生物化学实验指导.docx
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生物化学实验指导
生物化学实验指导
生物化学实验须知
一、实验目的
1．培养学生严谨的科学作风，独立工作能力及科学的思维方法。
2．学习基础的生物化学实验方法，为今后的学习与研究准备更好的条件。
3．培养学生爱护国家财物、爱护集体、团结互助的优良道德品质。
4．培养学生的书面及口头表达能力。
二、实验的总要求
1．按教研室予先公布的实验进度表，了解各次实验的具体内容，并认真做好预习。
弄清各步骤的意义，避免教条或机械式做实验。
2．进行实验不仅要求结果良好，而且要求敏捷高效。
为达到此目的，实验者应注意：
①一切步骤都按正规操作法进行；②样品与试剂勿过量取用；③宜粗者勿细（例如粗天平称量物品即足够准确时，不用分析天平，用量筒取液足够准确时，不用吸量管）；④试剂、仪器防止污染及破损，保持实验环境的整洁。
⑤注意力集中，避免差错。
3．实验中观察要仔细，记录要详尽、及时与客观，不得于实验后追记，应直接记在实验报告本中，而且无论实验成功与失败，都应记下。
对于失败的实验，要分析其原因。
4．实验室是集体学习与工作的场所，实验时应保持肃静，不得大声喧哗，以免影响他人的工作与思考。
对师长尊敬，对同学要团结友爱。
实验后应清洗整理用过的仪器及清理自己的实验场所。
三、实验报告
实验报告的书写是培养学生书面表达能力和科学作风的重要手段之一，实验者应该重视。
实验报告的内容包括下列各项：
实验名称、实验日期、实验目的、实验原理、实验步骤、实验记录、计算（定量测定、解释）、讨论或小结。
实验记录除应包括“实验总要求”的第3项要求外，还应包括原始记录。
原始记录是随做随记的第一手记录，应由指导教师签字认可。
书写实验报告要字迹工整，语句通顺。
书写工整的实验报告，是尊师的重要表现之一。
四、组织与分组
1．每一个班学习委员负责①实验报告的收集与分发；②安排清扫值日名单；③反映同学学习情况及对教学工作的意见；④其它临时性的工作。
2．一般实验都为两个学生单独进行。
有的实验要4人一组，由相邻两学生组成固定小组。
小组的成员在指导教师的同意下，可作适当的调整。
五、仪器
1．每个实验小组的常用仪器在各自的抽屉里，请各位同学爱惜公用仪器，用完及时清洗干净。
2．公用仪器（包拈贵重仪器，如分光光度计、电动离心机等）使用时时间不宜过长，以免妨碍他人工作。
设有使用登记薄的仪器，使用后必须登记，以示负责。
对于不熟悉仪器，切勿随意乱动应请教师指导。
六、试剂
1．每两小组合用一份试剂，在一般情况下，使用的试剂应该固定。
2．取试剂瓶塞与量取用具（如吸管或滴管）不应与试剂瓶分开放置，用后应立即放回原处，量取用具应按规定放置。
瓶塞与量具一旦弄错，试剂即受污染，实验就可能失败。
3．标准试剂不应用潮湿之吸管与之直接接触，取出后不得再放入原瓶。
七、玻璃器皿的洗涤
一般玻璃皿器用肥皂或去污粉以毛刷洗涤即足以满足要求，洗后应将肥皂或去污粉仔细冲掉，将水倾去后，器壁不挂水珠，视为合格。
铬酸洗液仅用于毛刷不能洗净的器皿，切勿滥用于普通玻璃器皿洗涤。
使用铬酸洗液时，玻璃器皿应干燥；过多的水份将使洗液迅速失效。
用过的铬酸洗液须加以保存以反复使用，直至变为绿色后方可舍弃；其舍弃法与浓硫酸液相同。
用洗液浸洗过的玻璃器皿，应先用自来水冲洗，然后再用蒸馏水或去离子水清洗，清洗时，宜采用“少量多次”原则以节约蒸馏水，同时清洗的效率也高。
八、舍弃物的处理
舍弃物必须依照其性质作适当处理。
以免造成实验材料浪费，损坏水槽及下水管道，或污染实验环境。
1．所有固体舍弃物（例如用过的滤纸、损坏的软木塞及橡皮物、玻璃渣、火柴梗等）。
必须放入废物筒或篓中，切勿丢于水槽中。
2．废硫酸或洗液，应先倾入大量水中，再倒入水槽中，并以大量水冲走。
3．实验完成后的沉淀或混合物，若含有可提取或收回的贵重物品者，不可随意舍弃，应放入教师指定的回收器中。
生化实验基本操作
一.玻璃仪器的洗涤
在生化实验中，玻璃仪器洁净与否，是获得准确结果的重要环节。
