桂芍散结丸质量标准研究.docx

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桂芍散结丸质量标准研究

桂芍散结丸质量标准研究

杜毅（副主管药师,淄博市中医医院，淄博周村新建中路75号，255300）

摘 要 目的：

建立桂芍散结丸的质量标准，为医院制剂的质量控制提供依据。

方法：

采用显微鉴别法，对方中红花、黄柏药材进行了定性鉴别；采用薄层色谱法（TLC），对赤芍、王不留行、醋延胡索、黄柏药材进行定性鉴别；采用高效液相色谱法（HPLC），测定赤芍中芍药苷的含量。

结果：

显微鉴别粉末特征典型；薄层色谱专属性强，阴性对照无干扰；芍药苷的进样量在0.2739～3.4241μg范围内与峰面积呈良好的线性关系（r=0.9999），平均加样回收率为95.62%，RSD为1.11%（n=6）。

结论：

所建标准可用于桂芍散结丸的质量控制。

关键词 桂芍散结丸；薄层色谱鉴别；含量测定；质量标准

桂芍散结丸是我院中药自制制剂，由王不留行、红花、赤芍、黄柏、醋延胡索、醋山甲、肉桂等14味药材组成。

具有活血散结、通利尿道、清热解毒的功效。

用于前列腺增生症，小便不利，男科生殖器官炎症，疗效确切。

为了有效控制本制剂质量，保证临床疗效，笔者对方中的红花、黄柏进行了显微鉴别，对王不留行、赤芍、醋延胡索、黄柏药材进行了薄层色谱鉴别，并用高效液相法测定赤芍中芍药苷的含量。

1 仪器与试药

奥林巴斯BX53型生物显微镜；GOODLOOK-1000薄层色谱成像系统；岛津LC-20A高效液相色谱仪；MS205DU梅特勒电子天平；KS-500EI超声波清洗机；真空脱气器；DP-01无油真空泵。

芍药苷对照品（中国食品药品检定研究院，11）；王不留行对照药材（中国食品药品检定研究院，12）；延胡索乙素对照品（中国食品药品检定研究院，11）；盐酸小檗碱对照品（中国食品药品检定研究院，11）；桂芍散结丸供试品（批号141011、141111、141212）及其相应阴性样品均由淄博市中医医院提供；硅胶G薄层板（Merck公司）；乙腈（天津科密欧，色谱纯）；甲醇（天津康科德，色谱纯）；磷酸（上海安谱科学仪器有限公司，色谱纯）；水为娃哈哈纯净水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 显微鉴别

取本品粉末，置显微镜下观察：

黄柏纤维鲜黄色，直径16～38μm，周围细胞含草酸钙方晶，形成晶鞘纤维；含晶细胞壁木化增厚

（1）。

红花花粉粒类圆形、椭圆形或橄榄形，直径约至60μm，具3个萌发孔，外壁有齿状突起

（2）。

结果见图1。

图1 黄柏、红花显微鉴别

2.2薄层色谱鉴别【1】

2.2.1 赤芍薄层色谱鉴别

取本品10g，加甲醇50ml，超声20分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加水20ml溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，再用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次30ml，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，加在中性氧化铝柱（100-200目,5g,内径1cm）上，用甲醇50ml洗脱，收集洗脱液，水浴上蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。

另取按处方比例和工艺制备不含赤芍的阴性对照样品，按上述供试品制备方法制得阴性对照溶液。

再取芍药苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。

照薄层色谱法（（2015版药典通则0502））试验【2】，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。

供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

阴性对照溶液色谱在相应位置没有斑点。

结果见图2。

图2赤芍薄层色谱图

2.2.2 王不留行薄层色谱鉴别

取本品10g，研细，加70％甲醇25ml，超声处理30分钟，放冷，滤过，滤液浓缩至约10ml，作为供试品溶液。

另取按处方比例和工艺制备不含王不留行的阴性对照样品，按上述供试品制备方法制得阴性对照溶液。

再取王不留行对照药材1.5g，同法制成对照药材溶液。

照薄层色谱法（2015版药典通则0502）试验，吸取上述三种溶液各2μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲醇-水（4∶6）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％三氯化铝乙醇溶液，热风吹干，置紫外光灯（365nm）下检视。

