1、Northern 杂交试验计划报告Northern 杂交试验一 植物总RNA的提取1)准备工作 (1)RNase-free水的制备:用去离子水加DEPC(焦碳酸二乙酯),使其终浓度为0.01%,过夜搅拌,121高温灭菌30min,烘干备用。 (2)枪头及离心管:用含0.1%的DEPC的去离子水浸泡过夜,枪头盒及装离心管的容器用三氯甲烷擦拭2贬,121高温灭菌30min,烘干备用。 (3)研钵及其他所需玻璃器皿:在180烘箱中烘烤4h. (4)80%的乙醇:用RNase-free配置即可。 (5)所使用的移液枪及其他无法灭菌的仪器均使用三氯甲烷擦拭几遍。 (6)所用到的其他试剂:异丙醇和无水乙醇
2、都应该是未开封的。 (7)其他所用到的溶液均用DEPC水配制。主意:试验操作整个过程中都要带上口罩和手套,接触到有可能造成RNase污染的物品时要黄手套,操作尽量迅速。2)实验步骤(1)将-80保存的拟南芥植株称量后(约200mg)迅速转移至用液氮与人的研钵中,加入液氮,不间断的研磨植物组织直至成细粉末即可。(2)加入400微升Buffer R-I,继续研磨直至样品完全融化,并且裂解液呈透明状。(3)见匀浆液转移至离心管中,加入150微升的Buffer R-II,漩涡振荡15 s/次,2次。(4)12000rpm 4离心5min。(5)小心吸取上清液,转移新的离心管中(切勿吸取沉淀)。(6)1
3、2000rpm 4离心5min。(7)加入250微升异丙醇,盖紧离心管盖,上下颠倒混匀,放置5 min。(8)转移溶液于复合离心管的内管中,6000rpm 4离心1 min。(9)弃滤液,加入500 微升 Buffer W1A于复合离心管的内管中,12000rpm, 4离心1 min。(10)弃滤液,加入700 微升 Buffer W2于复合离心管的内管中,12000rpm, 4离心1 min。重复一次相同的操作。(11)弃滤液,12000rpm, 4离心1 min。(12)将内管转移到一新的离心管中,往内膜中央加100微升Buffer TE。室温放置1 min后,12000rpm, 4离心1
4、 min,洗脱液即为所提取的植物总RNA。注:脱盐液以上用到的溶液(试剂盒提供) Buffer R-I:细胞裂解液 Buffer R-II:平衡液 Buffer W1A:清洗液,须实验前加相应量无水乙醇后使用 Buffer W2:,须实验前加相应量无水乙醇后使用 Buffer TE:10 mM Tris-HCl,0.1 mM EDTA,PH 7.5RNA样品质量分析:完整的总RNA样品应呈现出三条条带,分别为28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA。其中28S rRNA条带的亮度应约为18S rRNA条带亮度的2倍,这表明RNA样品比较完整,基本无降解。如果两条带的亮度反过,则说明R
5、NA样品已发生降解。如果在点样槽内或槽附近有荧光区带,则表明RNA样品中有DNA污染。植物总RNA中28S rRNA及来18S rRNA在变性胶上的迁移率相当于分子量5.1kb及2.0kb RNA的迁移率,以此可作为分子量的参考。3)mRNA的纯化及cDNA的合成 (1)纯化 DNase I 处理(DNase I,RNase Free) 在微量离心管中配制下列反应也,全量200微升。总RNA 50ug 10DNase I Buffer 20ulDNase I(RNase-Free,5U/ul) 8ulRNase Inhibitor(40 U/ul) 2ulDEPC H2O up to 200u
6、l37恒温,650rpm震荡反应30min(eppendorf,Thermomixer compact)(以下用E.Z.N.A.TM mRNA Enrichment kit,R6511-01 进行纯化) 加200ul mRNA Binding buffer,混匀。 转移混合液于含50mg oligo (dT)纤维素的离心管中,充分混匀。 70水浴孵育3min。 室温26,1200rpm振荡孵育30min。 将泥装混合物转入复合离心管的内管中,26,12000rpm离心1min。 弃去外管中的滤液,加500ul Mrna Washing Buffer于内管中,用力上下颠倒混匀,26,1200rp