洁净的玻璃仪器内壁应十分明亮光洁，无水珠附着在玻壁上。
㈠常用的洗涤方法：
1.一般仪器，如烧杯、试管等可用毛刷蘸肥皂液、合成洗涤剂仔细刷洗。
然后用自来水反复冲洗，最后用少量蒸馏水冲洗2~3次，倒置在器皿架上晾干或置于烘箱烤干备用。
2.容量分析仪器如吸量管、容量瓶、滴定管等，不能用毛刷刷洗。
用后应及时用自来水多次冲洗，细心检查洁净程度，根据挂不挂水珠采取不同处理方法。
（1）如不挂水珠，用蒸馏水冲洗、干燥，方法同上；
（2）如挂水珠，则应沥干后用重铬酸钾洗液浸泡4~6小时，然后按上法顺序操作，即先用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗，最后干燥。
3.粘附有血浆的刻度吸量管等，有三种洗涤方法：
（1）先用45%尿素溶液浸泡，使血浆蛋白溶解，然后用自来水冲洗；
（2）也可用1%氨水浸泡，使血浆溶解，然后再依次用1%稀盐酸溶液、自来水冲洗；（3）以上二法如达不到清洁要求，可浸泡于重铬酸钾洗液4~6小时，再用大量自来水冲洗，最后用蒸馏水冲洗2~3次。
4.新购置的玻璃仪器，应先置于1~2%稀盐酸溶液中浸泡2~6小时，除去附着的游离碱，再用自来水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗2~3次。
5.凡用过的玻璃仪器，均应立即洗涤，久置干涸后洗涤十分困难。
如不能及时洗涤，先用流水初步冲洗后浸泡在清水中，待后按常规处理。
㈡使用重铬酸钾洗液（以下简称洗液）时应注意以下几点：
1.需用洗液浸泡的容器，在浸泡前应尽量沥干。
否则会因洗液被稀释而降低洗液的氧化力。
2.Hg2+、Ba2+、Pb2+等离子可与洗液发生化学反应，生成不溶性化合物沉积在容器壁上。
因此，凡接触过上述离子的容器，应先除去上述离子（可用稀硝酸或5~10%EDTA钠清除）。
3.油类、有机溶剂等有机化合物可使洗液还原失效。
因此，容器壁上附有大量油类、有机物时，应先除去。
4.洗液的酸性和氧化性很强，使用时应格外注意，千万不要滴落在皮肤或衣物上，以免灼伤或烧坏。
5.洗液颜色由深棕色变为绿色时，说明洗液已经失效，应停止使用，更换新液。
因重铬酸变成硫酸铬后不再具有氧化性。
注：
重铬酸钾洗液的配制
取重铬酸钾20g溶于20ml蒸馏水中，加热至沸。
冷却后再将200ml浓硫酸慢慢加入，边加边搅拌。
注意：
此时可产生高热。
为防止容器破裂，应选用耐酸搪瓷缸或耐高温的玻璃器皿，切忌用量筒及试剂瓶等配制。
为防止洗液吸收空气中的水分而被稀释变质，洗液应贮存于带盖的容器中。
当清洁效力降低时，再加入少量重铬酸钾及浓硫酸就可继续使用。
二.吸量管的使用
吸量管和定量吸（移）液器（微量加样器）均为用来转移一定体积溶液的量器。
㈠吸量管：
生化实验中常用的有三种，最常用的是刻度吸量管。
1.刻度吸量管：
⑴刻度吸量管的种类：
①按容量规格来分，有0.1、0.2、0.25、0.5、1、2、5、10ml等数种。
其精密度按不同的容积可达移取量的0.1~1%。
通常将管身标明的总容量分刻为100等分。
因此，10ml的吸量管一格代表0.1ml；1ml的吸量管一格代表0.01ml,其余类推。
②按“零”点位置来分，有“O”点在吸量管上端的（即读数从上而下逐渐增大），也有“O”点在吸量管下端的（读数从下而上逐渐增大）。
两种标示方法，在使用时各有方便之处。
③按刻度方法来分，刻度吸量管也有两种，一种是刻度刻到尖端的，将液体放出时，应吹出残留在吸量管尖端的少量液体（我实验室的刻度吸量管全部是这一种），另一种是刻度不刻到尖端的。
⑵刻度吸量管的正确使用方法：
用右手拇指和中指夹住管身，将吸量管的尖端伸入试液深处，左手持洗耳球把试液吸入管内至高过刻度以上时，迅速用右手食指按住吸量管的上口，以控制试液的泄放。
吸液后应尽量使吸量管保持垂直，使右眼与刻度等高，稍微轻抬食指或轻轻转动吸量管，使试液面缓慢降落，至管内试液弯月面的最低点与吸量管的刻度线相齐为止。
然后将吸量管插到需加试剂的容器中，让尖端与容器内壁靠紧，松开食指让液体流出。