供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点。

阴性对照溶液色谱在相应位置没有斑点。

结果见图3。

图3王不留行薄层色谱图

2.2.3 醋延胡索薄层色谱鉴别

取本品10g，研细，加甲醇50ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，加浓氨试液调至碱性，用乙醚振摇提取3次，每次10ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。

另取按处方比例和工艺制备不含醋延胡索的阴性对照样品，按上述供试品制备方法制得阴性对照溶液。

再取延胡索乙素对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。

照薄层色谱法（2015版药典通则0502）试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮（9∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，置碘缸中约3分钟后取出，挥尽板上吸附的碘后，置紫外光灯（365nm）下检视。

供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

阴性对照溶液色谱在相应位置没有斑点。

结果见图4。

图4醋延胡索薄层色谱图

2.2.4 黄柏薄层色谱鉴别

取本品10g，研细，加浓氨试液2ml，甲醇30ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml作为供试品溶液。

另取按处方比例和工艺制备不含黄柏的阴性对照样品，按上述供试品制备方法制得阴性对照溶液。

再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。

照薄层色谱法（2015版药典通则0502）试验【3】，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯－乙酸乙酯－异丙醇－甲醇－浓氨试液（6∶3∶1.5∶1.5∶0.5）为展开剂，置氨蒸气饱和的展开缸内，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。

供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照溶液色谱在相应位置没有斑点。

结果见图5。

图5黄柏薄层色谱图

2.3 赤芍中芍药苷的HPLC法含量测定

2.3.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：

岛津InertsilODS-SPC185um，150×4.6mm；以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：

乙腈-0.1％磷酸溶液（14：

86）；流速：

1.0ml/min；检测波长：

230nm；柱温：

30℃；进样量：

10ul；在此色谱条件下，供试品中芍药苷色谱峰的峰型较好，与其他组分峰能达到基线分离，芍药苷保留时间为10.475min。

理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000。

2.3.2 溶液制备

供试品溶液制备：

取本品适量，研细，约3.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率240W，频率40kHz）30分钟，取出，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

对照品溶液制备：

取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含136.9651ug的溶液，即得。

阴性对照品溶液制备：

按照桂芍散结丸的制备工艺，制备不含赤芍的样品，并按“2.3.2”项下“供试品溶液制备”方法制成阴性对照溶液。

2.3.3专属性试验

分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液以及阴性对照溶液各10ul，按“2.3.1”项下色谱条件进样检测。

供试品色谱中，在与对照品色谱保留时间相同的位置上，有相应色谱峰，阴性对照色谱在与芍药苷对照品色谱相同的保留时间处，无色谱峰干扰。

结果见图6.

A

B

C

图6专属性色谱图

A.芍药苷对照品 B.供试品 C.阴性对照

2.3.4线性关系考察

精密称取芍药苷对照品（批号：

11）17.76mg（芍药苷含量96.4%），置50ml容量瓶中，加稀乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为342.4128ug/ml的对照品溶液，作为贮备液。

从贮备液中分别精密量取2ml、1ml、1ml、2ml、5ml，分别置25ml、10ml、5ml、5ml、10ml的量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，即得到浓度为27.3930ug/ml、34.2413ug/ml、68.4826ug/ml、136.9651ug/ml、171.2064ug/ml的对照品溶液。

分别精密吸取上述芍药苷对照品溶液各10ul，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定。

以芍药苷对照品的进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，求得回归方程为Y=1445469.47X-35220.60（R=0.9999）。

结果表明，芍药苷进样量在0.2739～3.4241μg范围内与其峰面积呈良好的线性关系。

2.3.5 仪器精密度试验

精密吸取芍药苷对照品溶液（136.9651ug/ml）10ul，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，连续进样6次。

