生物技术实践生物选修一知识复习图解.docx

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生物技术实践生物选修一知识复习图解

选修1《生物技术实践》知识归纳图解

微生物的实验室培养

（一）培养基的基本知识

1．培养基的营养成分

营养物质

定义

作用

主要来源及所涉及的微生物

碳源

凡是能提供微生物所需碳元素的物质

构成生物细胞、生物体及细胞代谢产物，有些能为异养生物提供能源

无机化合物：

C02、NaHC03等（自养生物）

有机化合物：

糖类、脂质、花生粉饼、石油等（异养生物）

氮源

凡是能提供微生物所需氮元素的物质

合成蛋白质、核酸及含氮的代谢产物，也可为异养微生物提供能源

无机化合物：

N2、NH3、铵盐、硝酸盐，自养生物有机化合物：

尿素、牛肉膏、蛋白胨等，异养生物

水分

生物体内含量最高的组成成分，分为结合水和自由水

良好的溶剂、细胞生活及生化反应的介质、参与物质运输及参与生化反应的反应物

培养基、大气、代谢产物

无机盐

为微生物提供大量除C、H、0以外的各种元素

细胞组成成分，生命调节物质，自养菌的能源或其他营养来源，酶的激活剂

培养基、大气等环境

生长因子

微生物正常生长繁殖，必不可少的微量有机物

可作为酶与核酸等的组成成分

维生素、氨基酸、碱基等

高考警示钟

自养微生物与异养微生物所需的营养物质不同

（1）自养微生物所需的碳源、氮源来自含碳、含氮的无机物，而异养微生物需要的碳源、氮源来自含碳、含氮的有机物，因此可根据培养基中营养物质判断微生物的代谢类型。

（2）含氮无机物不但能给自养微生物提供氮源，也能作为能源物质，提供能量，如NH3既作为硝化细菌的氮源也作为能源。

2．培养基的配制原则

（1）目的明确。

要根据微生物的种类、培养目的等选择原料、配制培养基。

（2）营养要协调。

各种营养物质要保证适当的浓度和比例。

营养物质比例过低，不能满足微生物生长；浓度过高则会抑制微生物的正常生长。

营养物质的浓度比（如C/N）还会直接影响某些微生物的代谢产物，如谷氨酸生产，C/N=4∶1时，菌体大量繁殖，谷氨酸产量少；而C/N=3∶1时，菌体繁殖受抑制，但谷氨酸合成量大。

（3）pH要适当。

不同微生物生长所需pH不同。

如细菌pH保持在6.5～7.5之间；放线菌保持在7.5～8.5之间；真菌应保持在5.0～6.0之间。

3．培养基的分类及作用：

培养基种类很多，作用也不同。

根据不同的分类标准，可将培养基分为不同种类。

划分标准

培养基种类

特点

用途及实例

物理性质

液体培养基

不加凝固剂

工业生产

半固体培养基

加凝固剂，如：

琼脂

观察微生物的运动、分类鉴定、保藏菌种

固体培养基

微生物分离、鉴定、活菌计数、

化学成分

天然培养基

含化学成分不明确的天然物质

工业生产

合成培养基

培养基成分明确（用化学成分已知的化学物质配成）

分类、鉴定

用途

选择培养基

培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长

培养、分离出特定微生物（如：

培养酵母茵或霉菌，可在培养基中加入青霉素；培养金黄色葡萄球菌，可在培养基中加入高浓度食盐）

鉴别培养基

根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品

鉴别不同种类的微生物，如可用伊红一美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌（若有，茵落呈深紫色，并带有金属光泽）

