小鼠MDSC能够促进Th17细胞的分化和EAE.docx

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小鼠MDSC能够促进Th17细胞的分化和EAE

小鼠CD11b+Gr-1+髓源性抑制细胞能够促进

Th17细胞的分化和实验性自身免疫性脑脊髓炎

髓源性抑制细胞（MDSCs）是近年来研究肿瘤介导的免疫抑制的焦点。

然而，它在Th17细胞分化和自身免疫性疾病（例如多发性硬化）的发病机制中的作用尚未阐明。

我们研究发现实验性自身免疫脑脊髓炎（EAE）小鼠的发病过程与CD11b+Gr-1+的MDSCs的高表达紧密相关，体外实验显示出T细胞的抑制功能。

出乎意料的是，在Th17极化的条件下MDSCs能够高效地促进初始的CD4+T细胞前体变成Th17细胞。

Th17细胞显著增加，IL-17A产生增高，还有孤核受体RORA和RORC的表达上调证明了这一点。

机制研究表明IL-1β是MDSCs促进Th17细胞分化的主要介质，它依赖CD4+T细胞上的IL-1受体，而不是MDSCs。

使用吉西他滨选择性地耗尽MDSCs可以显著的减轻EAE的病情（例如降低临床评分和髓磷脂损伤），这与淋巴组织和脊髓中Th17细胞和炎症性细胞因子（IL-17A和IL-1β）的减少相关。

在吉西他滨治疗后转入MDSCs能够恢复EAE病情的发展。

总之，我们首先证明MDSCs过度和延长的表达能够驱动Th17细胞的反应和EAE的发病。

这些新的发现为MDSCs功能多向性提供了独特视角，帮助阐明Th17/IL-17依赖的自身免疫性疾病中MDSCs免疫抑制的失效。

CD4+的T细胞通过诱导关键的细胞因子和环境刺激下分化成许多亚群从而在免疫应答中发挥至关重要的作用。

Th17细胞是新的被鉴定的炎症性CD+的T细胞亚群，它的特征是产生标志性的细胞因子IL-17（1，2）。

体外小鼠CD4+的初始细胞分化成Th17细胞需要CD3-和CD28-介导的刺激以及IL-6或IL-21和TGF-β的存在（3）。

人类CD4+的初始细胞分化成Th17细胞同样需要IL-6和TGF-β（3–7）。

近年来研究表明IL-1β在人类和小鼠Th17细胞早期分化和Foxp3+T细胞转化成产生IL-17的细胞中发挥重要作用（8，9）。

新的证据表明人类Th17细胞和IL-17与自身免疫性疾病的发病过程有关，包括多发性硬化（MS），类风湿性关节炎，炎症性肠病和银屑病（10）。

髓源性抑制细胞（MDSCs）是过去几年肿瘤研究的热点（11，12）。

MDSCs最初被描述为荷瘤小鼠中具有免疫抑制功能的骨髓前体来源的未成熟的异种细胞。

MDSCs的免疫抑制活性高度多向性，包括多种机制（13）。

在小鼠中，MDSCs最具特征的是CD11b+Gr-1+的细胞，这群细胞根据功能不同又分为不同的亚群。

人类MDSCs定义为Lin—HLA-DRlow/—CD33+（16），或CD11b+CD14—CD33+（17）。

据报道，MDSCs能够使体内初始的CD4+变成表达Foxp3+的调节性T细胞（Tregs）（18，19）。

MDSCs在肿瘤病程中减弱免疫反应的功能已有纪录（13，20）。

在肿瘤中分支杆菌诱导的感染，MDSCs大量表达（21），MS小鼠模型（22）表明在炎症条件下，MDSCs具有潜在的调节功能。

然而它们在炎症性自身免疫异常的病理过程中的特殊作用尚未阐明。

虽然MDSCs和Th17细胞代表两类主要的炎症性细胞，在条件伴随下与炎症相关，但是这两类细胞功能上的联系没有得到验证。

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是研究人类多发性硬化（MS）具有代表性的良好的特征性小鼠模型，它通过给小鼠免疫致脑炎的髓磷脂抗原来诱导，即加了佐剂的髓磷脂少突神经胶质细胞糖蛋白（MOG）（23）。

