实验室操作规程sop.docx

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实验室操作规程sop

分子病毒及生物制药实验室操作规程

二O一O年四月二十四日

前言

分子病毒及生物制药实验室研究方向为动物源性病原跨种间传播机制和分子进化、病原微生物与宿主之间相互作用、抗病毒药物（细胞因子）的研究与开发及乙肝病毒侵染机理、致病机制及乙肝治疗的研究。

课题组负责人：

刘文军，博士，中国科学院微生物研究所在职研究员，博士生导师。

中国科学院病原微生物与免疫学重点实验室副主任，分子病毒中心主任，中关村科技园区分子病毒及生物制药开放实验室主任。

主要从事流感病毒跨种间传播的分子机制、病毒的分子进化及病毒结构蛋白与宿主内蛋白相互作用的生物学意义研究，研究开发增强机体免疫和抗病毒的蛋白质药物。

分子病毒及生物制药实验室研究内容为流感等重大传染病病原微生物的分子流行病学、分子进化规律的研究；重大传染病病原微生物与宿主相互作用及跨种间传播机制的研究；肝炎病毒侵染机理、致病机制、免疫应答及免疫防治的研究；新型抗感染治疗药物的研发；新发、突发人畜共患病原微生物（病毒与细菌）基因组、转录组、蛋白组分析；重要免疫分子与病原微生物蛋白结构与功能研究等。

实验室操作规程（分子病毒及生物制药实验室操作规程）的制定是为了更好的规范实验室基本操作，使实验室的操作规程化、标准化，为实验室操作及标准化认证提供理论基础和参考依据。

实验室操作规程主要编者：

刘文军研究员实验室操作规程审核人员：

朱以萍、孙蕾、杨利敏、刘晓玲、贾晓娟实验室操作规程参编人员：

王增福、周远成、于茂荣、张珂、许崇凤、孟珊珊、曹帅、王珊

珊、张定勇、赵振东、陈才伟、高晟妍、瞿洪仁、李铮、陆鹭、高蕾实验室操作规程编辑及排版：

李晶虽然我们在修订过程中力求全面、完整，但由于时间较紧、工作量大，加上笔者的水平和能

力有限，归纳成册后疏漏及错误之处肯定不少，殷切希望实验操作人员提出批评指正。

编者

2010-4-24

血凝抑制试验的标准操作规程（编号：

001）

1.目的

该SOP是利用具有血凝性的病毒凝集动物红细胞的能力可以被相对应的抗体抑制使其不能再凝集红细胞的现象来测定与该病毒相对应的抗体的效价。

2.适用范围

该SOP适用于具有血凝性的病毒类疫苗免疫动物后血清抗体的检测并依此进行疫苗的效力检验，可用于猪流感疫苗、禽流感疫苗、猪细小病毒疫苗、鸡减蛋综合症灭活疫苗等的效力检验；免疫后及时监测，辅助诊断病毒性疾病。

3.主要仪器

1000～5000rpm台式离心机、冰箱、微量振荡器、96孔V型血凝板、八道加样器、200μL单通道加样器、积液槽

4.试剂

4.1生理盐水、柠檬酸三钠、重铬酸钾、硫酸、蒸馏水

4.2抗凝剂的制备

用天平称量3.8g柠檬酸三钠，溶入100mL生理盐水中，待溶解完全后即可使用。

4.3红细胞悬液的制备

4.3.1红细胞的采集：

选1～2只健康鸡，将血液采集到等量抗凝液中混匀，置4℃冰箱保存。

4.3.2红细胞悬液的制备：

以800～1000rpm离心5min，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加生理盐水，慢慢混合均匀，再在离心机中800rpm离心5min，弃去上清液，再加生理盐水混匀，如此反复离心4～5次，最后一次离心后的红细胞，弃去上清液。

