天然产物开发与利用备课笔记3.docx
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天然产物开发与利用备课笔记3
第三章天然产物的结构鉴定方法及应用
经过提取、分离、纯化得到了单一化合物，就可以进一步研究该化合物的活性作用，或将其用作标准品进行天然产物的定性定量分析，但是在进行这些工作之前，首先必须要确定该化合物的化学结构。
这就比如在进行中草药的提取之前必须要进行原料的来源鉴定一样。
如果化合物的结构鉴定出现错误，必然会影响后面的实验结果。
所以，这一章我们来学习天然有机化合物的结构鉴定。
第一节天然产物结构鉴定的方法及步骤
一、有机化合物结构鉴定的方法
一个复杂化合物的结构鉴定通常需要通过了解其背景信息和光谱技术相结合，最终确定其化学结构式。
1、有机化合物结构鉴定的背景信息
（1）样品的来源和参考文献
与样品来源（例如植物科、属、种等）有关的背景文献，特别是化合物的骨架类型；具体的可参考文献中报道的由该种/属植物中已发现的化合物，这些已知化合物的波谱数据是研究该种/属植物成分结构应该和必须具备的参考资料，同时要注意文献的年代和所使用的仪器以及测定结构的方法学。
（2）样品化合物的理化性质
通常我们经过一系列的提取、分离、纯化和精致得到一个单体化合物，首先要鉴定其外观：
包括它的外形，是晶体、无定形粉末、还是油状物或是胶状物。
此外，还有观察它的颜色，比如说如果一个化合物在日光下就呈现出一定的颜色，如黄色的结晶体或红色的结晶体，那么不通过波谱数据也可以判断出该化合物的共轭程度一定较强，很可能同时存在有羟基、羰基等生色基团。
测定其物理常数：
比如利用熔点仪测定其熔点；如果是光学异构体我们要测定它的旋光度。
此外，通过观察其色谱行为也会为化合物的结构解析提供一定的参考依据。
比如槲皮素比山奈酚在B环上多出一个酚羟基，极性更强，所以其薄层色谱的Rf值更小。
那么，如果槲皮素通过一定的波谱数据已鉴定出化学结构，是一个已知化合物，而山奈酚还是一个未知化合物，通过它们的薄层色谱行为，我们就可以知道山奈酚的极性更小，在化学结构上应该比槲皮素缺少一定的极性基团。
总之，在实际工作中，将有机化合物结构鉴定的背景信息与波谱方法配合使用，有助于取得正确的结果。
2、有机化合物结构鉴定的波谱方法
过去依靠化学方法进行有机化合物的结构测定，其缺点是：
费时、费力、费钱，需要的样品量大。
例如：
鸦片中吗啡碱结构的测定，从1805年开始研究，直至1952年才完全阐明，历时147年。
而现在的结构测定，则采用现代仪器分析法，其优点是：
省时、省力、省钱、快速、准确，样品消耗量是微克级的，甚至更少。
在有机化合物的结构解析中应用最为广泛的波谱方法：
紫外光谱法（ultravioletspectroscopy缩写为UV）、红外光谱法（infraredspectroscopy缩写为IR）、核磁共振法（nuclearmagneticresonance缩写为NMR）和质谱法（massspectroscopy缩写为MS）。
其中最主要的，对有机化合物的结构鉴定帮助最大的就是核磁共振法和质谱法。
波谱法进行结构鉴定的优点是样品用量少，准确快速。
我们知道很多活性成分在药材中的含量其实都很低，一般我们拿出几十公斤的药材进行提取、分离、纯化，最后能得到的单体化合物的含量可能只有几个或几十个毫克。
但是，即使是几个毫克的化合物我们也可以通过波谱法对其进行结构鉴定。
四大波谱中，以质谱的灵敏度最高，所需要的化合物的量也就最少。
（1）紫外吸收光谱法（UV）：
分子吸收波长范围在200-400nm区间的电磁波产生的吸收光谱。
紫外吸收光谱法在化合物结构解析中的应用：
①判断是否芳香环的存在。
②判断是否有共轭体系存在。
该法比较简单，由图谱提供的结构信息也比较少。
相对于核磁共振和质谱数据，紫外-可见光谱法提供的信息处于次要的地位。
（2）红外光谱法（IR）：
