超高效液相色谱串联质谱法检测辣椒和肉酱中的苏丹红含量.docx
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超高效液相色谱串联质谱法检测辣椒和肉酱中的苏丹红含量
河南省食品高级专家评定
定专业论文
超高效液相色谱-串联质谱联用法
检测辣椒和肉酱中苏丹红I-IV的含量
姓名：
李静
职业：
食品科学与检验
鉴定等级：
高级
单位：
双汇集团
日期：
2014-5-16
超高效液相色谱-串联质谱联用法检测
辣椒和肉酱中的苏丹红I-IV的含量
李静（双汇集团，462000）
摘要：
建立了辣椒和肉酱中苏丹红I、II、III和IV含量的超高效液相色谱-串联质谱联用（UPLC-MS/MS）检测方法。
样品经4%氨水乙腈提取后，经尼龙滤膜过滤，超高效液相色谱-串联质谱法检测。
本方法中苏丹红I、II、III的定量限为1μg/kg，苏丹红IV的定量限为5μg/kg，线性范围为1-50ng/mL；在苏丹红I-IV添加水平为10-50μg/kg时，辣椒样品中苏丹红I、II、III和IV的回收率分别为88%-104%、85%-104%、85%-118%和64%-75%，肉酱样品中苏丹红I、II、III和IV的回收率分别为105%-120%、77%-117%、84%-112%和62%-73%。
关键词：
苏丹红；超高效液相色谱-串联质谱联用；辣椒；肉酱
引言：
苏丹红是一种偶氮类合成工业染料，常用于溶剂、汽油以及鞋、地板等的增色。
苏丹红Ⅰ早在1995年就被确认为致癌物，苏丹红Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ也怀疑具有致癌性[1]。
中国和欧盟等全球多数国家都禁止用于食品生产，但有不少食品生产企业为改善色泽、降低成本仍将其作为食用色素，因此，建立苏丹红的快速、准确的检测方法至关重要。
目前，苏丹红的检测方法主要包括液相色谱法（HPLC）[2-4]、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）[1]和液相色谱-串联质谱联用法（LC-MS/MS）[5-8]等，前处理方法主要包括中性氧化铝柱净化[2]和GPC净化[4]等方法。
由于GPC净化比较费时，且产生大量废液；而中性氧化铝柱净化具有操作复杂，实验条件要求苛刻，结果重现性差，回收率不稳定等缺点。
因此，本文采用提取液直接稀释上样，结合UPLC-MS/MS的高灵敏度、准确定性定量和检测快速等优势，建立了一种应用UPLC-MS/MS法测定复杂基质辣椒和肉酱中苏丹红含量的定性定量分析和确证方法。
本方法操作简单，检测快速，灵敏度高，检出限低，结果准确可靠。
1材料与方法
1.1主要仪器
XevoTQMS超高效液相色谱-串联质谱联用仪（美国Waters公司）；电子天平（瑞士MettlerToledo公司）；VX-III型多管平行振荡器（北京Targin公司）；KQ-500DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；GL-21M型离心机（湖南湘仪离心机有限公司）；氮气发生器（英国PEAK公司）.