Th17细胞和IL-17在中枢神经系统慢性炎症的发病过程中的重要作用已有良好记录（24，26）。

在这篇报道中，我们证明EAE小鼠的发病过程伴随着Th17细胞和MDSCs的增加。

我们发现在IL-1β依赖的Th17极化条件的模式下，MDSCs能够促进Th17细胞的的分化和IL-17A大量产生。

我们首先证明了在体内吉西他滨清除MDSCs后能够显著地减少Th17细胞，并且改善EAE的病情严重性。

进一步研究表明在吉西他滨治疗后的小鼠转入MDSCs能够促进EAE病情的发展，它需要MDSC来源的IL-1β的产生。

我们的数据确立了MDSCs在慢性炎症中调节小鼠Th17细胞反应的重要作用，提示这群细胞可以作为Th17细胞/IL-17介导的免疫病理学的独特靶点。

材料与方法

小鼠

从国家癌症学会（Bethesda，MD）获得的C57BL/6小鼠。

从杰克逊实验室（BarHarbor，ME）获得的IL-1R1基因敲除小鼠（il1r12/2）和B6129F2小鼠。

所有包含小鼠的实验和操作得到了弗吉利亚联邦大学实验动物管理和使用委员会的许可。

抗体和试剂

荧光染料结合的抗体，包括：

BioLegend（SanDiego，CA）公司的FITC–CD4（GK1.5），PE–CD11b（M1/70），PE/Cy5–Gr-1（RB6-8C5），PE–Foxp3（MF-14），PE–IFN-γ（XMG1.2），和Percp/Cy5.5–IL-17A（TC11-18H10.1），CD16/CD32（2.4G2），大鼠同型对照IgG2b（RTK4530）和IgG1（RTK2071）。

购自BioLegend公司的小鼠IL-17A和IL-2ELISA试剂盒。

eBioscience（SanDiego，CA）公司PE标记的抗-RORγt（AFKJS-9）抗体，小鼠IFN-γ和IL-1βELISA试剂盒。

Invitrogen（Carlsbad，CA）公司Alexa594标记的驴抗大鼠的二抗IgG。

BDBiosciences（SanDiego，CA）公司纯化的的大鼠抗小鼠抗-CD11b抗体，免疫荧光染色使用的生物素结合的抗-Gr-1单克隆抗体。

EAE诱导和评估

免疫小鼠采用在第0天背部两侧皮下注射按1:

1乳化的200μgMOG35–55肽（ProSpec，EastBrunswick，NJ）和含有4mg/ml热灭活结核分枝杆菌H37RA的弗氏完全佐剂（CFA）。

第0天和第2天，在小鼠腹腔注射200ng百日咳毒素（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）。

小鼠第一次免疫后采用盲法监测EAE的严重性和按照0–5级评分：

0分，未发病；0.5分，尾部张力降低；1分，尾部无力和瘫痪；2分，尾部无力和一个后肢瘫痪；3分，双后肢瘫痪；4分，后肢完全瘫痪和前肢无力。

5分，发病状态。

发病和评分每天测量一次。

吉西他滨治疗，EAE小鼠MOG35–55免疫后第4，8，12，16天，按照100mg/kg腹腔注射8mg/ml吉西他滨（LCLaboratories，Woburn，MA）。

免疫后10天收集血清标本，23天后收集脊髓标本。

组织学和免疫荧光

首先给小鼠灌注预冷的PBS，然后心脏灌注4%的多聚甲醛，切除脊髓与椎骨。

颈胸部脊髓石蜡包埋切片采用HE染色检测细胞浸润或Luxol固蓝/碘酸雪夫检测脱髓鞘。

免疫荧光染色采用二甲苯脱蜡（2×5分钟），100%乙醇（2×3分钟），95%乙醇（1分钟）和70%乙醇（1分钟）脱水，然后用蒸馏水冲洗，把脊髓切片（5mm）放入柠檬酸盐缓冲液（10mM，pH6）平衡3分钟，再用微波炉热抗原修复10分钟，室温冷却，PBS–Tween20漂洗。

血清封闭60分钟，切片染一抗Gr-1（1:

10），CD4（1:

100），IL-1β（1:

50）和IL-17A（1:

50），4℃过夜。

Alexa594标记的驴抗大鼠的IgG二抗室温孵育1小时。

孵育同型对照的抗体作为阴性染色的对照。

使用Vectashield封片介质（VectorLaboratories，Burlingame，CA）封片，加盖玻片，OlympusBX41荧光显微镜（Tokyo，Japan）成像。

流式细胞术分析

表面染色，取脾脏、淋巴结细胞、脊髓单个核细胞制备单细胞悬液。

FACS缓冲液（含0.1%BSA和0.04%EDTA-Na2的PBS）重悬细胞，用抗小鼠CD16/CD32单克隆抗体（2.4G2；BDBiosciences）封闭，然后用荧光标记的抗体或相应的同型对照在冰上孵育30分钟。

胞内细胞因子染色，用MOG35-55（1μg/ml）刺激细胞，37˚C，5%CO2过夜，然后用PMA（10nM；Sigma-Aldrich）和ionomycin（1μM；EMDBiosciences）处理5小时。

最后3小时在培养液中加入BrefeldinA（BioLegend）。

先在细胞表面染FITC标记的抗-CD4单克隆抗体，4˚C孵育30分钟，然后固定，破膜，再染PerCp/Cy5.5结合的抗-IL-17A单克隆抗体，或PE结合的IFN-γ，或PE标记的抗-RORγt单克隆抗体，4˚C孵育30分钟。

按照厂家的说明染Foxp3。

细胞内IL-1β染色，脾脏细胞加入brefeldinA，37˚C，5%CO2培养4小时。

先在细胞表面染FITC标记的CD11b和PE标记的Gr-1单克隆抗体，4˚C孵育30分钟，然后固定，破膜，再染APC标记的IL-1β单克隆抗体，4˚C孵育30分钟。

使用BDFACSCalibur流式细胞仪分析，然后用FlowJo软件（TreeStar，Ashland，OR）分析数据。

分离脊髓单个核细胞

小鼠灌注25ml包含2mMEDTA的预冷的PBS，两个完整的脊髓混合在一起作为一组，将脊髓切成小片，加3ml1×HBSS在Dounce玻璃匀浆器中匀浆。

收集细胞，用80μm网目的滤网过滤，加Percoll，18˚C梯度（70/30%）离心（500×g）30分钟。

从30/70%界面收集单个核细胞，用FACS缓冲液或T细胞培养液洗涤，重悬，下一步实验使用。

MDSCs和亚群的分离

使用CD11b磁珠（MiltenyiBiotec，Auburn，CA）得到纯化的EAE小鼠脾脏来源的MDSCs。

大约98%CD11b+细胞Gr-1+，CD11b+Gr-1+细胞的纯度大于95%。

在某些实验中，使用BDBiosciencesFACSAriaII细胞分选仪从脾脏分选CD11b+Gr-1+细胞，从骨髓中分选CD11b+Gr-1low和CD11b+Gr-1high的细胞。

MDSCs免疫抑制和细胞因子检测

调节脾细胞数（2×105细胞/孔），与纯化的MDSCs以不同的比例（如图所示）在96孔板中共培养72小时，板包被了1μg/ml抗-CD3单克隆抗体（145-2C11；BioXcell，WestLebanon，NH）和0.5μg/ml可溶性的抗-CD28单克隆抗体（37.51；BioLegend）。

在孵育的最后16小时使用0.5μCi/孔[3H]胸腺嘧啶脱氧核苷酸。

细胞增殖采用在三个孔掺入[3H]胸腺嘧啶脱氧核苷酸，使用LS6500多用途闪烁计数器（BeckmanCoulter）测量。

细胞培养48小时后收集上清，用ELISA法按照厂家的说明检测细胞因子IL-2和IFN-γ的水平。

体外Th17细胞分化

用FACS分选CD4＋CD25－CD62Lhigh的初始T细胞（纯度98%），5×105细胞/孔，板包被了5μg/ml抗-CD3单克隆抗体和1μg/ml可溶性的抗-CD28单克隆抗体（37.51；BioLegend），在24孔板中同时加入2.5ng/mlhTGF-β（Peprotech，RockyHill，NJ），20ng/mlmIL-6（Peprotech），5μg/ml抗–IFN-γ（MG1.2；BioXcell），和抗–IL-4（11B11;；BioLegend）单克隆抗体。