用红外光照射有机分子，样品将选择性地吸收那些与其振动频率相匹配的波段，从而产生红外光谱。
红外光谱法在化合物结构解析中的应用：
①官能团的检出。
如有无羟基、羰基等取代基的存在。
②有关芳香环的信息。
③确定炔烃、烯烃，特别是双键类型的判断。
红外光谱图，横坐标：
波数400～4000cm-1；表示吸收峰的位置。
纵坐标：
透过率（T%），表示吸收强度（分子振动引起红外吸收）。
红外光谱法能够提供的有关化合物结构的信息也相对有限。
在20世纪50-70年代，红外光谱法一直是化合物结构鉴定中的重要方法，但随着核磁共振和质谱技术的发展，红外光谱法也已退居到比较次要的位置。
此外，天然产物的化学结构通常比较复杂，单纯通过红外光谱是很难断定其结构的。
一个化合物的红外光谱图中的吸收峰是不必要也不可能全部解释和归属清楚的，但是核磁共振谱图中峰却需要全部解释和归属清楚。
（3）质谱法（MS）
质谱是把带电荷的分子或经一定方式裂解形成的碎片离子按质荷比大小排列而成的图谱。
由于分子离子和碎片离子往往带有一个电荷，因此质谱所给出的信号又表示分子离子或碎片离子的质量。
所以，质谱可以用来测定分子量、分子式，还可以得到一定的离子碎片信息。
为了获得化合物的分子量，质谱法是化合物结构鉴定中不可或缺的一种方法。
电离源（离子源）是指使被测样品的分子离子化成为带电离子的装置。
通常称能够给样品较大能量的电离方法为硬电离方法，而给样品较小能量的电离方法为软电离方法，后一种方法适用于易破裂或易电离的样品。
电子轰击离子源（EI,ElectronIonization）：
当电子轰击源具有足够的能量时，有机物的分子不仅可能失去一个电子形成分子离子，而且有可能进一步发生键的断裂，形成大量的各种低质量数的碎片离子和中性自由基，这些碎片离子可用于有机化合物的结构鉴定。
特点：
技术成熟，使用面广；峰重现性好；离子化效率高，碎片离子多；不适合极性大、热不稳定性化合物；分子量有限，一般≤1,000。
电喷雾电离源（electrosprayionization,ESI）：
被认为是目前最软的电离技术。
ESI技术解决了液相色谱与质谱离子源的接口问题，从而真正实现了LC-MS或LC-MS/MS的联用技术。
当使用正电场时，在ESI温和的条件下样品分子通常带上质子或碱金属离子。
当用负喷雾电场时，通过除去质子或其它阳离子而生成负离子。
所带电荷的多少取决于所得的带正电荷或负电荷的分子中酸性或碱性基团的体积和数量。
通常小分子得到[M+H]+或[M-H]-单电荷离子。
特点：
它是最软的电离技术，通常只产生分子离子峰。
一些脂肪烷醇、单萜类化合物不易产生分子离子峰。
高分辨质谱：
高分辨质谱在测定精确分子量的同时，还能推出分子式，这是有机质谱最大的贡献。
高分辨质谱仪测定分子式是基于高分辨质谱可以测定分子的精密质量，即使是很弱的分子离子峰也可以精密地测出分子离子质量。
各种同位素都有其精密质量，因而不同分子式都有相异的精密质量，故可以根据分子的精密质量确定分子式。
例如：
用低分辨质谱仪测定时，CO、N2、CH2N和C2H4的质量都是28，各个分子离子峰相互重叠，分辨不出来。
而这些分子的精密质量却存在着明显的差异：
CO：
27.9949、N2：
28.0062、CH2N：
28.0187和C2H4：
28.0312，故可以通过高分辨质谱将它们区别开来。
质谱法的缺点：
破坏性分析；仪器昂贵、复杂。
（4）核磁共振技术（NuclearMagneticResongancese,NMR）
核磁共振氢谱（1H-NMR）：
①确定质子总数。
②区分羧酸、醛、芳香族、烯烃、烷烃质子。
③从自旋偶合相互作用研究其相邻的取代基。
核磁共振炭谱（13C-NMR）：
确定碳原子数和碳原子类型。
从13C-NMR宽带去偶谱的吸收峰的个数，可以得出碳原子的个数及类型。
在分子无对称因素的条件下，一条谱线即为一个碳原子。
二维核磁共振谱（2D-NMR）
二、有机化合物波谱解析的步骤
1、收集和整理有关样品结构的背景信息