7、m振荡孵育30min。 弃去外管中的滤液。转移内管于新的外管中,加400ul mRNA Elution Buffer(70预热)与内管中,用力上下颠倒混匀,26,12000rpm离心1min。,收集滤除液于新的2ml离心管重中,重复相同一次操作。 加1/10体积的3M NaAc(PH5.2)于洗脱液中,混匀。再加入等体积异丙醇,混匀,-20放置30min. 12000rpm,4离心30min。弃去上清液,12000rpm,4离心1min,用微量枪头吸去残留乙醇,通风橱,室温放置2到5min。 用 20ul RNase-Free溶解。(2)cDNA合成(用 PrimeScriptTM 1st S
8、trand cDNA Synthesis Kit,TaKaRa,Code D6110A,进行反转录)A 反转录 在Microtube 管中配制下列混合液总RNA 150ugOligo dT Primer(50uM) 1uldNTP Mixture(10mM) 1ulDEPC H2O up to 10ul混匀,PCR仪上按下列条件进行变性、退火反应65 5min,冰上急冻。 在上述Microtube 管中配制下列反转录反应液 上述变性、退火后反应液 10ul RNase-Free dH20 4.5ul5PrimeScriptTM Buffer 4ulRNase Inhibitor(40 U/ul
9、) 0.5ulPrimeScriptTM RTase(200U/ul) 1ul混匀,PCR仪上按下列条件进行反转录反应。42 60min70 15min 1 cycles4 hoidB cDNA(反转录产物)的pcr检测用takara taqTM ,20ul 体系,拟南芥基因组DNA为对照,cDNA 为模板PCR产物检测:用1.5%琼脂糖凝胶,10ul PCR 产物加2ul 6X loading buffer 上样,100V恒压电泳25min。 二、Northern 印迹杂交1 原理知识及所用试剂A 探针准备DIG标记的RNA探针与DNA探针相比,显示较强的杂交信号和较地的非特异性背景,因此,
10、只要可能选用RNA探针可以比DNA探针获得更好的杂交结果。如果必须使用DNA探针,建议使用高SDS杂交缓冲液或DIG Easy Hyb以减少背景。在正式杂交试验之前,优化杂交探针浓度是避免颜色背景所必须的。探针浓度的确定可通过模拟杂交进行。取一小片空白膜,将其浸入不同探针浓度的溶液中(如:1l/ ml、3l/ ml、5l/ ml ),可观察到背景颜色的浓度即可作为杂交探针浓度。在采用荧光检测或采用CSPD化学发光检测时,建议试验探针浓度50100ng/ml,如果采用CDP-Star化学发光检测,由于灵敏度很高,在此探针浓度下会产生很高的背景,因此,要适当降低探针浓度。B. 印迹条件对于1%的变
11、性琼脂糖胶向尼龙膜上印迹转膜,在10和20的SSC盐浓度下可以获得相同的结果,转膜时间是在4或室温下过夜。C. 试剂及其配制MOPS缓冲液(10): 200mmol/L MOPS ( pH 7.0 )(3-(N-吗啉基)丙磺酸) 50mmol/L NaAc 10mmol/L EDTA配置方法:准确称取41.86g MOPS, 6.8g NaAc, 3.72g EDTA,先用适量的用DEPC处理的水溶解NaAc,再将MOPS溶解其中,再加入已用同样方法处理水溶解的EDTA,混匀后用2mol/Ld NaOH将调整pH 至7.0,最后定溶至1000ml,过滤灭菌后避光保存。上样染料: 50%甘油,1