液体流完后再等15秒钟，捻动一下吸量管后移去（如需吹的吸量管，则吹出尖端的液体后再捻转一下吸量管移去）。
⑶使用刻度吸量管的注意事项：
①选择适当规格的吸量管：
吸量管的最大容积应等于或略大于所需容积（ml数）。
②仔细看清吸量管的刻度情况：
刻度是否包括吸量管尖端的液体？
读数方向是从上而下，还是从下而上？
③拿吸量管时，刻度一定要面向自己，以便读数。
④吸取试剂时应注意三点：
一是先吹去吸量管内可能存在的残留液体，二是将吸量管插入试剂液面深部（以免吸液过程中因液面降低而吸入空气产生气泡或管内试剂进入洗耳球），三是使用洗耳球（不可直接用口吸）。
⑤按吸量管上口时应该用食指，不能用拇指。
⑥吸取粘滞性大的液体（如血液、血浆、血清等）时，除选用合适的吸管（奥氏管）外，应注意拭净管尖附着的液体，尽量减慢放液速度（用食指压力控制），待液体流尽后吹出管尖残留的最后一滴液体。
⑦使用的吸量管应干净、干燥无水。
如急用而又有水时，可用少量欲取试剂冲洗3次，以免试剂被稀释。
2.移液吸量管：
也有两种，常见的一种是吸量管的上端只有一个刻度，另一种是除了在吸量管上端有刻度外，在吸量管下端狭窄处也有一刻度线。
无论哪一种，在使用时将量取的液体放出后，只需将吸量管的尖端触及受器壁约半分钟即可，不得吹出尖端的液体。
3.奥氏吸量管：
准确度最高，使用时必需吹出留在尖端的液体。
㈡定量吸（移）液器（微量加样器）：
定量吸液器是吸量管的革新产品。
由塑料制成。
目前，因产地厂家不同其质量、价格差异十分悬殊。
1.定量吸液器的优点：
使用方便，取、加样迅速，计量准确，不易破损，能吸取多种样品（只换吸嘴即可）。
2.定量吸液器的类型：
有两种类型。
⑴固定式：
只能取加一定容量的试剂，不能随意调节取加样量。
其规格有10μl、20μl、25μl、30μl、50μl、100μl、200μl、250μl、300μl、400μl、500μl、1000μl等。
⑵可调式：
在一定容量范围内可根据需要进行调节取加样量。
例如规格为50～200μl的可调式定量吸液器，可以在50到200μl的范围内根据需要调节成设计容许的各种取加样容量（60μl、85μl、110μl、170μl、200μl等）。
一般来讲，固定式吸液器比较准确，可调式吸液器使用较为方便。
3.定量吸液器的使用方法：
⑴选择适当的吸液器。
吸液前先把吸嘴套在吸引管上，套上后要轻轻旋紧一下，以保证结合严密。
⑵持法：
右手四指（除大拇指外）并拢握住吸液器外壳（使外壳突起部分搭在食指近端），大拇指轻轻放在吸液器的按钮上。
⑶取样（吸液）：
用大拇指按下按钮到第一停止点，以排出一定容量的空气，随后把吸嘴尖浸入取样液内，徐徐松开大拇指，让按钮慢慢自行复原，取样即告完成。
⑷排液：
将吸液器的吸嘴尖置于加样容器壁上，用大拇指慢慢地将按钮按下到第一停止点，停留1秒钟（粘性较高的溶液停留时间应适当延长）。
然后再把按钮按到第二停止点上，让吸嘴沿管壁向上滑动。
当吸嘴尖与容器壁或溶液离开时，方可释放按钮，使其恢复到初始位置。
⑸吸液器用后应及时取下吸嘴。
将吸嘴用自来水冲洗后浸入盛水的容器内（以防干涸），待实验结束后集中仔细清洗。
三.溶液的混匀
1混匀的目的：
⒈使反应体系内的各种物质分子很好地互相接触，充分进行反应；
⒉使欲稀释的溶液成为浓度均一的溶液。
㈡混匀的方法通常有以下几种：
⒈使盛器作离心运动。
⒉左手持试管上端，用右手指轻击试管下半部，使管内溶液作旋转运动。
⒊利用旋涡混合（振荡）器混匀。
⒋不得已时可用干燥清洁的玻璃棒搅匀。
㈢混匀的注意事项：
⒈防止盛器内的液体溅出或被污染。
⒉严禁用手指堵塞管口或瓶口震荡混匀。
实验一、蛋白质的性质实验
（一）蛋白质及氨基酸的呈色反应
一、实验目的：
1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。
2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。
