基因工程原理复习重点1.docx
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基因工程原理复习重点1
1.基因家族（Genefamily）
又叫多基因家族（Multigenefamily），系指同一生物体中，从同一祖先基因经过复制、突变而来的一组具有相似的核苷酸序列结构、相似产物、相似功能的基因群体。
从广义上讲，同一基因家族的各个成员也可看作是重复基因。
但两者相比，基因家族不同成员之间的序列差异毕竟要比重复序列的大一些，也就是说序列一致性程度还是较低一些。
2.基因簇（Genecluster）
系指原核生物基因组中，由不同的或相关的一组相邻基因组成的一种特殊的排列组合方式。
3.基因家族与基因簇二者的区别
属于同一多基因家族的各个成员，可以存在于不同的染色体上，也可以是存在于同一条染色体上。
同一基因家族成员的判断标准：
a．多重性；b．紧密的连锁性；c.核苷酸序列同源性；d.相关的表型与功能。
基因簇的特点：
a．同一基因簇的不同成员，在遗传上往往是紧密连锁的；
b．同一基因簇的不同成员，可以是同属于同一个操纵子的不同结构基因，也可以是属于不同操纵子的不同结构基因。
c．同一基因簇的不同成员，可以是来自同一基因家族的不同成员，也可以是来自不同基因家族的不同成员。
4.基因图（Genemap）：
是描述染色体或DNA大分子上，不同基因的排列顺序及其间隔距离的一种线性图。
5.基因作图（Genemapping）：
按照遗传学的方法或者是物理学的方法绘制基因图的过程，叫做基因作图。
基因作图有时也叫做基因定位。
它涉及如下两个具体的内容：
a.其一是确定被研究的目的基因与细胞染色体之间的关系，也就是说将目的基因定位在某条特定的染色体分子上。
b.其二是测定目的基因与所在染色体的其它基因之间的间隔距离，以及它们之间的线性排列顺序，亦即是确定目的基因在染色体上的位置。
基因图包括遗传图和物理图两种。
两者之间的本质差别在于前者表示的是以重组率为单位的基因间的相对距离，而后者表示的是以碱基对（bp）为单位的基因间的实际距离。
6.基因增加（Geneaddition）：
与基因扩增概念不同，它是通过将一种或一群外源基因导入受体细胞，从而使受体细胞中基因种类增加，用以观察并研究其功能作用的一种基因工程策略。
7.基因扩增（Geneamplification）:
特指基因拷贝数增加的过程，包括如下5种不同情况：
①在体外，应用PCR技术和适当的引物，可使特定基因的拷贝数得到成功的扩增。
②克隆，将基因插入到高拷贝数的质粒分子上，于是在体内情况下该基因的拷贝数也变得相应富裕起来。
③一些外界环境的压力因素可以使真核细胞产生适应性反应，从而导致相应的保卫基因发生明显扩增。
例如，高剂量的氨甲喋呤可导致二氨叶酸还原酶基因发生扩增。
④程序基因扩增。
包括全基因组扩增和选择性扩增两种模式。
前者是指通过增加细胞基因组的拷贝数，而使特定基因的拷贝数得意增加；后者是指因特定发育需要而偶尔增加对其产物需求量高的基因的拷贝数。
例如，非洲爪蟾在发育过程中rRNA基因的扩增。
⑤进化扩增，在生物进化过程中发生基因加倍和扩增，结果使相关的基因在基因组上聚集成簇。
8.5'-侧翼序列区和3'-侧翼序列区
（1）5'-侧翼序列区（5'-flankingsequenceregion）
位于mRNA转录起点之前的一段长度有限的DNA序列区，叫做5'-侧翼序列区，或者泛称为启动子区。
在该区存在着数种控制基因转录的信号：
a.确定mRNA起点的信号b.决定最大转录起始速率的信号
c.对环境刺激作出反应的信号d.对发育程序作出反应的信号
e.增强子序列区
（2）3'-侧翼序列区（3'-flankingsequenceregion）
位于mRNA转录终点之后的一段长度有限的DNA序列区，叫做3'-侧翼序列区，也叫做3'-下游序列区。