12、mmol/L EDTA,0.4%溴酚蓝,0.4%二甲苯蓝甲醛(37%溶液,13.3mol/L)适量核酸染料(1ml染料中加5微升)。染液: 0.5mol/L NaAc(pH 5.2)0.04%的亚甲蓝甲酰胺(去离子)70%乙醇SSC(20): 3mol/L NaCl (175g/L) 0.3mol/L 柠檬酸三钠 用1mol/L HCl调整至pH 7.0Denhardt溶液(100): 0.1% Ficoll 400(聚蔗糖400) + 0.1% PVP(聚乙烯基吡咯烷酮) +0.1% BSA,用DEPC处理水溶解,定容至500ml,过滤后分装成每份25ml,于-20保存。预杂交溶液: 5 S
13、SC 5 Denhardt 溶液 50%(w/v) 甲酰胺 1%(w/v) SDS杂交溶液:探针用预杂交液稀释成适当浓度2洗膜缓冲液:2SSC 加入0.1% SDS0.5洗膜缓冲液:0.5 SSC加入0.1% SDS0.1洗膜缓冲液:0.1 SSC加入0.1% SDS2 RNA变性琼脂糖凝胶电泳(1)将制胶用具用DEPC水冲洗一次,再用70%乙醇冲洗一遍,晾干备用。每一步操作都要戴上手套,以免RNase的污染。(2)在通风橱中安置好电泳槽和成胶槽及其梳子,因为在灌胶过程中有甲醛蒸气释放出来,刺激眼睛。配置琼脂糖凝胶:称取0.5g琼脂糖,置于干净的烧瓶中,加入40ml蒸馏水,微波炉内加热溶化均匀
14、。(3)待胶凉至60-70时,依次向其中加入9ml甲醛、5ml 10MOPS缓冲液,混合均匀后立即灌胶(注意避免产生气泡)。拔出梳子前,在胶面上加入适量的1MOPS缓冲液(电泳缓冲液)覆盖胶面,小心拔出梳子使样品孔保持完好。(4)样品制备:取DEPC处理过的500l小离心管,依次加入10MOPS缓冲液2l、甲醛3.5l、甲酰胺(去离子)10l、RNA样品4.5l,混合均匀;将离心管置于60水浴中保温10min.,再置于冰上2min.;向每管中加入3l上样染料,混匀。(5)上样:将制备好的凝胶放入电泳槽中(上样孔一侧靠近阴极),加入电泳缓冲液(1MOPS缓冲液),液面高出胶面12mm。用微量移液
15、器将制备好的样品加入加样孔,每孔上样2040l。(6)电泳:盖上电泳槽,接通电源,样品端接负极,于7.5V/ml2的电压下电泳2小时左右,当溴酚蓝到达凝胶底部时停止电泳。电泳结束后,即可在紫外灯下检测结果3 转膜(1)在一个标准变性凝胶电泳完成后,凝胶用DEPC-H2O淋洗,以除去甲醛,然后置于 2SSC(20SSC用DEPC-H2O稀释)中浸泡1530min.。(2)构建转移平台:在塑料盒上横放一块玻璃板,玻璃板应比塑料盒长,但比塑料盒窄。剪一块与盒子等宽但长度是盒子长度2倍的滤纸,将其横放在玻璃板上,滤纸两头垂入盘中,用20SSC浸湿滤纸,并向盘中加入足量的20SSC。(3)用锋利的小刀将
16、凝胶边缘无用部分修去,并在靠加样孔的一放左上角切去一小块作为凝胶方位的记号。将凝胶置于平台中央,用玻棒滚动除去气泡,然后用石蜡膜封住凝胶四周边缘,避免覆盖样品部位。(4)剪一片与凝胶暴露面同样大小的尼龙膜,在无RNase的水中浸泡5min.,然后将其放置在凝胶上面,膜的一条边缘应刚好重叠覆盖于加样孔的边缘。膜置于凝胶表面后即不应轻易挪动,膜与凝胶之间不应留有气泡。(5)取两张与尼龙膜同样大小的滤纸,用20SSC浸湿后置于膜的上方,用玻棒赶出气泡。切一叠略小于滤纸的纸巾,将其置于滤纸上方,在纸巾上平放一玻璃板,然后在玻璃板上压一重物,室温下转膜46小时或4过夜。在转膜过程中,要保证塑料盘中有足够
17、的20SSC,当纸巾浸湿后,要及时更换。(6)拆卸转膜装置,翻转凝胶和膜使凝胶的一面朝上,置于一张干的滤纸上,用软铅笔在膜上标记凝胶加样孔的位置。(7)取下凝胶,用2SSC洗膜,再置于两张干滤纸上使膜晾干。(8)紫外交联:将膜置于一可透过紫外线的塑料保鲜膜中,将有RNA的一面朝下,用紫外透射仪照射5min。带正电荷的尼龙膜适度照射可促进RNA上小部分碱基与尼龙膜表面带正电荷的胺基形成交联结构,从而增强杂交信号。但过度照射确会使RNA上更大一部分胸腺嘧啶共价结合于尼龙膜表面,导致杂交信号减弱。对于湿润的尼龙膜,总照射剂量为1.5 J/cm2,而干燥尼龙膜总照射剂量为0.15 J/cm2。(9)转
