抗肿瘤药物药效学指导原则.docx

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抗肿瘤药物药效学指导原则

抗肿瘤药物药效学指导原则

一、基根源则

抗肿瘤药物分类

细胞毒类药物（cytotoxicagent）：

包含扰乱核酸和蛋白质合成、克制拓扑异构酶及作用于微管系统的药物等；

（2）

生物反响调理剂（biologicalresponsemodifier）

；

（3）

肿瘤耐药逆转剂（resistancereversalagent）

；

（4）

肿瘤治疗增敏剂（oncotherapysensitizer）

；

（5）

肿瘤血管生成克制剂（tumorangiogenesisinhibitor）

；

分化引诱剂（differentiationinducingagent）

；

（7）

生长因子克制剂（growthfactorinhibitor）

；

反义寡核苷酸（antisenseoligonucleotide）

。

抗肿瘤药物药效学需研究内容

2.1包含体外抗肿瘤试验，体内抗肿瘤试验。

2.2评论药物的抗癌活性时，以体内试验结果为主，同时参照体外试验结果以

做出正确的结论。

2.3I类抗肿瘤新药应进行药物作用体制初步研究。

二、体外抗肿瘤活性试验

试验目的

1.1对候选化合物进行初步挑选；

1.2认识候选化合物的抗瘤谱；

1.3为随后进行的体内抗肿瘤试验供给参照，如剂量范围、肿瘤类型等。

试验方法

采纳10-15株人癌细胞株，依据试验目的选择相应细胞系及适当的细胞接种浓

度，按惯例细胞培育法进行培育；介绍使用四氮唑盐MTT复原法、XTT复原法、磺酰罗丹明B（SR染色法、或51Cr开释试验、集落形成法等测定药物的抗癌作用。

药物与细胞共培育时间一般为48-72小时，贴壁细胞需先贴壁24小时后再给药。

试验应设阳性及阴性比较组，阳性比较用必定浓度的标准抗肿瘤药，阴性比较为溶媒比较。

评论标准

以同相同品不一样浓度对肿瘤细胞克制率作图可获得剂量效应曲线，而后采纳

Logit法计算多半有效浓度（IC50值或EC50值）。

体外试验起码重复一次。

附注：

评论药物抗癌活性的方法：

1.MTT复原法

1.1基根源理：

四氮唑[MTT,3-（4,5-dimethylibiazol-2-yl）-2,5-diphenyl-tetrazolium

bromide]是一种能接受氢原子的染料。

活细胞线粒体中与NADP有关的脱氢酶在细胞内可将黄色的MTT转变成不溶性的蓝紫色的甲[月替]（formazan），而死的细胞则无此功能。

用二甲基亚讽（DMSO）溶解甲[月替]后，在必定波长下用酶标

仪测定光密度值，即可定量测出细胞的存活率。

1.2操作步骤:

采纳对数生长久的贴壁肿瘤细胞，用胰酶消化后，用含10％小牛血清的

RPMIl640培育基配成5000个／ml的细胞悬液，接种在96孔培育板中，每孔

接种200μl，37℃，5％CO2培育24h。

实验组换新的含不一样浓度被测样品的培育基，比较组则换含等体积溶剂

的培育基，每组设3～5平行孔，37℃，5％CO2培育4～5d。

弃去上清液，每孔加入200μl新鲜配制的含0.2mg／mlMTT的无血清

培育基．37℃连续培育4h。

当心弃上清，并加入200μlDMSO，用微型超声

振荡器混匀后，在酶标仪上以试验波长为570nm，参比波长为450nm测定光密

度值。

1.3结果评定:

按下式计算药物对肿瘤细胞生长的克制率：

肿瘤细胞生长克制率％＝（1-OD实验/OD比较）×100％

以同相同品的不一样浓度对肿瘤细胞生长克制率作图可获得剂量反响曲线，从中

求出样品的多半杀伤浓度IC50。

合成化合物或植物提取纯品的IC50＜10μg／

m1或植物粗提物的IC50＜20μg／m1时，则判断样品在体外对肿瘤细胞有杀伤

作用。

生长曲线法的基根源理：

在最适条件下，肿瘤细胞在培育液中呈指数生长，如取细胞数的对数与培育时间作图可得一条直线，故称此时为对数生长久。

跟着细胞密度不停增高，因为代谢产物的聚集及营养物的耗费，细胞生长渐渐减慢致使停止，此时称高坪期或稳固期。

所以药物对细胞生长的影响可经过生长曲线反应出来。

染料排挤试验的基根源理：

活细胞有排挤某些染料如伊红、台盼蓝、苯胺黑等的能力，而死细胞因为膜完好性的损坏，可被着色。

所以培育的肿瘤细胞中加入这些染料，一准时间后，对着色和未着色的细胞进行计数，即可算出被杀死的细胞比率。

集落形成法的基根源理：

克隆原细胞拥有连续增殖能力，当单个细胞分裂6代或6代以上时，后来辈所构成的集体（集落）便含50个以上细胞。

经过集落计数可对克隆原细胞作定量剖析。

它反应了单个细胞的增殖潜力，故能较敏捷地测定抗癌药的活性，日前被以为是一种较理想的检测方法。

常用的集落形成法可分为贴壁法及半固体培育法两种。

SRB法的基根源理：

SRB（sulforhodamine是一种蛋白质联合染料，粉红色，可溶于水。

SRB可与生

物大分子中的碱性氨基酸联合。

其在515nm波长的OD读数与细胞数呈优秀的

线性关系。

故可用作细胞数的定量。

MTT法的一个弊端是OD值可随搁置时间而

变，而SRB法无此现象。

所以更合用于进行大规模的试验。

三、体内抗肿瘤试验

体内抗肿瘤试验一定采纳三种以上肿瘤模型，此中起码一种为人癌裸小鼠移植

模型或其余人癌小鼠模型。

试验结果三种模型均为有效，再重复一次也为有效，

评定该化合物对这些实验性肿瘤拥有治疗作用。

鼓舞使用人类肿瘤裸鼠移植瘤模型和多种类的移植瘤模型、原位接种模型和中

空纤维测定（hollow-fiberassay）等方法。

动物

动物要求健康，切合等级动物要求，有实验动物合格证。

雌雄均可，但同一批

实验中动物性别一定相同。

小鼠鼠龄为5-6周，体重为18-22克。

评论同一物质的活性时，不一样批次的实验一定采纳同一品系的小鼠。

肿瘤模型

2.1小鼠肿瘤模型

淋巴细胞白血病腹水瘤L1210和P388、白血病L-615、宫颈癌U14、肝癌H22、Lewis肺癌、黑色素瘤B16、网织细胞瘤M5076、肠癌26、肠腺癌38、乳腺癌CD8F1、艾氏腹水瘤（EAC）、瘤子-180等，以及各样小鼠肿瘤的亚型和耐药株等。

2.2人癌裸小鼠移植瘤模型

应采纳体外试验敏感细胞株进行体内抗人癌裸小鼠移植瘤试验。

模型成立和使

用应注意：

移植瘤一般由相应的细胞株移植而成立，对细胞株和移植瘤的化疗敏感性应予认识。

移植瘤复苏后一般应传2-3代后再用于体内抗肿瘤试验。

对模型生长状况应全面认识，特别是生长快的模型

为了保持移植瘤的生物学特征和遗传特征，复苏后移植瘤体内传代应少于

15-20代

试验过程

3.1接种：

肿瘤接种方法主要有皮下接种、腹腔接种和原位接种。

皮下肿瘤模型

选择肿瘤生长旺盛且无溃破的荷瘤小鼠，颈椎脱臼处死，在无菌条件下（超净台或接种罩），用碘酒、酒精或新洁尔灭消毒动物皮肤，切开皮肤，剥离肿瘤。

将瘤组织剪成1.5mm3左右，用套管针接种于动物一侧或两侧腋窝皮下；或制成细胞悬液，而后按必定比率加入无菌生理盐水，一般每只小鼠接种肿瘤细胞数目为（1-5）×106。