第0天按照1:

1（MDSC/T细胞）把MDSCs加入到培养基中。

细胞在三个孔中培养，RPMI1640培养基加10%FCS，50mM2-巯基乙醇和2mML-谷氨酸/1%青霉素/链霉素。

刺激3天后收集上清，用ELISA法按照厂家的说明检测细胞因子IL-17A和IL-1β的水平。

洗涤细胞，用PMA、离子霉素和Golgi-stop刺激4小时，然后胞内染产生IL-17A和IFN-γ的CD4+细胞。

使用Foxp3染色试剂盒（eBioscience）染胞内Foxp3。

使用CFSE稀释法测定细胞增殖。

在某些实验中加入10ng/mlIL-1β（BioLegend），30mg/mlIL-1β单克隆抗体（BioLegend），200ng/mlIL-1受体拮抗剂（IL-1ra；ProSpec），或10mg/ml抗-TGF-β单克隆抗体（BioLegend）。

实时定量PCR分析

使用TRIzol试剂（Invitrogen）从脾脏、淋巴结、脊髓、培养的Th17细胞中提取总的RNAs。

用RNase-freeDNaseI（Invitrogen）处理RNA消除基因组DNA污染，然后用紫外分光光度计（AmershamBioscience，Piscataway，NJ）测含量。

用RevertAidMMLVReverseTranscriptase（Ferments，GlenBurnie，MA）合成cDNA，20μl反应体系包含1μg总RNA和50ngoligo-deoxy-thymidine引物（Invitrogen）。

定量PCR，使用TaqManUniversalPCRMasterMix（AppliedBiosystems，FosterCity，CA）试剂，ABI7900HT序列检测系统检测il17a，rora，rorc和il1b。

AppliedBiosystems预开发分析试剂提供的引物和FAM标记标记的探针集合：

il17a，Mm00439618_m1；rora，Mm00443103_m1；rorc，Mm01261022_m1；il1b，Mm01336189_m1。

PCR开始50℃2分钟，94℃15分钟变性，然后94℃15秒变性，60℃退火，延伸1分钟，40个循环。

所有的测量做3个复孔，重复3次。

目的基因表达水平与管家基因gapdh进行相对定量，然后与对照组用2（－ΔΔCT）标准化计算。

细胞过继转移

EAE小鼠来源的MDSCs在过继转移之前用caspase-1抑制剂（100μM;CaymanChemical）处理或不处理。

用MOG35–55/CFA免疫C57BL/6小鼠（n=5），发病开始后每隔4天用吉西他滨处理，吉西他滨处理4天后静脉注射MDSCs（8×106）过继给小鼠，每周两次。

EAE发病过程开始，记录临床评分。

统计分析

用Prism软件（GraphPad，SanDiego，CA）进行统计分析。

数据用均值±SEM表示。

用双侧非配对t检验比较两组数据。

多余两组的用ANOVA检验各组之间的差别。

P值＜0.05具有统计学意义。

结果

EAE发病过程中Th17细胞和MDSCs的增加

Th17细胞在自身免疫性疾病（如EAE）的发病过程中发挥重要作用。

EAE诱导后，用流式细胞术胞内染色分析EAE小鼠脾脏CD4+T细胞产生IL-17A的百分比（Fig.1A，顶部）。

脾脏（Fig.1A，中间）和外周血（Fig.1A，底部）中Th17细胞伴随着CD11b+Gr-1+MDSCs的增加而增加。

EAE小鼠发病过程中外周血CD11b+Gr-1+的增加具有时间依从性（Fig.1B）。

EAE小鼠CD11b+Gr-1+表型细胞的增加与肿瘤中非常类似。

这群细胞又可以分为两个亚群，即CD11b＋Ly6ChighLy6G－和CD11b＋Ly6ClowLy6G＋，相应的是单核细胞样髓源性抑制细胞（M-MDSCs）和粒细胞样髓源性抑制细胞（G-MDSCs），在EAE发病过程中分别或同时增加（SupplementalFig.1A，1B）。

