土壤微生物数量测定方法整理.docx

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土壤微生物数量测定方法整理

土壤微生物的分离鉴定及数量测定

（一）培养基的制备

Ⅰ测定微生物总量培养基：

1.细菌培养基（牛肉膏蛋白胨琼脂培养基）

牛肉膏Beefextract5.0g

蛋白胨Peptone10.0g

NaCI5.0g

蒸馏水H201000m1

琼脂15～20g

PH7.2~7.4

制备步骤：

⑴在100mL小烧杯中称取牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，加50mL蒸馏水，置电炉搅拌加热至牛肉膏，蛋白胨完全溶解.

⑵向小铝锅中加入500mL蒸馏水，将溶解的牛肉膏，蛋白胨倒入铝锅中并用自来水洗2～3次.加入5.0gNaC1，在电炉上边加热边搅拌.

⑶加入洗净的琼脂条，继续搅拌，加热至琼脂完全熔化，补足水量至1000mL.

⑷用NaOH或HC1调至pH7.0.用酸度计或用玻棒沾少许液体用精密pH试纸测定其pH值，并用10％NaOH调至所需pH值，必要时用滤纸或脱脂棉过滤。

一般比要求的pH高出0.2，因为高压蒸汽灭菌后，pH常降低。

⑸根据不同需要，可将配好的培养基分装入配有棉塞的试管或三角瓶。

注意分装时避免培养基挂在瓶口或管口上引起杂菌污染。

如液体培养基，应装试管高度的1/4左右；固体培养基装试管高度的1/5左右；装入三角瓶的量以三角瓶容量的一半为限。

，塞好棉塞，装入小铁丝筐，然后用旧报纸将棉塞部分包好.标签表明培养基的名称、配制日期等。

⑹高压蒸汽灭菌，用0.1Mpa（15lb/in2）121℃灭菌（15-20）30min.

2.放线菌培养基（改良高氏1号琼脂培养基）

可溶性淀粉20g

KNO31g

K2HPO40.5g

MgSO4•7H2O0.5g

NaCl0.5g原0.05g

FeSO4•7H2O0.01g

pH7.2-7.4

制备步骤：

（1）计算根据配方计算各种药品所需要的量，然后再分别称量。

（2）称量准确称量各种成分。

（3）溶化配制时，先用少量冷水将淀粉调成糊状，倒入少许沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分，溶化后，补足水分到1000ml，调PH（可不调）。

