ProteinAProteinG与抗体的结合.docx
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ProteinAProteinG与抗体的结合
Protein-A-、Protein-G-与抗体的结合
Protein A 、Protein G 与抗体的结合
1ProteinASepharose、rProteinASepharose亲和层析介质与抗体的结合
目前，约70-80%的抗体纯化使用ProteinA、ProteinG亲和层析。
蛋白A（ProteinA）来源于金黄色葡萄球菌的一个株系，它含有5个可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合的结构域。
蛋白A作为亲和配基被偶联到琼脂糖基质上，可以特异性的和样品中的抗体分子结合，而使其他杂蛋白流穿，具有极高的选择性，一步亲和层析就可达到超过95%的纯度。
1个蛋白A分子至少可以结合2个IgG。
蛋白A也可以结合另一些免疫球蛋白，如用于某些种属的IgA、IgM的纯化。
天然（NativeProteinA）和重组的蛋白A（rProteinA）对于IgG的Fc段有着相似的特异结合。
重组的蛋白A经改造后含有一个C末端半胱氨酸，可以单一位点偶联于琼脂糖上，降低了空间位阻，增加了与IgG的结合能力。
蛋白A与IgG的结合强度很大成度上依赖于该抗体的种属和亚型，而其动态结合能力则决定于结合强度（解离常数）及传质阻力等多种因素（例如上样时样品在柱内的停留时间）。
2ProteinGSepharose亲和层析介质与抗体的结合
lgG4
++++
++++
lgM
可变
-
鸡蛋黄
lgY
-
-
牛
++
++++
狗
++
+
山羊
-
++
豚鼠
lgG1
+++
++
lgG2
+++
++
仓鼠
+
++
马
++
++++
考拉
-
+
骆驼
-
+
猴（恒河）
++++
++++
小鼠
lgG1
+
++++
lgG2a
++++
++++
lgG2b
+++
+++
lgG3
++
+++
lgM
可变
-
猪
+++
+++
兔
++++
+++
大鼠
lgG1
-
+
lgG2a
-
++++
lgG2b
-
++
lgG3
-
++
绵羊
+/-
++
++++=强结合，++=中等结合，-=弱或不结
四、缓冲液配制
建议采用磷酸缓冲液，洗脱后不影响下游的标记。
A缓冲液 1mol/L Na2HPO4.12H2O（MW358.14）………………358.14g
1500mMNaCll（MW68.08g/mol）…………………87.7g
溶于1升水，滤膜过滤
B缓冲液 1mol/LNaH2P04（MW156.01）………………………156.01g
1500mMNaCll（MW68.08g/mol）…………………87.7g
溶于1升水，滤膜过滤
C 吸附和洗涤缓冲液
根据所需PH值，按下表3配制。
按照所列比例量取后混合，然后再加9倍体积的水，稀释成应用溶液。
如果洗脱下的抗体有些杂带，可加吐温-20至终浓度0.05%
D 中和缓冲液:
A液77.4ml、B液22.6ml；两液混合成PH7.4的中和缓冲液
E 洗脱液 0.1mol/LNaH2P04（MW156.01）………………………15.601g
150mMNaCll（MW68.08g/mol）………………………8.77g
溶于1升水，滤膜过滤，HCl调整PH至3.0
五、应用举例
A 实验名称：
从小鼠腹水中分离纯化IgG2a
1、重组蛋白G琼脂糖凝胶装柱，柱床体积为1ml，流尽20%乙醇溶液；
2、以缓冲液C平衡5-10个床体积，流速为1ml/min；（缓冲液C配制方法：
取A液35.2ml、B液64.8ml，再加900ml水，混合后PH6.5）.
3、将0.2ml小鼠腹水用缓冲液C稀释到2ml，0.45μm滤膜过滤，上样。
流速为1ml/min；
4、用缓冲液C再洗5-10个床体积，流速为1ml/min；
5、用洗脱液E,洗脱3体积。
6、在洗脱液加入0.2体积中和缓冲液，以PH试纸确认溶液为中性。
溶液太酸，会损伤抗体活性（中和缓冲液配制方法：
A液77.4ml、B液22.6ml；两液混合成PH7.4的中和缓冲液
7、将分离纯化的IgG2a与对照品同时进行SDS-PAGE电泳分析。
8、用纯水流洗10个柱床体积，再用20%的乙醇流洗10个柱床体积，流速为2ml/min，
柱子置于+4~8℃环境中保存
表三，25℃下0.1mol/L磷酸钠缓冲液的配制
pH
A液
1mol/LNa2HPO4（ml）
B液
1mol/LNaH2PO4（ml）
5.8
7.9
92.1
6.0
12.0
88.0
6.2
17.8
82.2
6.4
25.5
74.5
6.6
35.2
64.8
6.8
46.3
53.7
7.0
57.7
42.3
7.2
68.4
31.6
7.4
77.4
22.6
7.6
84.5
15.5
7.8
89.6
10.4
8.0
93.2
6.8
根据比例量取混合，然后在加9倍体积的水，稀释成应用溶液。
B 免疫沉淀（Immunoprecipitation,IP）：
（1）蛋白样品的准备：
1）对于10厘米细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS洗涤一次，然后加入500微升至2毫升细胞裂解液裂解细胞。
3）对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。
4）对于悬浮细胞，离心收集细胞后，PBS洗涤一次，然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。
注：
详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法。
对于不同的培养器材，参考10厘米培养皿的裂解液的用量进行裂解。
如果裂解获得的蛋白样品浓度过高，可以用裂解液或PBS适当稀释，如果蛋白样品浓度过低，在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量。
（2）. 去除非特异性结合（可选做）：
1）.取200微升至1毫升蛋白样品，蛋白量约为200微克至1毫克，加入约1微克和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG和20微升充分重悬的ProteinA+GAgarose，4℃缓慢摇动30分钟至2小时。
2）.2500rpm（约1000g）离心5分钟，取上清用于后续的免疫沉淀。
注：
所谓种属相同的IgG是指，例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG，则在本步骤中可以加入normalmouseIgG，如无normalIgG可以加入其它不影响后续检测的其它mouseIgG类型的抗体。
通过和normalIgG和ProteinA+GAgarose的孵育，可以充分降低非特异性的结合，降低背景。
（3）. 免疫沉淀：
1）.加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗，4℃缓慢摇动过夜。
2）.再加入20微升充分重悬的ProteinA+GAgarose，4℃缓慢摇动1-3个小时。
（为方便后续的洗涤操作可以把加入充分重悬的ProteinA+GAgarose的量调整为40微升。
）
3）.2500rpm（约1000g）离心5分钟，或瞬时高速离心，小心吸除上清，注意宁可留下少量上清也不能吸掉ProteinA+GAgarose。
4）.用准备蛋白样品时的裂解液或PBS洗涤沉淀5次，裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升。
洗涤时离心条件和吸除上清的要求同上面的步骤C3。
5）.完成最后一次洗涤后，去除上清，加入20-40微升1XSDS-PAGE电泳上样缓冲液Vortex重悬沉淀，瞬时高速离心把样品离心至管底。
6）.100℃或沸水浴处理3-5分钟，取部分或全部样品用于SDS-PAGE电泳，暂时不用的样品可以-20℃保存。
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