放入4℃冰箱中可保存2～3d。

使用时用1mL吸管吸取0.1mL红细胞，然后加入9.9mL的生理盐水，此即1%红细胞悬液。

4.4清洁液的制备

4.4.11%的稀硫酸溶液：

水10kg，硫酸100mL，将硫酸慢慢倒入水中，不断搅拌。

4.4.296孔V型板和微量滴头清洁液的配制：

重铬酸钾79g，水1000mL，硫酸100mL，将重铬酸

钾磨碎，溶解于水中，然后慢慢加入硫酸100mL，不断搅拌。

5.操作步骤

5.1血凝试验（HA）步骤

5.1.1用微量移液器向反应板的每孔加生理盐水25μL。

5.1.2用微量移液器吸取待测抗原25μL于第1孔中并挤压6次混合，后吸出25μL至第2孔，依次倍比稀释到第11孔，弃去25μL。

5.1.3微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入各孔，每孔25μL。

5.1.4置于微量振荡器上振荡1min，室温静置30min后观察结果。

5.1.5结果判定：

将反应板倾斜成45°，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，表明红细胞被病毒所凝集。

能使鸡红细胞完全凝集的抗原的最高稀释倍数，称为该抗原滴度红细胞凝集效价。

即沉淀的前一孔即为该抗原的效价。

5.2抗原校正

5.2.1根据抗原效价结果配制相应比例的抗原稀释液：

即4单位抗原。

5.2.2首先用微量移液器向反应板的第2孔至第6孔加生理盐水25μL，第1孔不加。

5.2.3用微量移液器吸取4单位抗原25μL分别加入第1孔、第2孔中，从第2孔开始挤压6次混合，后吸出25μL至第3孔，依次倍比稀释到第5孔，弃去25μL。

5.2.4用微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入1～6孔，每孔25μL。

5.2.5置微量振荡器上振荡1min，室温静置30min后观察结果。

5.2.6结果观察：

第1、2、3孔为完全凝集，第4孔红细胞为50%沉淀，第5孔为对照完全沉淀，

如果出现以上结果，表明所配4单位抗原准确，校正成立。

5.3血凝抑制（HI）试验步骤

5.3.1用微量移液器先加25μL生理盐水于各孔中。

5.3.2用微量移液器吸取待检血清25μL置于第1孔中，然后倍比稀释至第11孔，弃去25μL。

最

后1孔不稀释，为红细胞对照。

5.3.3用微量移液器吸取配制好的抗原，每孔25μL。

5.3.4置于微量振荡器上振荡1min，混合均匀，室温静置20min。

5.3.5用微量移液器吸取1%红细胞悬液于每孔各加25μL。

5.3.6置于微量振荡器上振荡1min，混合均匀，室温静置40min后观察结果。

5.3.7结果观察：

以完全抑制红细胞凝集的血清最大稀释度为该血清的血凝抑制试验滴度，以2的指数表示。

5.4结果判定

“－”表示不凝集，红细胞沉积于管底，呈边缘整齐的圆盘状。

“+”表示微量凝集。

红细胞沉积于管底，呈边缘不清晰的圆盘状。

“++”表示凝集，红细胞沉积于管底呈环状，四周有凝集的小块。

“+++”大部凝集，红细胞呈颗粒状凝集，边缘不整齐，有下垂趋势。

“++++”完全凝集，红细胞均匀铺于管底。

以能完全阻止血球凝集（“－”）的血清最高稀释度为血凝抑制效价。

5.5试验用具处理

5.5.196孔V型反应板的清洗：

新反应板可直接放入清洁液中浸泡24h，用过的反应板先用流水冲净孔中的反应物，然后泡在清洁液中，24h后捞出，甩掉清洁液，放入流水中冲洗干净后，在蒸馏水中冲洗一遍，甩干，摆放在恒温箱中，烤干备用。

5.5.2微量滴头的清洗：

新滴头直接放入清洗液中浸泡，用过的用清水冲洗掉滴头中的血清后浸泡在清洁液中，最少浸泡24h，捞出后用流动水冲洗掉滴头内外的清洁液，然后在蒸馏水中冲洗一遍，甩干，放入恒温箱中烤干，备用。

5.5.3吸管及积液槽的清洗：

将吸管及积液槽直接浸泡在清洁液中，24h后捞出，用流动水冲洗干净后在蒸馏水中再冲洗一遍，甩干，吸管放入高温干燥箱中160℃干燥1～2h后备用，玻璃制品可高温烤干。

积液槽放入恒温箱中烘干。

6.注意事项

6.1正确选用96孔微量板，根据所用红血球不同来决定，鸡血球选用V型板，豚鼠、人血球用U

型板。

6.2红血球的浓度和4个血凝单位的正确调制。

6.3标准参比血清应包括疫苗株和代表株的。

6.4孵育时间不宜过长，有些病毒的血凝现象因病毒游离而很快消失。

7.问题向导

7.1由于流感病毒不同亚型间有交叉反应，判定结果时应注意。

如试验用4种标准血清，待检病毒

只能被甲3抗血清抑制，抗体效价为80，其他血清皆不抑制，那么，该鉴定病毒为甲3型流感病毒，HI效价为80。

如果7待检病毒被甲3抗血清抑制，效价40，甲1抗血清抑制，效价320，其高出甲3抗血清效价4倍以上，故该待检病毒判定为甲1型流感病毒。

标准参照血清对分离物的抑制效价≥20才可判断为阳性。

若标准参照血清对分离物的抑制效价均<20，速将分离物送国家流感中心进一步鉴定。

7.2鉴定未知病毒时对照应有红细胞、阴性血清对照、标准血清对照，HI试验不适用于流感的早期诊断，但在不能分离病毒或病毒分离阴性时，检测病人的急性期和恢复期双份血清有助于近期感染的诊断，即如恢复期血清抗体效价（滴度）高于急性期血清抗体效价≥4倍确诊可成立。