在进行化合物的结构鉴定之前，有必要尽可能多地获得与样品化学结构有关的各种背景信息，信息量的多寡直接影响结构鉴定工作的速度。
从各种植物中分离得到的化学成分可以说大部分都是已知化合物，只要文献充足，这些化合物的结构鉴定一般都是比较快捷和容易的。
对于一小部分新化合物，大多都是在已知骨架上的取代基不同或者时立体结构不同，已有的文献数据会对这些化合物的结构鉴定起到非常重要的帮助作用。
在研究中遇到全新骨架的新化合物的几率非常低，即使是新骨架的化合物，其中的部分结构单元也往往在其它天然产物结构中出现过。
所以，我们在进行天然有机化合物的结构鉴定时，通常是先对照一下文献中已有化合物的波谱数据，再进行解析，采用对谱和解谱相结合的方式解析化合物的结构。
在实际工作中化合物的解析是一项非常灵活的工作，很多信息都可以帮助你进行结构解析。
那么，下面我们就来具体看一下在进行化合物的结构解析前需要掌握哪些信息以有利于你的结构鉴定工作。
（1）查阅国内外文献，掌握该属或该种植物中已发现化合物的结构信息。
这些已知化合物的波谱数据是研究该种植物中化学成分结构时应该也是必须具备的参考资料。
同时，我们要注意文献的年代和所使用的仪器。
（2）掌握化合物的物理性质。
包括来化合物的物理状态（结晶、无定形粉末、油状物、胶状物等等）、颜色、熔点、旋光性、色谱行为等。
那么，我们通过查阅文献掌握了已知化合物的相关信息后，就要通过一定的实验手段（NMR/MS）获得化合物的结构信息，两者相结合最后确定化合物的结构。
2、分子式及不饱和度的推断
根据质谱得到的分子量，氢谱中得到的氢原子的个数，碳谱中得到的碳原子的个数，我们就可以大致推算出化合物的分子式。
分子式确定后，就可以按下式计算出化合物的不饱和度来：
U=n4+1+（n3-n1）/2
其中n1、n3、n4分别代表分子中一价、三价和四价原子的数目。
当一个化合物衍变为相应的烃后，与其同碳的饱和开链烃比较，每缺少2个氢为1个不饱和度。
所以：
一个双键的不饱和度为1，一个叁键的不饱和度为2，一个环的不饱和度为1，一个苯环的不饱和度为4。
3、结构式的推断
总结所有的官能团和结构片段，并找出各结构单元的关系，提出一种或几种可能存在的结构式。
对于比较复杂的有机化合物的结构鉴定，需要综合各种波谱数据，并将必要的物理、化学性质结合起来进行结构解析。
4、用全部光谱材料核对推定的结构式
①用IR核对官能团。
②用13C-NMR核对碳的类型和对称性。
③用1H-NMR核对氢核的化学位移和它们相互偶合关系。
④用UV核对分子中共轭体系。
⑤用质谱断裂方式证明结构式推断无误。
5、如果是已知化合物，可用标准图谱对照来确定最终的结构式。
第二节天然产物结构鉴定的实例解析
例题1：
试由分子结构式C9H10O的IR和1HNMR谱图来推测其结构。
解：
（1）计算不饱和度：
U=n4+1+（n3-n1）/2U=9+1+（0-10）/2=10-5=5
（2）IR谱图：
1720㎝-1强吸收峰，是羰基的特征峰；有1个不饱和度。
（3）1HNMR谱图：
δ=7.3单峰，5H，单取代苯的的吸收峰；一个苯环有4个不饱和度。
δ=2.2单峰，3H。
δ=3.7单峰，2H。
（4）推断化合物C9H10O的结构式为：
例题2：
从伞形科药用植物亮蛇床（SelinumcryptotaeniumdeBoiss.）中分离得到一个无色结晶化合物，紫外光下显紫色荧光，异羟肟酸铁反应阳性；经波谱测试，数据如下：
UV（EtOH，λmax）吸收峰分别在328，258，240nm。
IR（KBr）：
2980，1730，1606，1490，1456，1230，1110，830。
EI-MSm/z（%）：
328（M+），228，213（100），83，55。