腹水瘤模型

无菌条件下，消毒动物皮肤，汲取生长优秀的动物腹水，以生理盐水按必定比

例稀释后接种于动物腹腔，接种细胞数目一般为（1-5）×106。

原位接种模型

原位接种是指将根源于某脏器的肿瘤接种在动物的某脏器，如将人肝癌接种在裸小鼠的肝脏。

原位接种不是惯例的方法，但有其优胜性，是鼓舞使用的方法。

主要有肺、肝、胃、肠、乳腺、颅内等原位接种方法。

3.2动物分组

试验设阴性比较组、阳性比较组、治疗组。

治疗组设高、中、低三个剂量组。

小鼠肿瘤和腹水瘤接种后第二天将动物

随机分组，裸鼠移植瘤用游标卡尺丈量移植瘤直径，待肿瘤生长至100—300mm3

后将动物随机分组。

动物数一般小鼠每组10只，裸鼠6只。

阴性比较组动物数为治疗组动

物数×实验组数1/2

3.3剂量设置

治疗组设高、中、低剂量治疗组，一般按4:

2:

1设置，高剂量使用最大

耐受量或LD10的剂量。

阴性比较组赐予相应的溶剂；

阳性比较药采纳对该动物敏感的、临床应用的抗肿瘤药物，

如受试物为一抗癌药物的衍生物或近似物时，一定采纳该抗癌药物作为

阳性比较药。

3.4阳性比较药选择原则

疗效切实；与被试物质化学构造近似；与被试物质有近似的作用机理。

3.5药物配制

溶于水的药物，用生理盐水或蒸馏水配制；如用酸、碱溶解者，可先用小量酸

HCl）或碱（NaHCO3、Na2CO3、NaOH）溶解，调理pH在的范围

内。

用乙醇、丙二醇、吐温80、DMSO助溶的药物，或用吐温60、吐温80、2-3%

淀粉、0.5%羧甲基纤维素制成混悬液的药物，可腹腔注射或口服，但一定设相

同浓度的溶剂比较组。

用注射用花生油配制的溶液或乳剂爽口服、皮下或肌肉

注射。

3.6给药方案和给药门路

分组当天开始给药，依据不一样药物的代谢动力学和毒性反响等确立给药方案。

给药门路应与介绍临床用药的门路相同。

给药次数许多，或被试物质溶解性较差，静脉给药有困难时，可考虑使用腹腔给药，但在评论药效时要注意这两种给药门路是有差其他。

可采纳瘤周、瘤内、肌肉、皮下给药门路。

腹水瘤试验时一般不可以应用腹腔给药门路。

评论标准

4.1腹水瘤模型

接种给药后，察看和记录动物死亡时间，计算生计天数。

如阴性比较组20%动物存活时间超出4周，表示腹水瘤生长不良，实验作废。

采纳中位生计时间（即mediansurvivaltime,MST）来评论每组的生计时间其计算公式为：

，

每组鼠数的中间数-中间生计天数前死亡的鼠数MST=（中间生计天数-0.5）+

中间生计天数死亡的鼠数

治疗组与比较组的比较，采纳T/C（%）来表示，计算公式为：

TMST

T/C%=────×100%

CMST

TMST：

治疗组MST；CMST：

阴性比较组MST。

评论标准以125%为界，当T/C%≥125%时。

视为有效，反之则无效。

4.2裸鼠移植瘤模型

介绍使用丈量瘤径的方法，动向察看受试物抗肿瘤的效应。

肿瘤直径的丈量次

数依据移植瘤的生长状况而定，一般为每周2-3次,每次丈量同时还需称鼠重。

肿瘤体积（tumorvolume,TV）的计算公式为：

V=1/2×a×b2或π/6×a×b×c

此中a、b、c分别表示长宽高。

两公式的有关性极好，可采纳任一公式。

依据丈量结果计算出相对肿瘤体积（relativetumorvolume，RTV），RTV=Vt

V0。

此中V0为分笼给药时（即d0）丈量所得肿瘤体积，Vt为每一次丈量时的肿瘤体积。

抗肿瘤活性评论指标为相对肿瘤增殖率T/C（%）TRTVT/C%=────×100%

CRTV

TRTV：

治疗组RTV；CRTV：

阴性比较组RTV。

疗效评论标准：

T/C%>60%为无效；T/C%≤60%，并经统计学办理P<0.05为有效。

4.3小鼠肿瘤模型

生长较慢小鼠肿瘤采纳与裸鼠移植瘤相同的丈量瘤径的评论方法。

生长较快小鼠肿瘤可采纳称瘤重的方法评论。

试验结束后处死动物，称体重，

解剖剥离瘤块，称瘤重。

阴性比较组肿瘤均匀瘤重小于1克，或20%肿瘤重量小

于400毫克，表示肿瘤生长不良，试验作废。