起草人：

陆鹭起草时间：

2010-3-18

酶联免疫吸附（ELISA）试验的标准操作规程（编号：

002）

1.目的

该SOP是利用抗原抗体特异性结合的原理，将待检抗体/抗原和酶标抗原/抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原/抗体起反应。

加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，利用颜色反应放大反应效果从而定性或定量分析，从而使测定方法达到很高的敏感度。

2.适用范围

该SOP适用于测定抗原抗体的匹配程度，血清中的抗体滴度，利用已知抗体判定未知蛋白的生物学特性等。

3.主要仪器

酶标仪、洗板机、酶联条、微量移液器

4.试剂

0.05MpH9.6碳酸盐缓冲液、0.15MpH7.4PBST、稀释液、封闭液、0.2MNa2HPO4、0.1M

柠檬酸、0.1MEDTA、底物反应液A、底物反应液B、终止液（2MH2SO4）具体的制备步骤见附件。

5.操作步骤

5.1酶联免疫吸附试验（ELISA）常规操作

5.1.1将重组蛋白用包被缓冲液按1:

100、1:

200、1:

400、1:

800、1:

1600稀释后，每孔加100μL，设两排平行孔和阴性对照孔，4℃过夜包被（12-18h）或37℃包被5h。

5.1.2次日用封闭液37℃封闭1h，PBST洗涤3次，每次2min。

5.1.3加入100μL用稀释液1:

1000稀释的一抗，37℃温育30min，再用PBST洗涤后，每次2min。

5.1.4加入100μL1:

1000稀释的HRP标记的二抗兔抗马IgG，37℃温育15min，洗涤后分别加入ELISA显色A液和B液，各50μL，5min后再加入50μL终止液，最后测定其A450nm，以测定孔与阴性对照孔A450nm＞2.1判为阳性。

5.2其他模式酶联免疫吸附试验（ELISA）步骤

5.2.1双抗体夹心法

5.2.1.1将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体及杂质。

5.2.1.2加入待检样品，使之与固相抗体充分接触，使得样品中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物，洗涤除去其他未结合的物质。

5.2.1.3加入酶标抗体，使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合，彻底洗涤未结合的酶标抗体。

此时固相载体上带有的酶量与样品的量正相关。

5.2.1.4加入底物，夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物，根据颜色反应的程度进行抗原的定性或定量。

根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。

5.2.2双位点一步法

在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。

当样品中待测抗原浓度过高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。

5.2.3间接法测抗体

5.2.3.1将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原，洗涤除去未结合的抗原及杂质。

5.2.3.2加入稀释的待检血清，其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。

洗涤后固相载体上只留下特异性抗体。

5.2.3.3加入酶标抗抗体，与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。

洗涤后固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。

5.2.3.4加入底物显色，颜色深度代表标本中待检抗体的量。

5.2.4竞争法

5.2.4.1将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体，洗涤。

5.2.4.2待测管中加入待检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。

如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。

如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样

的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。

参考管中只加酶标抗原，保温后酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量，洗涤。

5.2.4.3加入底物显色，参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。

参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。

待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。

5.2.5捕获法测IgM抗体

5.2.5.1将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM，洗涤。

5.2.5.2加入稀释的血清标本，保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获，洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。