18、膜效果检测:如果需要,可对转移上RNA的膜进行染色检查转膜效果。将交联后的膜浸入5%冰醋酸中,于室温浸泡15min.,再将膜转移至亚甲蓝染液中,室温下浸泡510min.。可见明显的5s和18s两条RNA带,mRNA呈现模糊带型。4杂交建议杂交条件:探针浓度50-100ng/ml,温度68过夜。(1)将印迹膜置于装有预杂交液的杂交袋中(每100cm2膜20ml预杂交液),封好杂交袋,在设定的杂交温度下预杂交至少1小时。(2)将探针在沸水浴中变性10min.(探针一经变性,立即使用),用预杂交液稀释成设定浓度。(3)将杂交袋中预杂交液弃去,加入稀释好的含有探针的杂交液,在设定杂交温度条件下(68)
19、杂交过夜。(4)杂交完成后,将杂交液回收置于一可耐低温又可沸水浴的试管中,贮存于-70以备重复使用。重复使用时,解冻并在68下变性10min。(5)洗膜:杂交膜取出后用2洗膜缓冲液室温下洗膜2次,每次15min.,除去非结合探针以减少背景。接下来用0.5洗膜缓冲液洗膜2次,每次15min.,洗膜温度42,然后再在0.1洗膜缓冲液中洗膜2次,每次15min.,洗膜温度68。当探针长度小于100bp时,最后一次的洗膜温度要经过预备试验确定。5 化学发光法生物素标记的探针的检测:(以下试剂用量以10X10的膜面积为准。其他面积的膜另行计算)A. 37-50水浴完全溶解封闭液(Blocking buf
20、fer)和洗涤液(4washing buffer)。注意:封闭液和洗涤液必须完全溶解后方可使用,封闭液和洗涤液可以在室温至50之间使用,但必须确保这两种溶液中均无沉淀产生,在冬天需特别注意。B. 取一合适的容器加入16ml封闭液,再放入交联过的含有样品的尼龙膜。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。C. 取50l Streptavidin-HRP Conjugate加入到16ml封闭液中(1:300稀释),混匀备用。D. 去除用于尼龙膜封闭的封闭液,加入上一步中配制的16ml含有Streptavidin-HRP Conjugate的封闭液。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。E. 取40
21、ml洗涤液(4X),加入120ml DEPC水,混匀配制成120ml洗涤液。F. 将尼龙膜转移至另一装有20ml洗涤液(1X)的容器内,在侧摆摇床或水平摇床缓慢上洗涤5分钟,洗涤四次,每次洗涤时间都约为5分钟。G将尼龙膜转移至另一装有30ml检测平衡液的容器内,在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动5分钟。H. 取6ml BeyoECL Plus Reagent A和6ml BeyoECL Plus Reagent B混匀,配制成BeyoECL Plus Reagent工作液。注意: BeyoECL Plus Reagent工作液必须现配现用。说明:从本步骤起操作方法和注意事项同Western实验的荧光检测。I. 取出尼龙膜,用吸水纸吸去过多液体。立即将膜的样品面向上,放置到处于水平桌面上的洁净容器内或保鲜膜上。J. 在尼龙膜的表面小心加上步骤J配制好的共10ml BeyoECL Plus Reagent工作液,使工作液完全覆盖尼龙膜。室温放置5分钟。K. 取出尼龙膜,用吸水纸吸去过多液体。将尼龙膜放在两片保鲜膜或其它适当的透光薄膜中间,并固定于压片暗盒(也称片夹)内。L. 用X光片压片1-5分钟。可以先压片1分钟,立即显影定影,然后根据结果再调整压片时间;也可以直接分别压片30秒、1、3、5分钟或更长时间,然后一起显影定影观察结果。
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