1.2试剂和材料
苏丹红I-IV标准品（纯度分别为96.7%、83.3%、91.3%和75.5%，国家标准物质中心）；乙腈、甲酸（美国Fisher公司）；甲酸铵（美国AlfaAesar公司）；氨水（天津科密欧）；辣椒、肉酱（市售）。
1.3标准溶液的配制
1.3.1100μg/mL混合标准储备液分别准确称取10.34mg苏丹红I、12.00mg苏丹红II、10.95mg苏丹红III和13.24mg苏丹红IV标准品于100mL容量瓶中，用丙酮定容，混匀，即为100μg/mL的苏丹红混合标准储备液，4℃冰箱中储存。
1.3.21.0μg/mL混合标准中间液准确吸取1.00mL100μg/mL混合标准储备液于100mL容量瓶中，用甲醇定容，混匀，即为1.0μg/mL的混合标准中间液，储存于4℃冰箱中。
1.3.3混合标准系列用4%氨水乙腈将苏丹红混合标准中间液稀释成1.0、2.0、5.0、10.0、20.0和50.0ng/mL的标准系列。
1.4仪器条件
1.4.1液相色谱条件色谱柱：
WatersBEH-C18柱，2.1×50mm，粒径1.7μm；柱温：
40℃；进样量：
5μL；流动相：
A：
5mmol/L甲酸铵+0.1%甲酸水溶液，B：
乙腈，洗脱梯度见表1所示。
表1罗丹明B流动相的洗脱梯度
时间（min）
流速（mL/min）
A（%）
B（%）
curve
0.0
0.45
30
70
/
2.0
0.45
0
100
线性变化
3.0
0.45
90
10
线性变化
4.0
0.45
30
70
即时变化
1.4.2质谱条件采用ESI+多反应监测（MRM）模式，电离电压3.0kV，源温150℃，雾化气温度450℃，雾化气流量900L/h，锥孔气流量20L/h，碰撞气为高纯氩气，苏丹红I-IV的选择离子多反应监测条件见表2所示。
表2MRM模式下苏丹红I-IV的监测条件
名称
定性离子对
定量离子对
采集时间（s）
锥孔电压（V）
碰撞能量（eV）
苏丹红I
249.25/156.22
249.25/156.22
0.161
20
20
249.25/232.25
13
苏丹红II
277.29/121.23
277.29/121.23
0.078
20
22
277.29/156.20
16
苏丹红III
353.29/156.20
353.29/156.20
0.078
34
20
353.29/196.15
22
苏丹红IV
381.32/106.22
381.32/106.22
0.161
30
24
381.32/156.10
30
1.5样品处理
称取处理均匀的样品2.00±0.01g于50mL聚丙烯离心管中，加入10mL4%氨水乙腈，于多管平行振荡器上振荡提取30min，超声提取15min，7000r/min离心5min，吸取1mL上清液过0.22μm有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱联用仪测定。
2结果与讨论
2.1质谱条件的优化
苏丹红在ESI+电离模式下易得到H+形成较为稳定的[M+H]+的分子离子，本试验对1μg/mL苏丹红混合标准溶液进行全扫描和子离子扫描，获得苏丹红I-IV的母离子扫描图和特征碎片离子扫描图（如附录所示），选择丰度比最强的碎片离子对249.25/156.22、277.29/121.23、353.29/156.20和381.32/106.22分别作为苏丹红I、II、III和IV的定量离子对，丰度比较强的离子对249.25/232.25、277.29/156.20、353.29/196.15和381.32/156.10分别作为苏丹红I、II、III和IV的定性离子对，优化后的多反应监测条件如表2所示。
2.2液相色谱条件的优化
在ESI+电离模式下，为了使苏丹红更容易得到H+，在流动相中加入微量甲酸，可显著提高目标物的检测灵敏度；添加适量铵盐可改善苏丹红的峰型。
为了将色谱柱中的极性和非极性杂质尽可能完全洗脱，从而延长色谱柱使用寿命，本文采用梯度洗脱，最终选用表1中的洗脱程序对目标化合物进行洗脱。
2.3定容液的选择
用纯甲醇、纯乙腈、乙腈+水（1+1，V/V）和甲酸+乙腈+水（2+10+88，V/V/V）定容时，苏丹红III和苏丹红IV均出现双峰，后峰灵敏度是前峰的2-3倍，改用在甲醇或乙腈中加入一定量氨水时，随着氨水比例的增大，前峰越来越小，后峰越来越大，当氨水比例增至4%时，前峰响应变为后峰的1%以下，可以忽略。
考虑苏丹红的非极性较强，且加热处理会对苏丹红IV有较大影响，所以定容液与提取液应保持一致，最终选用4%氨水乙腈定容。
2.4提取试剂的选择[7-8]
本试验对比采用纯乙腈、正己烷和4%氨水乙腈作为提取试剂对苏丹红回收率的影响，试验表明三种提取试剂对苏丹红I、II和III的提取效果差别不大；而采用4%氨水乙腈作为提取试剂时，苏丹红IV的回收率明显上升，这可能因为采用纯乙腈或正己烷提取时，需加热或氮吹置换定容液，而加热和长时间放置对苏丹红IV的稳定性影响很大，综合考虑各方面的影响和操作的方便性，最终选用4%氨水乙腈作为提取试剂。