在该区存在着数种控制基因转录的信号：
a.终止转录作用的信号
b.mRNA3'-末端的加工信号
c.大多数真核基因的3'-末端还有一段poly（A）加尾信号，即多聚腺苷酸化信号
9.前导序列区和尾随序列区
（1）前导序列区（leadersequenceregion）
指位于mRNA5'-末端，起始密码子之前的一段长达数百个核苷酸的不转译的RNA区段，也叫前导序列或5'-非转译区，简称5'-UTR。
它含有如下两种元件：
a.核糖体结合位点（Ribosome-bindingsite,RBS）
b.转译起始信号
（2）尾随序列区（trailersequenceregion）
指位于mRNA3'-末端，终止密码子之后的一段非转译的核苷酸序列，叫做尾随序列区，也叫做尾随序列或3'-非转译区，简称3'-UTR，其长度约为100个核苷酸左右，它含有一个转录终止信号。
10.真核基因和原核基因
真核基因：
真核细胞核基因组DNA编码的基因，以及感染真核细胞的DNA病毒和反转录病毒基因组编码基因，统称真核基因。
原核基因：
由原核生物染色体基因组DNA以及高等生物线粒体基因组DNA和叶绿体基因组DNA编码的基因，都属于原核基因。
11.真核基因与原核基因的共有组成部分
无论真核基因还是原核基因，其结构都有如下4个部分：
a.编码区（codingregion）b.非编码区（noncodingregion）
c.启动区（promoterregion）d.终止区（terminatorregion）
1.编码区
（1）编码区的含义：
在原核蛋白质编码基因的mRNA分子中，以及在真核蛋白质编码基因的成熟mRNA分子中，从起始密码子（通常是AUG）开始至终止密码子（UAA,UAG,UGA）为止的一段编码氨基酸的核苷酸序列，叫做编码区，或称编码序列区。
（2）不连续的编码序列区：
真核基因结构的主要特征是，许多真核蛋白质编码基因以及某些tRNA基因，它们的转录序列区都是被一种叫做间隔子（intron）的非编码序列所间断，形成不连续的编码序列区。
（3）编码区段与读码框：
编码区与开放读码框（openreadingfram）在概念上是有差别的。
开放读码框（ORF）也有的叫可读框，是指由一系列氨基酸密码子组成的不具有终止密码子的DNA序列区，或者说是可以转译成蛋白质多肽链的一段DNA序列区。
它与编码区的差别在于它不包括终止密码子，而编码区则包括终止密码子。
2.非编码区
（1）非编码区的定义：
基因中转录而不转译的核苷酸序列区。
尽管这些非编码序列区不转译成蛋白质多肽链产物，但对基因的表达与调控却是必不可少的。
（2）非编码区的类型
a.5'-末端非转译区（5'-UTR）
b.3'-末端非转译区（3'-UTR）
c.间隔子序列区（真核蛋白质编码基因中存在）
3.启动区（启动子）
（1）启动区的定义：
相应于原核的启动区（promoter）在真核基因中则往往译作启动子，特指位于基因５'-末端上游紧邻转录起点外侧，一段具有特殊功能的非编码的核苷酸序列区。
在有关的文献中，启动区的定义似乎不那么严格，有时人们也把５'-侧翼序列区泛称为启动区。
从广义的角度讲，控制基因转录的各种信号的任何组合都可以称之为启动区。
例如有人也把增强子（enhancer）归为真核基因启动子的一个组成元件．
（2）启动区的结构
原核基因启动区的结构：
a.－１０元件，亦叫－１０box或Pribnowbox，也可称之为TATAATbox；
b.－３５元件，也叫做－３５box，或ＴＴＧＡＣＡbox。
真核基因启动子的结构：
a.－２５元件，亦叫ＴＡＴＡ盒；
b.上游激活元件：
ＧＣbox和ＣＡＡＴbox。
（3）启动区的类型：
根据识别启动子的ＲＮＡ聚合酶的类别，可将真核启动子分成三种不同的类型：
a.Ｉ型启动子b.Ⅱ型启动子c.Ⅲ型启动子
4.终止区