（4）分装、包扎、灭菌。

注：

各成分按配方顺序依次溶解，对于微量成分，可预先配成高浓度的溶液，方便配置时量的控制。

配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分，溶化后，补足水分到1000ml，调pH。

另：

倒平板之前，在溶化的培养基中加重铬酸钾溶液，每300mL培养基加3%重铬酸钾1mL（l00ppm）。

3.真菌培养基（马丁（Martin）-孟加拉红琼脂培养基）

葡萄糖10.0g

MgSO4.7H2O0.5g

蛋白胨5.0g

孟加拉红33.4mg（或者每升加1%溶液3.3mL）

K2HPO41g

蒸馏水H201000m1

PH自然（4-5）

制备步骤：

（1）计算根据配方计算各种药品所需要的量，然后再分别称量。

（2）称量和熔化按培养基配方，准确称取各成分，并将各成分依次溶化在少于所需要的水量中待各成分完全溶化后，边加边搅拌,以防糊底,补足水分到所需体积。

再将孟加拉红配成1%的溶液，在1000ml培养液中加入1%的孟加拉红溶液3.3ml，混匀后，加入琼脂加热溶化。

（3）分装、加塞、包扎、灭菌。

（4）链霉素的加入由于链霉素受热易分解，所以临用时将培养基溶化后待温度降低至45摄氏度左右时才能加入。

注：

⑴灭菌前加卡那霉素20μg/ml，或者倒平板之前加链霉素。

⑵倒平板之前加乳酸，每100mL培养基加0.lmL。

Ⅱ测定功能菌所用培养基：

1.亚硝酸细菌培养基（改良的斯蒂芬逊（Stephenson）培养基A）

（NH4）2SO42.0g

NaH2PO40.25g

MnSO4·4H2O0.01g

MgSO4·7H2O0.03g

K2HPO40.75g

CaCO35.0g

蒸馏水1000ml

PH7.2

注：

CaCO3最后加，不需要溶解，直接调PH，培养基中有这个成分是为了缓冲pH。

因为硝化细菌的生长会产生酸化效应，使得氢离子过剩，到了一定程度硝化作用将无法继续，所以要碱性物质平衡酸碱。

下同。

2.硝酸细菌培养基（改良的斯蒂芬逊（Stephenson）培养基B）

NaH2PO40.25g

K2HPO40.75g

MgSO4·7H2O0.03g

MnSO4·4H2O0.01g

CaCO31.0g

Na2CO31.0g

NaNO21.0g

蒸馏水1000ml

PH7.2

3.反硝化细菌培养基

柠檬酸钠5.0g

KNO32.0g

KH2PO41.0g,

K2HPO41.0g

MgSO4·7H2O0.2g

蒸馏水1000ml

pH值7.2~7.5

4.好气性自生固氮菌培养基（改良阿须贝（Ashby）无氮培养基）

苯甲酸钠1.5g

K2HPO40.2g

MgSO4·7H2O0.2g

NaCl0.2g

CaSO4·2H2O0.1g

PH7.4—7.6

注：

在培养基分装入试管时，每管加入一1cm滤纸长条，要露出液面。

5.氨氧化细菌培养基（蛋白胨氨化培养基）

K2HPO40.5g

KH2PO40.5g,

MgSO4·7H2O0.5g

蛋白胨5.0g

蒸馏水1000ml

PH7.0~7.2

6.好气性纤维素分解菌培养基（依姆歇涅茨基纤维素分解菌培养基）

KH2PO41.0g

FeCl3·6H2O0.1g

MgSO4·7H2O0.3g

CaCl2·6H2O0.1g

NaCl0.1g

NaNO32.5g

pH7.2～7．4

注：

在培养基分装入试管时，每管加入一1cm滤纸长条，需露出液面。

（二）试剂的配制

1.格里斯试剂（GriessReagent）第一、第二液：

第一液：

将0.5g的对氨基苯磺酸（SulfanilicAcid）溶于150ml的20-30%稀醋酸溶液中，保存于棕色瓶中。

第二液：

将0.5gα-萘胺（α-naphthylamine）加入50ml蒸馏水中，煮沸后，缓缓加入150ml的20-30%稀醋酸溶液中，保存于棕色瓶中。

2.纳氏试剂

甲液：

将20.0g碘化汞和10.0g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。

乙液：

将20.0g氢氧化钾溶于100ml水中。

分别配制甲、乙二液，待冷却后混合，放置2天后使用。

保存于棕色瓶中。

取上清液使用，保存期三周，随着沉淀增加会影响测定结果。

3.二苯胺试剂：

溶1.0g无色的二苯胺（Diphenylamine）于20ml蒸馏水中，然后徐徐加入100ml浓硫酸（相对密度1.84）中，保存于棕色瓶中。

（三）实验器材

1.仪器设备

4℃冰箱、立式自动电热压力蒸汽灭菌器、恒温培养箱、电子天平、电热恒温水浴锅、超净工作台、微量移液器、全温空气摇床、旋涡混合器、磁力搅拌器、微波炉等。

2.器材准备

⑴将90ml水装入250ml三角瓶中，并装有15-20个玻璃珠，灭菌。

⑵将9ml水装入试管，灭菌。

⑶试管架，1ml无菌吸管，记号笔，白瓷比色板，接种环，酒精灯等。

（四）实验方法

1.样品采集

在靠近植株根系部,去除表层0-5cm的表土，采集5-20cm土壤剖面,多点采集,混匀后四分法取1kg,装无菌塑料袋带回，4℃冰箱保存。

2.悬液制备

称取10g土壤样品，放入盛有90ml无菌水的三角瓶中，置于摇床上室温振荡20min，

使土样与水充分混合，将土壤中的微生物细胞充分分散，从土壤中分离出来。

此为10-1土壤悬液，吸取lml此土壤悬液于9ml无菌水中，另用无菌吸管吹吸3次混匀，制成10-2土壤悬液。

以此类推依次制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8不同稀释度的土壤悬液。

3.土壤悬液稀释度选择

⑴细菌:

10-4~10-6

⑵放线菌：

10-3~10-5

⑶真菌：

10-2~10-4

以上采用稀释平板法，分别设置三个浓度梯度，二次重复。

⑷亚硝酸细菌：

10-3~10-6

⑸硝酸细菌：

10-3~10-6

⑹反硝化细菌：

10-4~10-7

⑺好气性自生固氮菌：

10-3~10-6

⑻氨氧化细菌：

10-5~10-8

⑼好气性纤维素分解菌：

10-2~10-5

以上采用最大或然法（MPN），分别设置四个浓度梯度，三次重复。

4.接种（平板接种技术）

平板接种是用接种环将菌种接至平板培养基上,或用移液管,滴管将一定体积的菌液移至平板培养基上,然后进行培养.其目的是进行菌落形态观察,分离纯化菌种,活菌计数,或进行其它试验.其方法有多种,根据实验的目的要求不同,可分以下几种.