3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。
二、实验原理（呈色反应）
蛋白质分子结构中某种化学键或氨基酸残基中的某些化学基团能与特定的化学试剂产生特定的有色物质，称为蛋白质的呈色反应。
各种蛋白质分子中氨基酸残基不完全相同，因此产生的颜色也不完全一样。
当然呈色反应并不一定是蛋白质的专一反应，某些非蛋白质类物质也能产生类似折颜色。
因此，不能仅仅根据呈色反应的结果来判断被测物质是否为蛋白质。
（一）双缩脲反应（Birutreaction）
1、原理
尿素加热至180℃左右，生成双缩脲并放出一分子氨。
双缩脲在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。
蛋白质分子有肽键。
其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。
可用于蛋白质的定性或定量测定。
注意：
双缩脲反应不仅含有两个以上肽键的物质所有。
含有一个肽键和一个—CS—NH2，—CRH—NH2，—CH2—NH2—CHNH2—CH2OH，或—CHOHCH2NH2等基团的物质以及乙二酰二胺（O=C（NH2）—C（NH2）=O等物质有此反应。
NH3也干扰此反应，因为NH3与Cu2+可生成暗蓝色的络离子Cu（NH3）42+，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。
2、试剂
1）尿素10g3）2%硫酸铜溶液60mL
2）10%氢氧化钠溶液250mL5）0.5%Glu溶液
4）2%卵清蛋白溶液（1:
6）80mL
鸡蛋清用蒸馏水稀释6倍，通过2~3层纱布滤去不溶物即得。
3、操作
取少量尿素结晶（火柴头大小），放在干燥试管中。
用微火加热使尿素熔化。
熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨基酸，形成双缩脲。
冷却备用，为1号。
再取两支：
分别加入卵清蛋白溶液和Glu溶液，为2号和3号。
编号
1
2
3
双缩脲（少许）
卵清蛋白（1ml）
Glu（1ml）
10%NaOH（滴）
5
5
5
2%CuSO4（滴）
1
1
1
现象
在上述三支试管中分别进行如下操作：
加10%氢氧化钠溶液约5滴，振荡混匀，再加2%硫酸铜溶液1滴，再振荡。
观察出现的粉红颜色。
要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。
摇匀，再加2%硫酸铜溶液1滴，随加随振荡。
观察紫玫瑰色的出现。
（二）茚三酮反应
1、原理
除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α-氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。
该反应十分灵敏，1：
1500000浓度的氨基酸水溶液即能反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。
β-丙氨酸、氨和许多一级胺都呈正反应。
尿素、马尿酸、二酮吡嗪和肽键上的亚氨基不呈现此反应。
因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。
在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。
茚三酮反应分为两步：
第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个水合基本分子和氨缩合生成有色物质。
反应机理如下：
此反应的适宜pH为5~7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过在时甚至不显色。
2、试剂
1）蛋白质溶液100mL2%卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液（蛋清：