说明：

①病毒为非细胞结构的生物体，专营活细胞寄生，目前不能利用人工培养基来培养，需接种在动植物组织中才能增殖。

常用于培养病毒的是活鸡胚。

②加入培养基中的凝固剂（如琼脂），一般不能被微生物利用，只起到凝固作用。

③选择培养基一般只生长具有特定的微生物，鉴别培养基可以存在其他微生物，而且能鉴别特定的微生物。

注意：

选择培养基的选择方法

（1）在培养基中加入某种化学物质。

例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。

这里的加入是在主要营养成分完整的基础上加入。

（2）改变培养基中的营养成分。

例如缺乏氮源时可以分离出固氮微生物；石油作为惟一碳源时，可以分离出消除石油污染的微生物。

（3）改变微生物的培养条件。

例如，将培养基放在高温环境下培养，可以得到耐高温的微生物。

（二）灭菌技术

1．无菌技术的概念

在微生物培养中，获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌入侵，其主要技术是无菌操作。

无菌技术是指通过一定物理、化学的手段，防止实验室培养物被外来微生物污染。

无菌技术主要围绕如何避免杂菌污染展开的。

2．消毒、灭菌的方法

项目

概念

常用方法

应用范围

消毒

使用较为温和的物理或化学方法，仅杀死物体表面或内部一部分对人体等有害的微生物（不包括孢子和芽孢）

巴氏消毒法：

70～75℃水中煮30min或在80℃水中煮15min

一些不耐高温的物体如牛奶

煮沸消毒法：

在100℃水浴中煮沸5～6min

一般物品

化学药剂消毒法：

用乙醇、氯气、漂白粉、KMnO4等药剂来杀死或抑制细菌生长或繁殖

可用来对环境、双手和衣物等消毒

紫外线消毒法：

30W紫外灯照射30min

接种室

灭菌

使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子

灼烧灭菌法：

酒精灯火焰

接种工具如接种环、接种针等

干热灭菌法：

在160～170℃加热1～2h

如玻璃器皿（吸管、培养皿）和金属用具

高压蒸汽灭菌：

压力为100kPa，温度为12l℃的条件下，维持15～30min

培养基及容器的灭菌

注意：

①无菌操作是微生物培养过程中，防止杂茵污染的关键步骤。

②消毒只能消灭或抑制营养体的活动，而不能达到彻底灭菌。

酒精消毒用体积分数为70%的酒精效果最好，因浓度过高，会使菌体表面蛋白凝固成一层保护膜，乙醇分子不能进入其中；浓度过低，杀菌力减弱。

而灭菌除杀死营养体外，还必须杀死芽孢和孢子。

③灭菌消毒的原理，就是通过一定理化手段，使病原茵蛋白质变性，失去生命活性。

（三）微生物的纯化培养技术

1．常用细菌培养基——蛋白胨培养基配制流程：

2．纯化大肠杆菌

Ⅰ．原理：

在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞，使其长成单个的菌落，这个菌落就是纯化的细菌菌落。

Ⅱ．微生物接种方法：

（1）平板划线法：

平板划线法中细胞的分离和稀释过程发生在接种环在固体平板表面上的划线和移动过程中。

在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成纯种的单个菌落。

（如图）

（2）稀释涂布平板法：

10倍系列稀释操作

划线操作时注意：

（1）用接种环取菌种之前、每次划线之前和划线结束都要进行灼烧灭菌，灼烧后要在酒精灯附近冷却后再操作；（第一次操作：

杀死接种环上原有的微生物。

每次划线之前：

杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端。

划线结束后：

杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者）

（2）划线时不要划破培养基，如果采用分段划线法操作从第二次操作应总在上一次划线末端开始，首尾区不能相连；

（3）操作必须始终在酒精灯火焰旁进行。

涂布操作时注意：

（1）配制系列梯度稀释液时，所用的试管和移液管均需灭菌，必须用无菌水配制；

（2）涂布器用70%的酒精消毒，多余酒精在烧杯中滴尽，沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰引燃。