①斜面菌种接至平板

划线法:

按无菌操作的方法自斜面用接种环直接取少量菌体,在平板培养基表面自左至右轻轻连续划线或分区划线,注意不要划破培养基.或先制成菌悬液,接种在平板边缘的一处,将接种环灼烧灭菌,再从有菌的部位如上方法划线接种.

点接法:

一般用于霉菌菌落观察的接种.无菌操作下,用接种针从斜面或孢子悬液中取少量孢子,轻轻点接在平板培养基上,点接的部位和点接的次数根据实验目的与要求确定.

②菌悬液接至平板涂抹法:

用灭菌的移液管或滴管吸取一定体积的菌液移至平板上,然后用无菌的玻璃涂棒将菌液均匀涂布在整个平板上.

混菌法:

先将菌液加入培养皿中,然后加入融化并冷却至45～50℃的固体培养基,轻轻摇匀,平置,待完全凝固后倒置培养.

③平板菌种接至斜面

此法一般是将分离培养得到的单菌落,在无菌操作下分别接种到斜面培养基上,以便进一步扩大培养或作保存之用.接种之前先选好平板上的单菌落,并做好标记.左手拿平板,右手拿接种环,在火焰上方或火焰旁边操作,灼烧接种环后将接种环在空白培养基处冷却,以免将菌种烫死,然后挑取菌落,在火焰旁边稍等片刻,此时左手将平板放下,拿起斜面培养基,按斜面接种的方法接种.

5.培养

将所有试管和平板置于25-28℃黑暗条件下避光培养。

培养时间由短到长分别为：

⑴真菌：

2～3d；

⑵细菌：

3～4d；

⑶放线菌：

5～7d。

⑷氨氧化细菌：

7～8d；

⑸好气性自生固氮菌：

7～8d；

⑹亚硝酸细菌：

10～14d；

⑺硝酸细菌：

10～14d；

⑻反硝化细菌：

10～14d；

⑼好气性纤维素分解菌：

10～14d；

6.结果观察

⑴亚硝酸细菌：

取出培养液5滴于白瓷比色板上，加入格里斯试剂（GriessReagent）第一、第二液各两滴，如有亚硝酸盐存在，则呈红色。

⑵硝酸细菌：

取出培养液5滴于白瓷比色板上，加入格里斯试剂（GriessReagent）第一、第二液各两滴，如不呈红色，表示亚硝酸均已经完全消失。

此时，另取培养液5滴于白瓷比色板上，加二苯胺试剂2滴，如呈蓝色，则表示亚硝酸已经被氧化成硝酸，说明有硝酸细菌的存在。

⑶反硝化细菌：

加入格利斯亚硝酸试剂，观察颜色变化，确定正负反应。

⑷好气性自生固氮菌：

观察试管培养液表面与滤纸接触处有无褐色或黏液状菌膜生成，或有无圆晕混浊出现。

⑸氨氧化细菌：

取出培养液5滴于白瓷比色板上，加入纳氏试剂两滴，如有氨氧化细菌存在，则呈棕色或褐色。

⑹好气性纤维素分解菌：

观察滤纸条是否成团，有无黄色或橘黄色菌斑出现及滤纸断裂情况。

7.镜检计数

稀释平板菌落计数

平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法.

⑴混合平板培养法

将无菌平板编上10-7,10-8,10-9,每一设置三个重复,用无菌吸管按无菌操作要求吸取1×10-9稀释液各1mL放入编号10-9的3个平板中,同法吸取10-8稀释液各1mL放入编号1×10-8的3个平板中,再吸取1×10-7稀释液各1mL放入编号1×10-7的3个平板中,由低浓度向高浓度时,吸管可不必更换.然后在9个平板中分别倒入已熔化并冷却至45～50℃的细菌培养基（图5-2）,轻轻转动平板,使菌液与培养基混合均匀,冷凝后倒置,在30℃下培养.至菌落长出后即可计数.

⑵涂抹平板计数法

涂抹平板计数法与混合法基本相同,所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中,待凝固后编号,然后用无菌吸管吸取0.1mL菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上,每个编号设三个重复.再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀（图24-3）,每个稀释度用一个灭菌刮铲,更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌.在由低浓度向高浓度涂抹时,也可以不

更换刮铲.将涂抹好的平板平放于桌上20～30min,使菌液渗透入培养基,然后将平板倒转,保温培养,至菌落长出后即可计数.