1H-NMR（CDCl3）δ7.67（1H，d，J=9.5Hz），δ7.29（1H，d，J=8.6Hz），δ6.77（1H，d，J=8.6Hz），δ6.17（1H，d，J=9.5Hz），δ6.07（1H，q，J=7.2Hz），δ5.07（1H，t，J=5.2Hz），δ3.24（1H，dd，J=17.8,5.2Hz），δ2.92（1H，dd，J=17.8,5.2Hz），δ1.90（3H，d，J=7.2Hz），δ1.88（3H，brs），δ1.50and1.46（each3H，s）。
13C-NMR（CDCl3）δ165.8，δ159.9，δ155.5，δ152.6，143.2，138.3，126.6，126.2，114.8，111.6，111.2，106.3，75.8，68.8，26.5，24.1，22.3，20.4，14.9试推导其化学结构式，并说明推导的依据和过程。
解：
（1）紫外光下显蓝色荧光，异羟肟酸铁反应阳性，则该化合物可能为香豆素类化合物。
（2）IR具有酯类的特征吸收：
1730。
（3）根据MS给出的分子量328，1H-NMR给出20个氢信号，13C-NMR给出19个碳信号推断化合物的分子式为C19H20O5
（4）计算不饱和度U=n4+1+（n3-n1）/2，U=19+1+（0-20）/2=20-10=10，香豆素母核结构中有7个不饱和度，所以在取代支链中还应该有3个不饱和度（其中一个不饱和度是酯类的羰基双键，另外2个不饱和度有可能是双键或成一个环）。
（5）1H-NMR低场区δ7.67（1H，d，J=9.5Hz），δ7.29（1H，d，J=8.6Hz），δ6.77（1H，d，J=8.6Hz），δ6.17（1H，d，J=9.5Hz）4个氢信号推导出7、8位取代的香豆素。
δ6.07（1H，q，J=7.2Hz），δ5.07（1H，t，J=5.2Hz），δ3.24（1H，dd，J=17.8,5.2Hz），δ2.92（1H，dd，J=17.8,5.2Hz），δ1.90（3H，d，J=7.2Hz），δ1.88（3H，brs），δ1.50and1.46（each3H，s）推导出是角型二氢吡喃香豆素，在3’位有酰氧基取代。
（6）综合分析，推断该化合物的结构如下：
第四章天然产物定性定量分析方法
第一节薄层色谱法在天然产物定性分析中的应用
天然产物的定性分析方法中，目前最常用的就是薄层色谱法。
当然也有其它一些技术应用于天然产物的定性分析，如化学反应法、升华鉴别法、荧光鉴别法、气相色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳、甚至气相-质谱联用技术、高效液相-质谱联用技术等等。
但是由于仪器方面的限制或者其它方面的制约（比如只有具有挥发性的化合物物质才适合用气相色谱法分析），这些方法的应用都不如薄层色谱法普遍。
所以，本节课我们将主要学习薄层色谱技术在天然产物定性分析中的应用。
现今为止，为什么薄层色谱法普遍应用于天然产物的定性分析呢？
首先，我们看一下薄层色谱技术的优点，包括以下几个方面：
设备简单，操作方便，分离快速。
设备简单：
我们只要拥有一块薄层板、一个层析缸、一根毛细管、加上适当的展开剂和显色剂就可以进行薄层色谱技术的操作，而不必一定要配备像高效液相色谱仪、气相色谱仪、质谱仪等昂贵的高级仪器。
操作方便：
应用毛细管进行点样，点样后的薄层板在展开缸中进行适当的预饱和，然后展开，展开到一定高度后，取出，晾干，在日光、一定波长下的紫外光或喷显色剂后进行观察即可；图谱的可视性强，直观，多个样品的图谱能同时观测；根据被分离化合物的性能可以选择不同显色剂或检测方法进行定性或定量分析，并可以重复测定；此外，样品预处理方法较为简单，不必像高效液相色谱法中需要精密的滤过。
分离快速：
一般只需要几分钟即可完成一个样品的展开；在较短时间内能够实现多个样品的平行分离。
总之，薄层色谱法可以将天然产物内所含成分通过分离达到直观、可视化，具有承载信息大、专属性强、快速、经济、操作简便等优点，可作为天然产物鉴别的首选方法。
虽然，薄层色谱法有应用简单的优点。
但是，应用TLC法进行定性分析时仍有以下要求需要大家注意：
（1）在建立方法时，应采用以对照品和对照药材或对照提取物同时进行对照。