疗效评论公式：

给药组均匀瘤重-阴性比较组均匀瘤重

肿瘤生长克制率=─────────────────×100%阴性比较组均匀瘤重

评论标准：

肿瘤生长克制率<40%为无效；肿瘤生长克制率≥40%，并经统计学办理P<0.05为有效。

4.4原位接种模型

不一样原位接种模型可采纳不一样评论方法，主要有瘤重和生计时间评论法。

如肝原位接种可用瘤重评论，颅内接种可用生计时间评论。

评论方法、标准和注意事项同腹水瘤模型和小鼠肿瘤模型。

四、抗肿瘤药物的特别要求

I类抗肿瘤新药应进行药物作用体制的初步研究。

非细胞毒类药物除达成体内外

抗肿瘤试验，还应进行特定抗肿瘤作用研究。

生物反响调理剂

药效学包含：

体内抗癌试验和免疫功能研究。

1.1体内抗癌试验注意点：

模型：

裸鼠是免疫缺点动物，一般应用正常免疫鼠肿瘤模型。

给药时间：

可按惯例给药，也可在接种前早先给药，接种后连续给药或停药。

肿瘤细胞接种量：

可比细胞毒类药物低一个数目级，一般为（1-5）105个瘤细胞

小鼠。

给药方法：

可独自给药，也可与其余抗肿瘤药物归并使用，察看增效或减毒作用。

1.2免疫功能试验方法

拥有抑瘤作用的生物反响调理剂，还需作免疫功能测定,以明确其抑瘤作用能否

与免疫功能调控有关。

免疫功能测定包含细胞免疫和体液免疫双方面。

免疫功能测定有：

（1）巨噬细胞功能测定

（2）天然杀伤细胞（naturalkillcell）测定

3）淋巴细胞转变试验

4）淋巴因子活化的杀伤细胞测定（lymphocyte-activatedkillercell）

5）各样细胞因子测定，如IL-2、IL-6、IL-12、IFN-γ、TNF-α等。

6）迟发型超敏反响检测

肿瘤耐药逆转剂

2.1体外抗耐药活性试验

选择2-3对肿瘤耐药/敏感细胞株，采纳MTT法或SRB法测定细胞毒性。

一般在无毒剂量或相当于IC10的剂量下设三个剂量，并建立相应的阳性和阴性比较组。

评论逆转成效用逆转倍数（foldreversal,FR）表示：

FR=IC50（不加逆转剂）/IC50（加逆转剂）。

注意的方面：

耐药株的耐药性：

耐药株因传代，特别是撤药后耐药性可改变或消逝；试验前一定对试验耐药株进行耐药倍数（FR）测定，保证试验的靠谱性。

若非逆转多药耐药（MDR）而是逆转单药耐药，则实验的瘤株中需有针对该药的耐药细胞株。

阳性比较药建议采纳

维拉帕米（verapamil）10μM

环孢菌素A（cyclosporinA）3μM。

2.2体内抗肿瘤耐药活性试验

小鼠敏感和对应的耐药肿瘤和人癌裸鼠敏感和对应的耐药移植瘤。

2.3耐药基因及其表达产物测定

可测定肿瘤细胞内的药物浓度变化和耐药基因及其表达产物，初步明确其逆转

耐药体制。

包含多药耐药基因及其编码蛋白（multidrugresistance

gene/p-glycoprotein,Mdr1/Pgp）、多药耐药有关蛋白（multidrug

resistance-relatedprotein,MRP）、肺耐药相关蛋白（lung

resistance-relatedprotein,LRP）

、其余与耐药有关的基因

/蛋白及酶等。

抗肿瘤转移药物

肿瘤能否转移不单依靠于肿瘤细胞自己拥有的内在转移潜能，并且也取决于机体抗转移要素的消长。

所以，抗转移药物只有在动物体内模型上才能得出切合实质的结果。

3.1体外试验

测定候选化合物作用下肿瘤细胞对基底膜的侵袭、粘附和肿瘤细胞趋化性运动的能力。

3.2体内试验

模型：

小鼠B16黑色素瘤、小鼠Lewis肺癌等和人癌裸鼠移植高转移瘤模型。

接种方法：

常用静脉注射方法，也可用皮下接种等方法。

评论指标

接种给药后，察看记录动物死亡时间，计算生计天数。

试验结束后，称动物体

重、肺重、移植瘤重，解剖显微镜下计数肺转移瘤灶、测瘤径（计算肺转移瘤体

积）和病理组织学切片察看等；计算转移率

转移克制率=1-（治疗组转移率/比较组转移率）×100%。

肿瘤血管生成克制剂

4.1体外试验

体外试验模型有:

1）人血管内皮细胞模型：

人脐静脉血管内皮细胞和人微血管（肺、皮肤等）内皮细胞。

（2）血管形成促使因子等刺激细胞DNA合成、增殖、迁徙、血管形成（tubeformation）来察看药物的抗血管形成作用。

如血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）或碱性成纤

维细胞生长因子（basicfibroblastgrowthfactor,bFGF）

（3）肿瘤细胞模型：

主要应用国内已成立的人实体癌细胞系，确立VEGF、FGF等高分泌的细胞株。

检测细胞增殖、转移能力及血管形成因子的基因表达状况来评论药物。

4.2体内试验

血管克制试验

经典的血管形成评论方法有：

鸡绒毛膜尿囊和卵黄膜囊（CAM）、啮齿动物虹膜

和角膜等。

也可用如皮下移植塑料或多孔的polytetrafluoroethylene管、皮

下移植无菌的海绵；一些自然的或化学修饰的物质如Matrigel和纤维凝胶等用

于体内模型。

抗肿瘤试验

经过察看重生血管生成克制剂的体内抗肿瘤效应检测移植瘤的血管密度、血管生成因子和克制因子的分泌和表达，以及肿瘤的转移状况等综合评论肿瘤血管生成克制剂的作用和作用体制。

分化引诱剂

分化引诱剂的药效学研究包含体外和体内研究模型；当前的药物主要能对急性白血病进行有效的分化治疗。

阳性比较药采纳维甲酸类（retinoid）化合物。

5.1体外试验

白血病的分化引诱

常用的细胞株有人急性早幼粒白血病细胞株HL-60、NB4细胞、人红白血病K562

细胞等。

可选择以下试验方法研究并判断结果：

（1）四唑氮蓝（NBT）复原试验：

比较组细胞的复原能力≤10%，候选化合物的复原能力>50%

2）细胞形态学察看：

可在光学显微镜与电镜下察看候选化合物作用后细胞的形态学变化，比较组的早幼粒细胞应>90%-95%，候选化合物组细胞分化，成熟粒细胞占比率越高，说明该化合物的分化成效越好。

实体瘤细胞的分化引诱

常用细胞株：

人肝癌HepG2、SMMC7721

试验方法及评论标准：

主要测定细胞的甲胎蛋白（AFP）、白蛋白含量，γ-谷氨酸转移酶（γ-GT）、酪氨酸转氨酶（TAT）活性及察看细胞形态。

分化细胞AFP含量、TAT和γ-GT活性显然降低，白蛋白含量增添，细胞胞质增添、核减小。

5.2体内试验

常用人癌细胞小鼠肾囊膜下移植试验、小鼠髓单核细胞白血病试验和人癌细胞裸小鼠移植瘤模型等。

可选两种模型，依据肿瘤鼠生计时间、肿瘤的体积及形态变化，察看分化引诱成效。

重复试验一次。

6.肿瘤治疗增敏剂

增敏剂主假如指放射治疗增敏剂，能增添临床上恶性肿瘤放射治疗或其余治疗

的疗效及降低治疗后的复发率。

6.1体外试验

分别选择对放射、化疗药物拥有中、低度敏感的人肿瘤细胞株，采纳MTT、SRB

或细胞集落形成方法进行化合物的细胞毒性试验，以IC50值作为评论指标。

6.2体内试验

采纳对射线及化疗药物敏感性较小的三种实体瘤模型进行试验，此中起码有一

种人癌裸鼠移植瘤模型。

由强致癌物或病毒等要素引发的肿瘤，或许不是在同一品系动物身上移植传代

的肿瘤常常会出现免疫反响，所以都不可以用于肿瘤治疗增敏剂研究。

疗效评论可参照体内抗肿瘤试验。