2.5净化方法的选择
考虑到样品提取后脂肪含量较高，且苏丹红的非极性较强，无法用正己烷去油，本试验选用226免疫亲和柱和中性氧化铝柱净化。
结果表明226免疫亲和柱能吸附50%以上的苏丹红；而采用中性氧化铝柱净化时，在上样的过程中已有90%以上的苏丹红被洗脱，可能是由于中性氧化铝柱的活性不好控制造成，综合考虑回收率和净化效果，结合超高效液相色谱-串联质谱的高灵敏度，最终选用样品不经净化，增大稀释倍数后直接上机。
2.6线性方程和定量限
按1.3.3配制苏丹红标准溶液，按1.4建立的仪器条件进行测定。
分别以定量离子峰面积y对含量x（ng/mL）作标准曲线。
以定量离子对的10倍信噪比为定量限，苏丹红I、II、III的定量限均为0.2ng/mL，苏丹红IV的定量限为1.0ng/mL，采用阴性样品中添加目标化合物的方法，按1.5的方法进行前处理，得到本方法中苏丹红I、II、III的定量限为1μg/kg，苏丹红IV的定量限为5μg/kg。
纯标品和加标试验的总离子流图如附录所示。
2.7加标回收率和精密度
取处理均匀的阴性辣椒和肉酱样品，按表3设计试验。
结果表明，苏丹红I、II、III和IV在辣椒样品中的回收率分别为88%-104%、85%-104%、85%-118%和64%-75%，RSD分别为3.7%-5.8%、3.7%-6.8%、6.0%-7.4%和5.0%-5.9%；在肉酱样品中的回收率分别为105%-120%、77%-117%、84%-112%和62%-73%，RSD分别为2.7%-5.3%、3.3%-7.5%、4.4%-9.9%和3.9%-6.6%。
具体结果如表3所示。
表3苏丹红I-IV的加标回收率和精密度结果
项目
添加
浓度
辣椒片
肉酱
（μg/kg）
回收率（%）
RSD
回收率（%）
RSD
1
2
3
4
5
6
平均
（%）
1
2
3
4
5
6
平均
（%）
苏丹红I
10
94
95
97
104
96
99
97.5
3.7
120
110
106
105
105
108
109.0
5.3
50
96
103
92
88
89
97
94.3
5.8
112
106
114
112
110
108
110.4
2.7
苏丹红II
10
98
95
93
104
85
100
95.8
6.8
110
99
117
96
101
109
105.3
7.5
50
90
95
89
85
87
90
89.5
3.7
83
77
84
81
84
83
82.1
3.3
苏丹红III
10
99
99
112
118
114
106
108.0
7.4
108
111
100
103
112
109
107.1
4.4
50
97
99
95
85
88
97
93.6
6.0
85
89
84
106
96
102
93.8
9.9
苏丹红IV
10
75
67
71
68
67
65
68.6
5.0
69
73
65
70
69
71
69.4
3.9
50
67
75
65
64
67
70
67.9
5.9
70
65
73
62
64
70
67.3
6.6
结束语：
本试验研究了复杂基质辣椒和肉酱中苏丹红I-IV含量的检测方法，采用4%氨水乙腈提取，UPLC-MS/MS测定。
本方法中苏丹红I、II、III的定量限为1μg/kg，苏丹红IV的定量限为5μg/kg，线性范围为1-50ng/mL，辣椒样品中苏丹红I、II、III和IV的回收率分别为88%-104%、85%-104%、85%-118%和64%-75%，肉酱样品中苏丹红I、II、III和IV的回收率分别为105%-120%、77%-117%、84%-112%和62%-73%。
本方法操作简单快速，定性定量准确，检测灵敏度高，检出限低，适用于辣椒和肉酱中苏丹红含量的定性定量分析和确证。
致谢：
感谢孙宝国院士，给予我极大的帮助和指导，为我提供了详尽的资料，使我能够在较短的时间内做专项研究，取得了很大的提高。
感谢双汇集团多年的培养和关爱，给了我研究平台，感谢各位同事的帮助和指导，为我营造了一个积极向上的氛围，使我勇于探索，树立工作目标，取得一个又一个成绩，今后我会在实践工作中更加兢兢业业，做好本职工作，公正客观的检测，为双汇集团把好关，做到一个食品从业者应尽的职责，为社会提供安全放心的美食！
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附录:
图1苏丹红I、II、III和IV的母离子扫描图
图2苏丹红I的子离子扫描图
图3苏丹红II的子离子扫描图
图4苏丹红III的子离子扫描图
图5苏丹红IV的子离子扫描图
图61ng/mL苏丹红I-IV混合标准品中的总离子流图
图7辣椒中苏丹红I-IV加标量为1ng/mL时的总离子流图
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