当对照品不易获得时，采用以对照药材为对照；不宜采用Rf值表述色谱行为。
比如药典中大黄项下的检测：
另取大黄对照药材0.1g，同法制成对照药材溶液。
再取大黄酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。
供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点，置氨蒸气中熏后，斑点为红色。
（2）供试品溶液的制备应尽可能除去干扰色谱的杂质，同时方法要尽量简便，应视被测物的特性来选择适宜的溶剂和方法进行提取、分离。
以《中国药典》大黄项下的鉴别项目为例，大黄药材供试品溶液的制备方法如下：
取大黄药材粉末0.1g，加甲醇20ml，浸泡1小时（大黄中主要含有蒽醌类成分，且主要为结合蒽醌即蒽醌的苷类，如大黄素葡萄糖苷、大黄酸葡萄糖苷、芦荟大黄素葡萄糖苷、大黄酚葡萄糖苷等等。
甲醇作为一种极性溶剂就可以把这些成分都提取出来），滤过，取滤液5ml，蒸干，残渣加入水10ml使溶解，再加入盐酸1ml，加热回流30分钟（用酸来催化蒽醌苷类成分的水解，转化为苷元-游离型蒽醌和糖），立即冷却，用乙醚分2次震摇提取（萃取蒽醌苷类成分），每次20ml，合并乙醚液，蒸干（为了浓缩），残渣加三氯乙烷1ml使溶解，作为供试品溶液。
（3）为了使图谱清晰，斑点明显，分离度与重现性符合要求，应根据被测物的特性选择合适的固定相、展开剂及显色方法等色谱条件。
（4）由于实验时的温度、湿度常会影响薄层色谱结果，因此，建立方法时应对上述因素进行考察。
有关薄层板的制备中有一些细节问题补充如下：
1、关于配制CMC-Na：
先将称好的CMC-Na加入一定量的水，让其充分溶涨后，再加热煮沸。
CMC-Na溶液的浓度0.3-0.7%比较合适，实际操作中0.4％～0.5％最为实用，如果浓度高了，加热显色过程中稍不小心板子容易发黑；浓度低了，铺出来的板子不结实，轻轻一碰就掉渣，不好保存，而且点样时会容易出洞。
2、关于薄层板的要求：
载板要求平滑清洁，没有划痕，在使用前可用洗涤液或肥皂水洗涤，再用水冲洗干净。
3、关于研磨及铺板的要求：
（1）手工铺板硅胶的用量：
一般10*20cm的板约3～4克，具体根据要铺薄层板的硅胶层厚度决定。
（2）取薄层层析硅胶重量与CMC-Na的体积比为1：
4的比例（该比例能使硅胶板铺出的效果较好不至于掉渣也不至于板太硬）充分混合碾磨，至拿起碾锤能看到混合液与碾锤有一定的粘连，即可。
（3）依据薄层板使用需要，将适量研好的吸附剂倒到薄层板上，先用小锤将吸附剂荡匀，倾斜层析板，使吸附剂流至层析板一侧，待吸附剂蓄积一定量后，再反向倾斜层析板，使吸附剂回流；然后是另外两个方向，重复上述操作，后轻颠几下薄层板即可。
（4）铺制好的薄层板先让其稍干后，待看不出有明显的水印，放入烘箱内用50℃以下的温度并开鼓风干燥30分钟，再升温110℃干燥至干，注意升温过快在使用的过程中有可能发生起层的现象不利于分离。
第二节高效液相色谱法在天然产物定量分析中的应用
一．概述
1．定义：
以高压液体为流动相的液相色谱分析法称为高效液相色谱法。
早期液相色谱，是在直径1~5cm，长50~500cm的玻璃柱中进行的。
为了保证流动相流速，填充的固定相颗粒直径多在150~200μm范围内。
即使这样，流速仍然很低，分析时间仍然很长。
当加压增加流速时，尽管分析时间减少，但柱效没有提高。
为了解决分析时间及柱效问题，人们认识到：
减小固定相的粒径、增加固定相粒径的均匀度，能有效增加柱效。
直到上世纪60年代，由于在高压下操作的液压设备、高效固定相以及高灵敏检测器的出现及发展，才彻底解决了分析时间及柱效的问题，高效液相色谱技术才真正得到广泛应用。
2．特点：
（1）高速：
HPLC采用高压输液设备，增加流速，分析速度加快；而经典柱层析方法仅靠重力作用进行流动相的洗脱。
（2）高效：