计算结果时,常按下列标准从接种后的3个稀释度中选择一个合适的稀释度,求出每克菌剂中的含菌数.

（1）同一稀释度各个重复的菌数相差不太悬殊.

（2）细菌,放线菌,酵母菌以每皿30～300个菌落为宜,霉菌以每皿10～100个菌落为宜.

选择好计数的稀释度后,即可统计在平板上长出的菌落数,统计结果按下式计算.

混合平板计数法:

每g样品的菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数×稀释倍数

涂抹平板计数法:

每g样品的菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数×10×稀释倍数

尽管使用不同的培养基，但细菌、放线菌和真菌都可能在同一个培养基上生长，所以必须用显微镜做进一步的观察。

明显有菌丝的一般是真菌，真菌的菌丝为丝状分枝，比较粗大；而放线菌菌丝呈放射状，比较细。

细菌有球状和杆状，有些细菌也形成细小的菌丝。

酵母菌的菌落与细菌的菌落很相似，但在显微镜下容易分辨。

酵母菌个体比较大，一般有圆形、椭圆形、卵形、柠檬形或黄瓜形，有些还有瘤状的芽。

在两级稀释度中，选细菌和放线菌的菌落数为30～200个、真菌菌落数为20～40个的培养皿各5个，取其平均值计算出每组的菌落数。

如果菌落很多，可将其分成2～4等份进行计数。

微生物生物量可以通过微生物细胞个体大小和密度计算得到。

8.计算

土壤微生物数量（cfu·g-1）=MD/W

式中M为菌落平均数：

D为稀释倍数；W为土壤烘干质量（g）。

背景知识：

微生物

微生物（microorganism简称microbe是包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生动物、显微藻类等在的一大类生物群体，它个体微小，却与人类生活关系密切。

涵盖了有益有害的众多种类，广泛涉及健康、食品、医药、工农业、环保等诸多领域。

微生物的定义

现代定义：

微生物是一切肉眼看不见货看不清的微小生物的总称。

形体微小，结构简单，通常要用光学显微镜和电子显微镜才能看清楚的生物，统称为微生物。

（但有些微生物是可以看见的，像属于真菌的蘑菇、灵芝等。

）

1特点：

个体微小,一般<0.1mm。

构造简单,有单细胞的,简单多细胞的,非细胞的。

进化地位低。

2分类：

原核类:

三菌,三体。

三菌：

细菌、蓝细菌、放线菌   三体：

支原体、衣原体、立克次氏体。

真核类:

真菌,原生动物,显微藻类。

非细胞类:

病毒,亚病毒（类病毒,拟病毒,朊病毒）。

3五大共性：

体积小,面积大；　吸收多,转化快；生长旺,繁殖快；适应强,易变异；　分布广,种类多

微生物的类群

种类

原核：

细菌、放线菌、螺旋体、支原体、立克次氏体、衣原体。

真核：

真菌、藻类、原生动物。

非细胞类：

病毒和亚病毒。

一般地，在中国大陆地区的教科书中，均将微生物划分为以下8大类：

细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次体、支原体、衣原体、螺旋体。

1细菌:

（1）定义:

一类细胞细短,结构简单,胞壁坚韧,多以二分裂方式繁殖和水生性强的原核生物

（2）分布:

温暖,潮湿和富含有机质的地方

（3）结构:

主要是单细胞的原核生物,有球形,杆形,螺旋形

基本结构：

细胞膜细胞壁细胞质核质。

特殊结构：

荚膜、鞭毛、菌毛、芽胞

　　  （4）繁殖:

主要以二分裂方式进行繁殖的

　　  （5）菌落:

单个细菌用肉眼是看不见的,当单个或少数细菌在固体培养基啊行大量繁殖时,便会形成一个肉眼可见的,具有一定形态结构的子细胞群落.

　　菌落是菌种鉴定的重要依据.不同种类的细菌菌落的大小,形状光泽度颜色硬度透明度都不同.