（１）终止区的定义：
（terminatorregion）也叫做终止序列，一般特指位于原核生物操纵子
３'-末端，也是转录单位３＇-末端转录终止位点之后的一段ＤＮＡ序列，其功能是为ＲＮＡ聚合酶提供转录终止信号。
终止子（terminator），也叫做转录终止子或终止序列，是指位于真核基因３＇-末端下游外侧与转录终止位点相连的一段非编码的核苷酸序列区。
它具有使ＲＮＡ转录反应终止的转录终止信号的功能。
（2）终止区的意义（功能）：
a.保证基因的转录反应在正确的位置终止；b.产生正确长度的ｍＲＮＡ分子；
c.产生正确的蛋白质多肽链；d.避免产生通读现象。
12.原核基因组的结构
（1）大肠杆菌基因组的组成：
染色体基因组；质粒基因组；噬菌体基因组。
（2）大肠杆菌基因组的结构特点（有4点）：
*１．高效的遗传信息利用率
a.既没有不必要的额外重复序列，也极少存在无功能的冗余序列；
b.基因组９８％以上的核苷酸序列都是编码基因
c.基因排列紧凑，同一个操纵子不同基因之间的间隔距离一般不超过２０bp，而且其中还存在着转录起始信号和终止信号；
d.存在着编码序列彼此重叠、编码不同蛋白质的重叠基因
*2.双链ＤＮＡ的编码功能
关于正义链和反义链的划分，文献中有两种不同的意见：
早期文献：
a.转录ＲＮＡ转录本的模板链，叫做正义链，也叫做有义链或编码链，简称（＋）链。
b.与正义链互补的ＤＮＡ链，叫做反义链，也叫无义链或非编码链，简称（－）链。
现在的文献：
a.双链ＤＮＡ分子中转录ＲＮＡ转录本的模板链，叫做反义链或非编码链，简称（－）链。
b.双链ＤＮＡ分子中模板链的互补链，叫做编码链，又叫正义链，简称（＋）链。
除了以Ｕ取代Ｔ之外，它与ＲＮＡ转录本具有同样的核苷酸序列结构。
Ｅ.coli基因的编码序列，并非都是位于基因组ＤＮＡ中某一条固定的单链上。
也就是说基因组ＤＮＡ的两条链，并没有规定哪一条是正义链，哪一条是反义链。
而是在双链ＤＮＡ（基因组）的任何一条单链中，都同时存在着正义链和反义链。
对基因组是如此，但对单个基因则不然。
*3.多基因聚集排列的操纵子结构形式
大肠杆菌基因组结构的另一个特点是，若干功能相关的基因往往聚集在一起形成独立的操纵子结构。
操纵子的一般结构：
a.一个或数个调节基因b.若干个结构基因，小的操纵子只有三个基因。
大的操纵子有11个结构基因。
c.上游控制单元，包括操纵单元和启动区。
*4.染色体基因组的拷贝数
大肠杆菌染色体基因组的拷贝数，也就是说究竟一个细胞同时能拥有几条染色体。
这是依细菌的生长条件而定：
a.在营养富裕的培养基中，每个细胞可同时拥有３～４条染色体分子。
b.在碳源供应不足的培养基中，平均每个细胞只拥有1.1条染色体
13.原核基因的结构：
*1.原核基因ＤＮＡ序列的结构：
a.启动区序列；
b.转录序列区：
（５’-ＵＴＲ；ｃＤＮＡ序列区－编码区；３’-ＵＴＲ）；
c.:
终止序列区
*2.原核基因ｍＲＮＡ的结构:
（a）启动区（b）转录序列区：
①5’-UTR②编码区，包括起始密码子和终止密码子；③3’-UTR（c）终止区
14.真核基因的特点：
（1）与原核基因不同，真核基因往往含有内含子（intron），它是被包围在编码区之中的非编码序列；
（2）真核基因是单顺反子，编码单基因产物，而原核基因则往往组成大的转录单位多顺反子，即单一的mRNA分子可编码多种基因产物；
（3）成熟的蛋白质基因的mRNA分子的5’-端有一个帽的结构，3’-端有一个Poly（A）尾巴。
15.真核基因组的结构特点：
*1.包装成特定的染色体结构；真核基因组DNA不是裸露的，而是被包装成若干条甚至数十条不同的染色体，这是真核基因组的一大特点。
*2.基因组的多倍性；大多数真核生物都是二倍体，具有两套分别来自双亲的完整的基因组。
而且有些高等植物还是多倍体，拥有多拷贝的基因组。
*3.具有大量的重复序列；重复序列的类型：