填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。
（3）高灵敏度：
检测器灵敏度高，适用范围宽，自动化程度高。
3．高效液相色谱仪
（1）组成：
一般由高压输液泵、进样阀、色谱柱、检测器和数据处理系统或色谱工作站组成。
输液泵是将贮液器中的流动相以高压连续不断地泵入色谱柱；进样器一般采用带有定量管的六通进样阀；色谱柱管一般为直形不锈钢管，常量柱内径2～6mm，长度5～30cm，样品注入量一般为数微升，柱温为室温；最常用的检测器为紫外吸收检测器，此外还有荧光检测器、示差折光检测器等。
（2）工作原理：
系用高压泵将流动相泵入装有填充剂的色谱柱，通过进样阀注入样品溶液，流动相携带样品进入色谱柱进行分离，被分离成分依次进入检测器，转变成相应的电信号，由数据处理系统或色谱工作站进行处理而得到分析结果。
二．样品的处理
通过实验选择合适的提取溶剂和提取方法。
过滤：
0.45um或更小孔径滤膜。
三．高效液相色谱柱
色谱柱是HPLC系统的关键。
稳定的、高性能的色谱柱是建立耐用、重现性好的色谱方法的根本。
柱管为直型不锈钢管，内径1～6mm（标准的分析型填充柱柱管内径为4.6mm），柱长10～50cm（常用的分析型填充柱柱长为15cm或20cm）。
高效液相色谱柱最常用的填料为“C18”，简称“ODS”柱，即十八烷基硅烷键合硅胶填料（Octadecylsilyl）。
这种填料在反相色谱中发挥着极为重要的作用，它可完成高效液相色谱70～80％的分析任务。
在高效液相色谱分析柱之前往往要连接一个保护柱（或称为预柱），用于阻断来自进样器的杂质，以保护和延长分析柱的寿命。
保护柱通常填充和分析柱相同的填料。
四．流动相：
反相色谱最常用的流动相组成是：
“甲醇-水”或“乙腈-水”。
对流动相的要求：
1.采用“HPLC（色谱纯）”级溶剂
2.对样品有较大的溶解度
3.对所选用的检测波长没有干扰
4.粘度小，扩散系数要大，以减少传质阻力
5.毒性小，稳定性好
流动相的前处理：
过滤：
0.45um或更小孔径滤膜
目的：
除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。
过滤膜种类：
水相过滤膜（过滤水相溶剂）；有机相过滤膜（即可以滤过有机相溶剂又可以滤过水相溶剂）
五．柱温箱
柱温控制的优点：
分析结果重现性好；对于具有生物活性的生物样品，分析时要保持低的柱温。
六．色谱工作站
功能：
（1）自行诊断功能。
对色谱仪的工作状态进行诊断，可帮助色谱工作者及时判断仪器故障并予以排除。
（2）全部操作参数控制功能。
色谱仪的操作参数：
柱温、流动相的流量、梯度洗脱程序、检测波长、自动进样器的操作程序等全部可以预先设定，并实行自动控制。
（3）智能化数据处理和图谱处理功能。
进行数据处理，提供色谱峰的保留时间、峰面积、峰高、峰宽、理论塔板数、分离度等信息，进行图谱的叠加等处理。
（4）进行计量认证功能。
对紫外灯的使用时间、检测器噪声等进行检测。
（5）网络运行功能。
七．高效液相色谱仪器故障的诊断与维修
高效液相色谱仪器出现故障可以从多方面入手：
1.从部件的运转情况推测，如压力、流速的变化。
2.从色谱图的异常情况推测，如出峰时间、峰形。
3.从数据结果中分析。
下面我们来看一些在高效液相色谱法应用过程中一些常见故障的诊断与维修。
1、从压力的变化判断（压力过低或为零）
现象
故障排除
面版灯不亮，电源未接通
检查电源
漏液，接口太松
拧紧接口螺丝
排空阀打开
关闭排空阀
流动相不够
补足流动相
2、从压力的变化判断（压力过高）
现象
故障排除
液相色谱柱污染
清洗或更换色谱柱
预柱污染
清洗或更换预柱芯
管道过滤芯或过滤片污染
清洗或更换管道过滤芯或过滤片
溶剂贮液瓶中过滤器污染
清洗或更换过溶剂滤器
缓冲结晶盐沉淀
清洗
在流动相进入进样阀之前，管
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