2放线菌

（1）定义:

一类主要成菌丝状生长和以孢子繁殖的陆生性较强的原核生物

（2）分布:

含水量较低,有机物较丰富的,呈微碱性的土壤中

（3）形态构造:

主要由菌丝组成,包括基菌丝和气生菌丝（部分气生菌丝可以成熟分化为孢子丝,产生孢子）

（4）繁殖:

通过形成无性孢子的形式进行无性繁殖

（5）菌落:

在固体培养基上:

干燥,不透明,表面呈致密的丝绒状,彩色干粉

真菌

真菌（Fungus）是一种真核生物。

最常见的真菌是各类蕈类，另外真菌也包括霉菌和酵母。

现在已经发现了七万多种真菌，估计只是所有存在的一小半。

大多真菌原先被分入动物或植物，现在成为自己的界，分为四门

真菌通常又分为三类，即酵母菌、霉菌和蕈菌（大型真菌），它们归属于不同的亚门。

真菌的细胞既不含叶绿体，也没有质体，是典型异养生物。

它们从动物、植物的活体、死体和它们的排泄物，以及断枝、落叶和土壤腐殖质中、来吸收和分解其中的有机物，作为自己的营养。

真菌的异养方式有寄生和腐生。

　　真菌常为丝状和多细胞的有机体，其营养体除大型菌外，分化很小。

高等大型菌有定型的子实体。

除少数例外，真菌都有明显的细胞壁，通常不能运动，以孢子的方式进行繁殖。

真菌菌落：

大小：

大。

形状：

绒毛状，絮状，蛛网状。

颜色：

五颜六色（孢子的颜色）

真菌：

念球菌、粘菌等。

细菌的菌落特征与繁殖

细菌在固体培养基上分裂繁殖时，许多细胞堆集在一起，形成肉眼可见的群体称为菌落。

不同种类的细菌其菌落形态互不相同，表现在大小、形状、边缘、隆起、光泽、质地和颜色等方面。

细菌菌落大小不一，小的不到1毫米，大的可以铺满整个培养皿；菌落形状有圆形、不规则形、卷发状、假根状等；菌落的隆起形状有扩展、台状、低凸、乳头状等；有的菌落有光泽、有的没有；有的菌落较粘，有的则较脆；菌落一般呈灰色，少数为白色、黄色、红色、绿色和棕色等。

大小：

小。

形状：

光滑，粘稠或粗糙干燥。

颜色：

多为白色。

　　细菌一般进行无性繁殖，表现为细胞的横分裂，称为裂殖。

裂殖结果形成两个大小相同的子细胞。

在最适宜的条件下，20～30分钟就能分裂1次，并可继续分裂若干次。

当继续分裂时，常因养料供应不足或温度变化以及其它种种原因而停止分裂或死亡。

放线菌的菌落特征与繁殖

放线菌的菌落质地致密，表面呈紧密的绒状，或坚实、干燥而多皱。

由于基菌丝长在培养基，所以菌落与培养基结合较紧，不容易被挑起，或者被挑起后不容易破碎。

当孢子丝形成大量孢子布满菌落表面时，使菌落呈絮状、粉末状或颗粒状，而与细菌菌落判然有别。

此外，如用放大镜仔细观察，可以看见菌落周围有放射状菌丝。

放线菌主要通过形成无性孢子的方式进行繁殖。

其孢子丝成熟时，分化形成许多孢子，称为分生孢子。

分生孢子常具色素，呈白、灰、黄、橙黄、红、蓝、绿等颜色。

　　孢子丝形成孢子的方式有凝聚分裂和横隔分裂两种。

大多数放线菌按凝聚分裂方式形成孢子，其过程是在孢子丝从顶端到基部，细胞质分段围绕核质，逐渐凝聚成一串大小相似的小段，然后每一小段外面产生新的孢子壁而形成孢子，最后孢子丝壁破裂，将孢子释放出来。

少数放线菌按横隔分裂方式形成孢子，其过程是在孢子丝产生许多距离均等的横隔，然后在横隔处断裂形成孢子。

另外有些放线菌可在菌丝上形成孢子囊，在孢子囊形成孢囊孢子，但这样的种类很少。

土壤稀释液的配制：

悬液制备

准确称取待测土样品10g,放入装有90mL无菌水并放有小玻璃珠的250mL三角瓶中,用手或置摇床上振荡20min,使微生物细胞分散,静置20～30s,即成10-1稀释液;

再用1mL无菌吸管,吸取10-1稀释液1mL,移入装有9mL无菌水的试管中,吹吸3次,让菌液混合均匀,即成10-2稀释液;

再换一支无菌吸管,吸取10-2稀释液1mL,移入装有9mL无菌水的试管中,也吹吸3次,即成10-3稀释液;

以此类推,连续稀释,制成10-4,10-5,10-6,10-7,10-8,10-9，10-10等一系列稀释菌液

注意事项：

1、培养基提前一天倒入培养皿，室温存放一天，另培养基表明干燥。

2、做无菌水接种对照，检测污染情况。

3、吸取10-6，10-8和10-10稀释液100ul，均匀涂布。