不要将过热的涂布器放入盛有酒精的烧杯中，一面引燃其中的酒精；

（3）配制系列梯度稀释液和转移菌液以及涂布过程等必须都在酒精灯火焰旁进行，移液管头不能接触任何物体。

3．菌种的保存

①对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。

②对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。

注意：

①菌种保藏的原理是：

低温、干燥和隔绝空气，使微生物代谢能力和繁殖能力降低。

②不同菌种的保藏方法因不同菌种而异。

需氧型，必须低温有氧，而厌氧型必须低温无氧；腐生微生物可提供牛肉膏蛋白胨培养基，而寄生微生物需提供活体组织等非人工培养基，如病毒需提供活鸡胚。

（三）微生物的筛选与计数（以“土壤中分解尿素的细菌”为例）

菊花的组织培养

果胶酶在果汁生产中的作用

一、果胶酶的组成和作用：

包括多聚半乳糖醛酸酶、果胶分解酶、果胶酯酶等。

果胶酶能分解果胶，瓦解植物的细胞壁及胞间层。

其实质是果胶分解成可溶性的半乳糖醛酸。

注意：

①果胶酶是分解果胶的一类酶的总称，不是一种酶。

②植物、霉菌、酵母菌等细胞均能产生果胶酶，但通常动物细胞不产生果胶酶。

③在植物细胞工程中，应用纤维素酶和果胶酶来破坏细胞壁，获得原生质体。

二、探究温度对果胶酶活性的影响

（1）实验原理：

果胶酶活性受温度影响，处于最适温度时，活性最高；低于或高于最适温度，酶活性受到抑制。

即果肉的出汁率、果汁的澄清度与果胶酶的活性大小成正比。

（2）设计思路：

设置一系列梯度温度，从中选出酶活性最高的温度，然后再以该温度为中心，缩小温度梯度向两个方面各设置梯度温度，以进一步确定最适温度范围。

所选择的温度只能接近最适温度，但不一定就是最适温度。

（3）实验操作流程及注意事项

注意：

①每个探究实验的设计，都要遵循实验设计的一般原则，特别是单因子变量控制原则。

②每个探究实验的设计思路希是大梯度差值寻找最适范围，再小梯度差值选出最适温度、pH或酶用量。

③如果随酶浓度增加，果汁体积也增大，说明酶用量不足；当酶用量达一定值时，再增加酶用量，果汁体积不变，则说明这个值就是酶的最适用量。

④如果变量（温度、pH、酶浓度）梯度无法满足实验，即出现过高、过低等现象，则应及时调整实验。

血红蛋白的提取和分离

一、实验原理：

蛋白质的物化理性质：

形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。

1．凝胶色谱法（分配色谱法）：

（1）原理：

分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。

（2）凝胶材料：

多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。

（3）分离过程：

混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子洗脱：

从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。

（4）作用：

分离蛋白质，测定生物大分子分子量，蛋白质的脱盐等。

2．缓冲溶液

（1）原理：

由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。

（2）缓冲液作用：

抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。

3．凝胶电泳法：

（1）原理：

不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。

（2）分离方法：

琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。

（3）分离过程：

在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。

二、实验步骤及注意事项

胡萝卜素的提取

一、胡萝卜素基础知识

1．原理：

根据胡萝卜素易溶于有机溶剂的特点，可采取有机溶剂萃取的方法来提取胡萝卜素。

即将粉碎、干燥的植物原料用有机溶剂浸泡，使胡萝卜素溶解在有机溶剂中，再蒸发出有机溶剂可获得。

2．萃取剂的选择

（1）有机溶剂的分类：

分为水溶性（如乙醇和丙酮）和水不溶性（如石油醚、乙酸乙酯、乙醚、苯、四氯化碳）两类。

多数对人体有一定毒性。

（2）选取萃取胡萝卜素的有机溶剂的原则

①具有较高的熔点，能够充分溶解胡萝卜素，并且不与水混溶；②萃取效率高；③对人无毒、不易燃、易与产品分离、不影响产品质量

萃取胡萝卜素的有机溶剂应该具有较高的沸点，能够充分溶解胡萝卜素且不与水混溶。

另外，还要考虑对人体是否有毒性等安全问题。

因乙醚的沸点较低，苯和四氯化碳对人体有毒性，所以本实验选用石油醚或乙酸乙酯作为萃取剂。

二、操作流程及注意：

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