.取6mlBeyoECLPlusReagentA和6mlBeyoECLPlusReagentB混匀,配制成BeyoECLPlusReagent工作液。
注意:
BeyoECLPlusReagent工作液必须现配现用。
说明:
从本步骤起操作方法和注意事项同Western实验的荧光检测。
I.取出尼龙膜,用吸水纸吸去过多液体。
立即将膜的样品面向上,放置到处于水平桌面上的洁净容器内或保鲜膜上。
J.在尼龙膜的表面小心加上步骤J配制好的共10mlBeyoECLPlusReagent工作液,使工作液完全覆盖尼龙膜。
室温放置5分钟。
K.取出尼龙膜,用吸水纸吸去过多液体。
将尼龙膜放在两片保鲜膜或其它适当的透光薄膜中间,并固定于压片暗盒(也称片夹)内。
L.用X光片压片1-5分钟。
可以先压片1分钟,立即显影定影,然后根据结果再调整压片时间;也可以直接分别压片30秒、1、3、5分钟或更长时间,然后一起显影定影观察结果。