5.2.5.3加入特异性抗原试剂，它只与固相上的特异性IgM结合，洗涤。

5.2.5.4加入针对特异性的酶标抗体，使之与结合在固相上的抗原反应结合，洗涤。

5.2.5.5加入底物显色，如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。

6.注意事项

6.1封闭液每孔不能少于300μL，以充分封闭非特异性结合位点。

6.21×PBST洗涤次数不得少于3次，每次洗涤结束后应在吸水纸上拍干。

7.问题向导

7.1建立新的ELISA方法时，需重新用矩阵法确定最佳抗原包被浓度、最适封闭液、最佳一抗浓度，最佳二抗浓度等条件。

7.2应用亲和素－生物素系统在ELISA中的应用时有多种形式。

可用于间接包被，亦可用于终反应放大。

可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。

这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点暴露。

另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。

附：

1.包被缓冲液

Na2CO31.59g

NaHCO32.93g

加蒸馏水至1000mL

溶解后每瓶50mL分装，高压灭菌备用。

2.洗涤缓冲液

KH2PO40.2g

Na2HPO4·12H2O2.9g

NaCl8.0g

KCl0.2g

加蒸馏水至1000ml

加热溶解后50mL分装，高压灭菌备用。

用前加Tween-20至0.05％。

3.稀释液

NaCl2.1g

PEG60004g

加洗涤缓冲液至100ml4.封闭液

BSA3g

加洗涤缓冲液至100mL

溶解后50mL分装，－20℃保存备用。

5.0.2MNa2HPO4

Na2HPO4·12H2O7.16g

加蒸馏水至100mL

溶解后50mL分装，高压灭菌备用。

6.0.1M柠檬酸

柠檬酸·H2O2.10g

加蒸馏水至100mL

溶解后50mL分装，高压灭菌备用。

7.0.1MEDTA

EDTA3.72g

加蒸馏水至100mL

用NaOH调pH值8.0，加热溶解后每瓶50mL分装，高压灭菌备用。

8.底物反应液A

0.2MNa2HPO451.4mL

0.1M柠檬酸48.6mL

30%H2O267μL

用HCl调pH值5.0～5.49.底物反应液B

TMB50mg

加无水乙醇（或DMSO）5mL0.1M柠檬酸5mL

0.1MEDTA0.5mL

加蒸馏水至100mL10.终止液（2MH2SO4）

蒸馏水178.3mL，逐滴加入98％的浓硫酸21.7mL

起草人：

孟珊珊起草时间：

2010-3-18

聚合酶链式反应（PCR）的标准操作规程（编号：

003）

1.目的及适用范围

以DNA的半保留复制机理为基础，利用温度控制DNA的变性与复性，通过添加引物，DNA聚合酶，dNTP等完成特定基因的体外复制，已被广泛用于特定基因的体外扩增，是分子生物学研究的最重要技术之一。

2.主要仪器

PCR仪，掌型离心机

3.试剂

DNA聚合酶、dNTP混合物、10×聚合酶Buffer、去离子水

4.操作步骤

4.1在无菌的0.2mL离心管中按下列顺序加入试剂：

反应物

用量

10×聚合酶Buffer

5μL

dNTP混合物

各200nM

上游引物

10-100pM

下游引物

10-100pM

模板DNA

0.1-2μg

DNA聚合酶

2.5U

总体积（μL）

加水至50μL

4.2将混合物振荡混匀，于掌型离心机上轻微离心。

4.3将反应管置于基因扩增仪模块中，按以下顺序开始扩增：

4.3.1热变性94℃5min

4.3.2变性94℃1min

4.3.3退火温度及时间根据具体实验设定

4.3.4延伸温度及时间根据具体实验设定

4.3.5步骤4.3.2至步骤4.3.4循环进行，共29个循环

4.3.6延伸

72℃

10min

4.3.7冷却

4℃

5.问题向导

5.1PCR产物的电泳检测时间

一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失而出现假阴性，不出现扩增条带。

5.2PCR反应的关键环节有模板核酸的制备、引物的质量与特异性、酶的质量及PCR循环条件。

寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板：

模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，模板DNA中含有杂质蛋白或聚合酶抑制物如酚，乙醇等都会影响PCR反应效率。

引物：

引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。

引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是影响PCR效率的主要因素。

引物应高浓度小量分装保存。

反应体系中每条引物的浓度控制在10～100pmol范围内，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

DNA聚合酶：

DNA聚合酶浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

5.3PCR循环条件：

PCR反应条件为温度、时间和循环次数。

温度与时间的设置：

基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。

在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。

5.3.1变性温度与时间：

变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。

一般情况下，

93℃～94℃足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。

此步骤若不能使靶基因模板完全变性，就会导致PCR失败。

5.3.2退火温度与时间：

退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。

变性后温度快速冷却至40℃～

60℃，可使引物和模板发生结合。

由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。

退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，

还有靶基序列的长度。

对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。

引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：

Tm值（解链温度）=4（G+C）＋2（A+T）、复性温度=Tm值-（5～10℃）

在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR

反应的特异性。

复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。

5.3.3延伸温度与时间：

TaqDNA聚合酶的生物学活性：

70～80℃150核苷酸/S/酶分子、70℃60核苷酸/S/酶分子、55℃24核苷酸/S/酶分子、高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。

PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。

PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。

3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。

延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。

对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

5.4其它影响因素：

5.4.1反应体积的改变：

通常进行PCR扩增采用的体积为20μL、30μL、50μL。

或100μL，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20μL后，再做大体积时，一定要摸索条件，否则容易失败。

5.4.2物理原因：

变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率；退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。

有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。

5.4.3靶序列变异：

如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

5.5假阳性的原因：

5.5.1引物设计不合适：

选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。

靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。

需重新设计引物。

5.5.2靶序列或扩增产物的交叉污染：

这种污染有两种原因：

一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。

这种假阳性可用以下方法解决：

操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。

除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。

所用离心管及样进

枪头等均应一次性使用。

必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。

二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。

可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

5.6出现非特异性扩增带：

PCR扩增后