水=1：
6）
2）0.3%Glu溶液80mL3）0.1%茚三酮水溶液50mL
3、操作
取2支试管分别加入蛋白质溶液和Glu氨酸溶液1mL，再各加2~3滴0.1%茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1~2分钟，观察颜色由粉红色变紫红色再变蓝。
1（卵清蛋白）
2（Glu）
3（Tyr）
体积（ml）
1
1
1
茚三酮（滴）
3
3
3
实验三、蛋白质的性质实验（三）蛋白质的等电点测定
一、实验目的：
1、了解蛋白质的两性解离性质。
2、学习测定蛋白质等电点的一种方法。
二、实验原理
蛋白质是两性电解质。
在蛋白质溶液中存在下列平衡：
其分子中所含的自由氨基和羧基均可能解离。
当溶液的pH值大于蛋白质的等电点，氨基的解离胺到抑制而羧基的解离度增大，此时蛋白质分子为带负电荷的阴离子。
反之，当溶液的pH小于蛋白质等电点时，羧基的解离受到抑制而氨基的解离增加，而使蛋白质分子带正电荷。
蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。
当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。
不同蛋白质各有其等电点。
在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。
最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。
本实验借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。
用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制成各种不同pH值的缓冲液。
向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH即为酪蛋白的等电点。
三、实验器材
水浴钠、温度计、200ml锥形瓶、100mL容量瓶、吸管、试管、试管架、乳钵
四、实验试剂
1、0.5%酪蛋白醋酸钠溶液200mL
取纯酪蛋白（干酪素）0.05g加蒸馏水20mL及1mol/LNaOH溶液5mL，混合使之溶解，再加1mol/LHAc溶液5mL，定容至50mL即可。
2、1.00mol/L醋酸溶液100mL
3、0.10mol/L醋酸溶液100mL
4、0.01mol/L醋酸溶液50mL
五、实验操作
1）取同样规格的试管5支，按下表顺序分别精确地加入各试剂，然后混匀。
试剂
编号
蒸馏水
（mL）
0.01mol/L醋酸
（mL）
0.1mol/L醋酸
（mL）
1.0mol/L醋酸
（mL）
pH
1
4.19
0.31
—
—
5.9
2
4.37
—
0.13
—
5.3
3
4.0
—
0.5
—
4.7
4
2.5
—
2.0
—
4.1
5
3.7
—
—
0.8
3.5
pI
2）向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL，加一管，摇匀一管。
此时1、2、3、4、5管的pH依次为5.9、5.3、4.7、4.1、3.5。
观察其混浊度，静置10分钟，再观察其混浊度。
最混浊的一管即为酪蛋白的等电点。
实验十四、酶的性质
一、实验目的
1.通过本实验观察、验证酶的专一性和温度、pH、激动剂及抑制剂对酶活性的影响。
2.熟悉淀粉及其酶解产物的特殊显色方法；电热恒温水浴的使用。
3.了解唾液淀粉酶的收集与预处理。
二、实验原理
酶具有高度专一性，一种酶只能催化一种或一类底物发生反应，如淀粉酶只能水解淀粉，不能水解蔗糖。
当淀粉被淀粉酶彻底水解为还原性麦芽糖和葡萄糖时，能使班氏试剂的Cu2+还原成Cu1+，生成砖红色Cu2O沉淀。
淀粉酶的活性受温度、pH、激动剂及抑制剂、酶浓度以及作用时间等多种因素影响，因而水解淀粉生成一系列分子大小不同的糊精。
不同程度的水解糊精可与碘反应生成紫色、棕色或红色络合物。