低度～，中度～，高度～
重复序列的排列方式：
①串联重复排列②分散重复排列
*4.高比例的非编码的DNA序列；在真核生物基因组DNA中含有大量的非编码的DNA序列，包括基因与基因之间的非编码的DNA序列，以及基因内部的非编码的DNA序列。
以人为例，非编码序列占基因组总长的98%以上，而蛋白质编码基因的序列还不到基因组总长的2%。
*5.庞大的基因数量；拟南芥25，000种左右，水稻40，000种左右，人类24，000个左右。
16.隐蔽基因定义：
位于基因组蛋白质编码基因之间的非编码的DNA序列中，只编码RNA不编码蛋白质的一类RNA基因，叫做隐蔽基因。
17.断裂基因：
在转录区的核苷酸序列区中，插入有与氨基酸编码无关的DNA间隔序列区，使一个基因的编码序列分隔成若干个不连续区段的基因，叫做断裂基因，包括内含子（intron）和外显子（exon）。
18.真核基因的结构
（1）真核基因DNA序列水平的结构:
a.启动子序列区b.转录序列区c.终止子序列区
（2）真核基因pre-mRNA的结构：
a.5’-UTRb.外显子
c.内含子d.3’-UTR序列
（3）真核基因成熟mRNA的结构（五部分）：
真核蛋白质mRNA前体（pre-mRNA）经过剪辑加工（去掉间隔子、加帽和加尾）成熟后，被输送到细胞质。
a.5’-帽的结构b.5’-UTR序列c.编码序列
d.3’-UTR序列e.3’-端poly（A）尾巴
19.增强子（enhancer）
又叫做增强子元件或增强子序列，是真核基因中发现的一种特异序列，能够在距离目标基因50kb以上的位置，从上游或下游的不同位置及方向增强该基因的转录活性。
一般是位于真核基因5’-侧翼序列区，但也有的是位于转录区和3’-侧翼序列区。
增强子的功能作用：
成环作用；
增强子可影响模板附近的DNA超螺旋的密度（结构），诸如导致DNA超螺旋弯曲，或是在反式作用因子参与下，以蛋白质之间的相互作用为媒介，使增强子和启动子之间的DNA“成环”的连接模式起始转录。
固定作用
将模板固定在细胞内特定位置，如连接在核基质上，有利于拓扑异构酶改变DNA双螺旋结构张力，有利于促进RNA聚合酶在DNA链上的结合与滑动。
引导作用
可以为反式因子或RNA聚合酶
提供进入染色体结构的“进入位点”。
20.基因的分类
（1）按拷贝数分：
单拷贝基因，多拷贝基因
（2）按产物类型分：
结构基因，调节基因
（3）按表达特性分：
组成基因，诱导基因
（4）按实验用途分：
选择基因，报告基因
（5）按排列组合特点分：
基因家族，基因簇
选择基因：
指可使被转化的细胞获得其亲本细胞所不具有的新的遗传特征，从而使得人们能够使用特定的选择培养基，将转化的新细胞（即转化子），从其亲本细胞群体中选择出来的一类特殊的基因。
报告基因：
特指其编码产物能被快速检测，常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞、器官或组织的一类特殊基因。
21.基因工程诞生的理论基础
（1）20世纪40年代确定了遗传信息的携带者（分子载体）是DNA而不是蛋白质。
（2）20世纪50年代的双螺旋结构模型与半保留复制机理
（3）20世纪50末60初，科技工作者提出中心法则和操纵子学说，遗传密码的破译，阐明了信息流的方向。
22.基因工程诞生的技术基础
（1）核酸内切限制酶，DNA的体外切割与连接，DAN连接酶；
（2）DNA核苷酸测序技术；
（3）基因克隆载体的发展与应用；（4）大肠杆菌遗传转化技术的建立；
（5）琼脂糖凝胶电泳技术应用；（6）核酸杂交技术的应用。
23.酶的分类:
氧化还原酶类，转移酶类，水解酶类，异构酶类，裂解酶类，连接酶类。
24.共线性的概念
（1）位于同一条染色体DNA或DNA分子上不同基因的位置排列关系；
（2）不同物种中DNA的排列关系；