光散射特征和形态学分析支持了表型相似性。

MDSCs与炎症性单核细胞相比，它表达F4/80和CD80（27），这样的髓样细胞不表达CD11c和MHC-Ⅱ两种标志，与未成熟或未分化的细胞类似（SupplementalFig.1C）。

然而它们与炎症性单核细胞共同表达某些表型特征，例如CD115，CCR2，和CD62L（SupplementalFig.1D）。

这群CD11b+Gr-1+的细胞在功能上与何瘤宿主类似，它与TCR结合或抗原（MOG35–55）特异性地刺激后能够高活性地抑制T细胞的增殖和细胞因子（IFN-γ和IL-2）的产生（Fig.1C–E，SupplementalFig.1E–G）。

这些结果与最近的一篇报道类似，在EAE炎症过程中，CD11b＋Ly6C＋的细胞增加，而且具有潜在的抑制T细胞活化的能力（22）。

因此，CD11b+Gr-1+的细胞（自此以后称之为MDSCs）在EAE小鼠外周淋巴组织浓缩和聚集，可能在Th17反应中发挥调节作用。

图1．MDSCs在EAE发病过程中显著增高并且显示出抑制T细胞的活性。

（A）用MOG/CFA免疫C57BL/6小鼠（n=5），然后注射百日咳毒素来诱导EAE。

EAE诱导23天后用流式细胞术检测脾脏（SP）CD4+的细胞中产生IL-17A的Th17细胞的比率。

同时检测脾脏和外周血（PB）CD11b+Gr-1+的MDSCs的百分比。

图中所示的具有代表性的直方图来自具有相似结果的至少三次独立实验。

（B）EAE发病过程中CD11b+Gr-1+MDSCs的动态变化。

（C）MDSCs展现出免疫抑制活性，抑制T细胞的增殖。

用磁珠从EAE小鼠中分选MDSCs与脾细胞共培养，并且用抗-CD3/CD28单克隆抗体以指定的比例刺激72小时。

用[3H]胸腺嘧啶（TdR）核素掺入法评估细胞增殖。

**p＜0.005（MDSCs与没有MDSCs对比）。

（D和E）MDSCs抑制IFN-γ和IL-2的产生。

MDSCs与脾细胞共培养并且用抗-CD3/CD28单克隆抗体刺激后，用ELISA法检测培养上清中IFN-γ（D）和IL-2（E）的水平。

结果代表三次独立实验。

**p＜0.005（MDSCs与没有MDSCs对比）。

MDSCs在Th17极化的条件下促进Th17细胞的分化

为了确定MDSCs对Th17细胞潜在的作用，我们用MACS磁珠分选的MDSCs和体内获得的初始的CD4+CD25－CD62L+的T细胞在Th17极化的培养基（包含IL-6，TGF-β，抗–IFN-γ和IL-4单克隆抗体，板包被了抗-CD3单克隆抗体和可溶性的抗-CD28单克隆抗体）中培养3天。

MDSCs的存在使CD4+IL-17A+阳性的Th17细胞显著增加，而CD4+IFN-γ+的Th1细胞和CD4+Foxp3+的Tregs细胞不增加。

Th17细胞增加的比率与用CFSE稀释试验和培养基中Th17细胞绝对数增加的变化证实的Th17细胞增加相关（Fig.2B）。

上清液中细胞因子IL-17A蛋白质水平的升高也证明了MDSCs促进Th17细胞的极化（Fig.2C），这与Th17细胞分化过程中il17a和rora基因转录的增加相关，实时PCR分析（Fig.2D）证明了这一点。

流式细胞术分析结果显示MDSCs促进RORγt蛋白水平的增加，RORγt是决定Th17细胞分化的关键转录因子（Fig.2E）。

接下来我们评估了初始的CD4+T细胞与MDSCs以不同的比例共培养时MDSCs促进Th17细胞极化的效率。

在1:

4时MDSCs仍然能有效的增强Th17细胞的分化（Fig.2F）。

在后一段时间点加入MDSCs，它促进Th17细胞分化的作用降低，提示MDSCs在Th17细胞分化的早期发挥作用。

用MACS磁珠和细胞分选的MDSCs在促进Th17细胞极化的过程中发挥相似的作用（SupplementalFig.2A）。

值得注意的是肿瘤中增加的MDSCs在体外同样高效地促进Th17细胞的分化（SupplementalFig.2B）。

MDSCs除了促进Th17细胞的极化还能促进分化的Th17细胞增殖和IL-17A的产生（SupplementalFig.2C–E）。

小鼠中MDSCs主要分为两个亚群，即CD11b+Gr-1low和CD11b+Gr-1high，分别是单核细胞样和粒细胞样MDSCs（29，30），我们比较这两群细胞促进Th17细胞分化的能力，发现CD11b+Gr-1low细胞比CD11b+Gr-1high细胞促进Th17细胞的极化更有效（Fig.2G）。

图2.在IL-6和TGF-β存在的条件下MDSCs高效地促进Th17细胞的分化（A）初始的CD4+CD25－CD62L+的T细胞（5×105/孔，24孔板）加入MDSCs和不加入MDSCs在Th17极化的培养基中培养3天。

洗涤细胞，用PMA和离子霉素还有布雷菲德菌素A刺激，然后用流式细胞术胞内染色检测IL-17A和IFN-γ的表达水平。

同样用流式细胞术分析CD4+Foxp3+的细胞。

（B）培养3天后，CD4+IL-17A+细胞的百分比（左边）和CD4+IL-17A+的细胞总数（右边）。

加入或不加MDSCs，在Th17细胞极化的条件下，使用CFSE稀释分析法（中间）检测细胞增殖。

（C）共培养3天后收集上清，用ELISA法分析IL-17A。

（D）实时定量PCR检测il17a或roarmRNA的相对表达水平。

（E）流式细胞术胞内染色检测Th17细胞分化过程中RORγt的表达水平（顶部，灰色填充的，同型对照；虚线，未加MDSCs；实线，加了MDSCs）。

加入MDSCs后CD4+RORC+T细胞比率的变化（底部）。

*p＜0.01。

（F）MDSCs与CD4+CD25－CD62L+T细胞以不同的比例共培养。

分析Th17细胞的比率（顶部）和IL-17A的水平（底部）。

（G）CD11b＋Gr-1lowTh17极化更有效。

CD11b＋Gr-1low或CD11b＋Gr-1high与初始的CD4+的T细胞共培养。

分析Th17细胞的比率和IL-17A的水平来检测Th17细胞的极化。

实验结果来自三次独立重复实验。

IL-1β介导的MDSCs促进Th17细胞的分化，这个过程需要T细胞上IL-1受体

接下来我们研究MDSCs促进Th17细胞的分化的潜在因素。

据报道小鼠Th17极化需要IL-6和TGF-β（31，32）。

最初我们将初始的CD4+的T细胞与MDSCs共培养，加入TGF-β和IL-6，或只加IL-6，或只加TGF-β。

缺乏外源性的TGF-β阻断了MDSCs促进Th17细胞的分化，Th17细胞和IL-17A降低（Fig.3A，3B，左边）。

然而低水平的Th17细胞和IL-17A在MDSCs存在的MDSC-T细胞培养基中仍能检测到（Fig.3A，3B，左边）。

使用TGF-β封闭抗体在IL-6存在的培养基中干扰MDSCs的作用（Fig.3B，右边）。

先前已有报道MDSCs介导的TGF-β的表达（33，34），MDSCs能够部分补偿外源性TGF-β的缺失。

与此鲜明对比的是缺乏外源性的IL-6能够完全消除MDSCs存在下Th17细胞的极化（Fig.3A，3B，左边），提示了这种细胞因子在Th17细胞谱系定型中无法补偿的作用。

根据最近报道的IL-1信号在Th17细胞早期分化中的重要作用（9，35，36），我们检测了IL-1β在MDSCs增强Th17细胞分化中的作用。

使用中和抗体封闭IL-1β，显著地减少了Th17细胞的比率（Fig.3C），培养上清IL-17A水平显著降低也反应了这点（Fig.3D）。

在IL-1受体拮抗剂存在的情况下自然发生抑制IL-1β，同样使MDSC诱导的IL-17A产量降低（Fig.3E）。

在Th17极化培养系统加入MDSCs比不加