通过上述特征性反应，并以蔗糖等作对照，便可观察、验证淀粉酶是否具有专一性以及它的催化活性是否受到影响。
三、试剂和器材
（一）、器材
1、滴管、烧杯、试管（架）及试管夹。
2、恒温水浴箱与水浴锅。
3、脱脂棉、漏斗及纱布。
4、白瓷反应盘
（二）试剂
1、1％淀粉 称取淀粉1g，加少量水调成糊状，加入煮沸的0.3％NaCl溶液至100m1。
2、1％蔗糖溶液
3、班氏试剂 A液：
取柠檬酸钠173ｇ，无水碳酸钠100ｇ，加水600ml，加热溶解，冷却后稀释至850ml；B液：
取结晶硫酸铜（CuSO4·5H2O）17.3ｇ溶于100ml预热的蒸馏水中，冷却后加水至150ml。
将A液缓慢倒入B液中混匀置试剂瓶备用。
4、碘液：
称取碘4g、碘化钾6g溶于l000ml蒸馏水中，置棕色瓶内贮存备用。
5、各种pH缓冲液
（1）pH6.8缓冲液：
取0.2mol/LNa2HPO4溶液772ml，0.1mol/L柠檬酸溶液228ml混合即成。
（2）pH4.0缓冲液：
取0.2mol/LNa2HPO4溶液385.5ml，0.1mol/L柠檬酸溶液614.5ml混合即成。
（3）pH8.0缓冲液：
取0.2mol/LNa2HPO4溶液972ml，0.1mol/L柠檬酸溶液28ml混合即成。
6、0.9％NaCl溶液7、1％CuSO4溶液 8、1％Na2SO4溶液
四、操作步骤
（一）、唾液淀粉酶的收集与处理
1.制备唾液
实验者先将痰咳尽，用自来水漱口，以清除口腔内食物残渣，再在口腔内含蒸馏水约15ml，并作咀嚼咕漱运动，3分钟后吐入垫有两层经润湿处理的脱脂纱布的漏斗内，过滤于小烧杯中备用，为与下面稀释唾液相区别，此称制备唾液。
2.煮沸唾液
取上述唾液约2ml，盛入1中号试管中,置沸水浴煮沸5分钟备用。
3.稀释唾液
调整唾液淀粉酶活性，使之在pH6.8、37℃和既无激动剂又无抑制剂条件下，作用5min，水解淀粉至红色糊精为宜。
具体做法是取12凹白瓷反应板一块，按下列步骤操作：
①第1排每凹各加1滴制备唾液，12、13、14凹分别加生理盐水1、2、3滴，用滴管采用抽吸法，由稀到浓（14→12）小心混匀各凹，勿使溅入相邻凹中。
每混匀一凹便取其1滴放入同列的2排凹中，剩余稀释唾液应全部放回原凹中。
②在盛有不同稀释度唾液的第2排各凹中，均加入4滴缓冲液（pH6.8），2滴1%的淀粉液和2滴蒸馏水，用①混匀法充分混匀，置37℃下5min。
③在第2排各凹中加I液一滴，混匀，观察比较各凹颜色，以浅棕-红色对应的稀释倍数，用生理盐水稀释3ml制备唾液备用。
（二）唾液淀粉酶的专一性以及温度、pH、激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活性影响的观察
1、取试管3支编号，按下表1操作
表1 唾液淀粉酶专一性的实验观察
试剂
试管
pH6.8缓冲液
1％淀粉溶液
1％蔗糖溶液
制备唾液
煮沸唾液
1
20滴
10滴
－
5滴
－
2
20滴
10滴
－
－
5滴
3
20滴
－
10滴
5滴
－
将上述各管混匀后，置37℃水浴中保温10分钟，然后每管加入班氏试剂20滴，再放入沸水浴中煮沸约15分钟，观察各管颜色反应，并说明原因。
（三）温度影响酶促反应的实验观察
1.取试管3支编号，按下表2操作：
表2 温度影响酶促反应的实验观察
管号
试剂
1
2
3
1.pH6.8缓冲液
20滴
20滴
20滴
2.1％淀粉溶液
10滴
10滴
10滴
3.预热5min
37℃水浴
沸水浴
冰浴
4.直接加入稀释唾液，立即混匀、计时
5滴
5滴
5滴
5.保温10min
37℃水浴
沸水浴
冰浴
2.将一、二管移入冰水浴中，待各管温度一致后速向各管加入碘液1滴，混匀后观察各管颜色的区别，并说明温度对酶促反应的影响。
（四）、pH影响酶促反应的实验观察
1.取试管3支编号，按下表3操作：
表3 pH影响酶促反应的实验观察
pH4.
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