（3）位于DNA分子及其转录本RNA分子间的共线性；
（4）mRNA密码的顺序与蛋白质氨基酸顺序。
25.切口（Nick）：
在双链DNA的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂。
裂口（Gap）:
指双链DNA分子的某一条链上，失去一个或连续几个核苷酸时所出现的DNA单链断裂。
DNA连接酶无法封闭裂口。
26.核酸内切限制酶：
是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。
27.Ⅱ型核酸内切限制酶的特点
（1）与Ⅰ型、Ⅱ型不同，不具备多亚基的结构，可在没有修饰的情况下切割；
（2）识别双链DNA分子的限制位点；
（3）切割位点发生两条链切割，形成互补黏性末端；
（4）酶切反应不需要能量；
（5）因两个单链切割部位是交错的，黏性末端互补。
28.影响核酸内切限制酶活性的因素
（1）DNA的分子特性
a识别位点周围核苷酸碱基成分可影响其底物DNA消化的速率，有时达25倍；
b特定DNA分子中所具有的目标限制位点的密度；
c完全超螺旋DNA分子比线性DNA分子消化时需要更多的酶；
dDNA分子的甲基化程度，如果位点发生甲基化，会强烈干扰核酸内切限制酶的活性。
（2）酶切消化反应的温度，大多最适温度为37℃。
（3）DNA制剂的纯度对酶切活性的影响，制剂中的污染物：
酚，氯仿，蛋白质，酒精，甘油，高盐，SDS,EDTA等；
29.星号活性：
在反应条件发生变更的情况下，核酸内切限制酶便失去了切割其固有识别序列的能力，而会在新的识别序列上发生DNA分子切割。
这种发生了改变的限制酶活性，叫做星号（*）活性，或限制酶星号活性。
产生星号活力的原因：
（1）酶用量的单位数与DNA用量的比值过高，超过10U/μg；
（2）甘油浓度不可超过5%；（3）二价离子Mg2+被Mn2+、Cu2+Zn2+Ca2+取代；（4）Mg2+浓度低于25mmol/L
（5）BufferpH不能高于8；（6）有机溶剂的干扰。
30.DNA分子体外连接条件
（1）一条DNA链3’端存在游离的3’-OH
（2）一条DNA链5’端存在游离的5’-磷酸基团
（3）连接体系需要能量ATP
31.碱性磷酸酶的类型：
a细菌碱性磷酸酶（BAP）b小牛肠碱性磷酸酶（CIP）
32.平末端DNA片段连接的方法
（1）T4DNA连接酶连接法
（2）同聚物加尾法（3）限制片段末端修饰法
（4）衔接物连接法（5）DNA接头连接法
33.T载体结构上有哪些优点？
（1）T载体是一种线性双链DNA，不需切割，即可扩增PCR产物；
（2）3’–T单核苷酸延伸末端，可直接与PCR产物具有3’–A单核苷酸延伸的分子进行碱基互补；
（3）线性载体已经脱去5’–P，自己不会再环化；
（4）T载体中设计了LacZ基因，可通过显色反应X–gal显色反应分离重组体；
（5）在T载体的3’末端附近还设计了多个核苷酸酶切位点，便于进行多种亚克隆；
（6）T载体含有T7，SP6两种启动子，便于测序。
34.理想的质粒载体应具备的条件（载体的结构特点）：
（1）必须具备复制起点；
（2）具有抗生素抗性基因；
（3）具有若干核酸内切限制酶的酶切位点；
（4）具有较小的分子量，较高的拷贝数。
35.λ噬菌体基因组结构
（1）左侧区，自基因A到基因J，包括参与噬菌体头部蛋白质和尾部蛋白质合成所需要的全部基因；
（2）中央区，介于基因J与基因N之间，非必要区，编码的基因与保持噬菌斑形成能力无关，但包含了一些与重组有关的基因，以及使噬菌体整合到大肠杆菌染色体中取的int基因，和把原桑菌体从寄主染色体上删除下来的xis基因；
（3）右侧区，位于N基因的右侧，包括全部主要的调控基因，复制基因，溶菌基因。
36.λ噬菌体载体的主要类型
取代型，插入型
37.λZAP的结构特点