结果，RSD=0.225%（n=6），显示仪器精密度良好。

2.3.6 稳定性试验

取同一供试品溶液适量（批号：

141212），按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，每隔1小时进样一次，连续考察6小时。

结果，RSD=0.382%（n=6），表明供试品溶液在6小时内稳定。

2.3.7 重复性试验

取同一批的本制剂（批号：

141212）6份，照“2.3.2”项下供试品溶液的制备方法制成供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定。

结果，样品平均含量为1.6652mg/g，RSD=0.40%（n=6），表明方法重复性良好。

2.3.8 加样回收试验

取已测知含量的本制剂适量（批号：

141212，芍药苷含量为1.6652mg/g），研细，取约1.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入“2.3.5”项下芍药苷对照品储备液（浓度为342.4128ug/ml）7ml及稀乙醇共计50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率240W，频率40kHz）30分钟，取出，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

平行制备6份。

分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10μl，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率。

试验结果表明，本方法加样回收率良好。

见表1。

表1加样回收率试验结果（n=6）

取样量

（g）

样品中含量（mg）

对照品加入量（mg）

测得量

（mg）

回收率（%）

平均

（%）

RSD

（%）

1.2015

2.0007

2.3969

4.2552

94.06

95.62

1.11

1.2012

2.0002

2.3969

4.2642

94.46

1.2012

2.0002

2.3969

4.3052

96.16

1.2009

1.9997

2.3969

4.3058

96.21

1.2005

1.9991

2.3969

4.3087

96.36

1.2001

1.9984

2.3969

4.3099

96.44

2.3.9样品含量测定

取3批桂芍散结丸样品（批号141212、141111、141011），按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进行测定，计算样品含量，每批测定2次。

结果,3批样品中芍药苷含量分别为1.6639mg/g、1.4216mg/g、1.4188mg/g。

见表2。

表2样品含量测定结果

批号

含量1（mg/g）

含量2（mg/g）

平均含量（mg/g）

141212

1.6636

1.6642

1.6639

141111

1.4229

1.4204

1.4216

141011

1.4193

1.4183

1.4188

3 讨论

桂芍散结丸所含的药味较多，除本实验已经鉴别的药味外，还进行了其他药味的薄层色谱鉴别研究。

穿山甲在本制剂处方组成中占量较少，薄层色谱鉴别时供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点但不清晰，未列入质量标准。

红花薄层色谱鉴别，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，但是斑点色泽不鲜明，故未作为质量标准。

含量测定试验中对不同取样量（2g、3g、4g）进行了考察，结果分别为1.6554mg/g、1.6632mg/g、1.6713mg/g，显示三种取样量结果差异不大，确定取样量为3g。

对不同提取方法（超声30min、加热回流30min、加热回流1h）进行了比较研究，结果显示芍药苷超声提取30min即可提取完全并且快速、简便、节约能源。

桂芍散结丸是由中药饮片粉碎后的细粉经加工制成的水丸，在1000g的桂芍散结丸中含赤芍生药90g。

根据2015年版一部“赤芍”项下规定，芍药苷的含量限度为“不得少于1.5%”，由此计算理论含量应为1.35mg/g，参考生粉入药其有效成分的转移率为90%这一原则，结合三批样品的含量测定结果，暂定本品每g含赤芍以芍药苷（C23H28O11）计，不得少于1.20mg。

参考文献

【1】国家药典委员会.中华人民共和国药典（四部）【S】.北京：

中国医药科技出版社，2015.

【2】韩德世，鲁建武.祛风消痛颗粒的薄层色谱鉴别【J】.中国医院药学杂志，2007,27（10）：

1472-1473

【3】杨立新，王锦玉.牛黄上清微丸定性及定量分析【J】.中国实验方剂学杂志，2010,16（16）：

69-70

作者简介

杜毅，男，山东淄博人，副主管药师，研究方向：

中药鉴定、中药制剂、中药质量控制。