λZAP是一种典型的插入型λ噬菌体载体，可将插入的DNA片段直接从λ载体转移到质粒载体。
其结构特点：
（1）其两侧是由两个单链DNA噬菌体f1的复制信号，即f1起始子和f1终止子包围着；
（2）含有一个可以在体内发生删除作用的pBluescript噬菌粒的DNA片段；
（3）在pBluescript噬菌粒两端有T3和T7噬菌体启动子的多克隆位点区，可制备RNA探针。
38.λZAP的优点
（1）具有多种核酸内切限制酶的单切点，可以克隆分子量达到10kb左右的外源DNA片段；
（2）在插入外源DNA序列保证正确的取向和正确的读码结构的情况下，能够与外源DNA表达的蛋白形成融合蛋白；
（3）LacZ基因的N端有6个单克隆位点，能够发生β-半乳糖苷酶的插入失活效应，故可以在X-gal显色反应平板上筛选重组体分子；
（4）利用T3或T7启动子能够转录任一条链的mRNA，可以方便制备外源DNA插入序列的转录本；
（5）通过内删除作用，插入的外源DNA可自动从λ噬菌体载体转移到细菌质粒载体便于构建限制图谱或测序，省略了亚克隆。
39.柯斯质粒及其特点
柯斯质粒：
是一类人工构建的含有λ噬菌体DNA的cos序列，和质粒复制子的特殊类型的质粒载体，其DNA可以在体外被包装到噬菌体的外壳内。
其基本特点：
（1）具有λ噬菌体的特性；
（2）具有质粒载体的特性；
（3）具有高容量的克隆能力；（4）具有与同源序列的质粒进行重组的能力。
40.M13克隆体系
M13克隆体系，包括M13噬菌体本身和寄主菌株两个组成部分。
二者单独都不能产生有功能的β–半乳糖苷酶，只有二者结合才能产生此酶，这种酶的活性可用X-gal显色反应法测定出来。
M13载体系列的优点：
（1）可以分离特定的DNA单链序列；
（2）可以用组织化学测试技术检测；
（3）在LacZ基因上具有多克隆位点，便于外源基因的插入、检测；
（4）可以定向克隆。
顺反子内互补作用：
是指编码同样的多肽链序列但又各具有一个突变的两个基因，联合产生出一种有功能活性的蛋白质多肽的生化过程。
41.噬菌粒载体：
是一类有质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列。
结构特点：
具有两个复制起点，质粒复制点和噬菌体复制点，有抗生素标记信号，与形态发生有关的DNA序列。
42.mRNA差别显示法分离目的基因的优缺点
这是建立在基因差别表达的理论基础上，通过比较不同的个体、或是同一个体的不同组织、甚至不同的发育阶段之间的mRNA种的差异，应用反转录PCR技术而发展出来的一种分离产物未知基因的方法。
简称DDRT–PCR。
主要包括：
反转录反应，PCR反应，凝胶电泳。
（考试不要求）基本原理：
几乎所有的真核基因mRNA分子的3´–末端都有一段poly（A）尾巴。
因此，在RNA聚合酶作用下，可按mRNA为模板，以oligo（dT）为引物合成出cDNA拷贝。
根据mRNA分子3´-端序列结构分析，在这段poly（A）序列起点碱基之前的两个碱基，除了倒二位的碱基为A的情况之外，只能有如下12种可能的排列组合；根据上述mRNA分子结构特征设计3´-端锚定引物，用以反转录mRNA合成第一链cDNA的下游引物，共12种。
其通式为：
5´-T11MN或5´-T12MN，其中T11或T12表示11个或12个连续的T核苷酸，M表示除T以外的任何一种核苷酸，即A、G、C，N表示任何一种核苷酸，即A、T、G、C。
由此可见MN（3×4）总共只有12种不同的排列组合方式。
由此可知，使用5´-T11MN引物或5´-T12MN引物，可以将整个mRNA群体在cDNA水平上，分成大致相等的位序列结构不同的12个分亚群体。
对每一类cDNA进行随机引物和反转录引物PCR扩增，通
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