细菌内毒素定量检测综述doc.docx

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细菌内毒素定量检测综述doc

目录

引言3

一细菌内毒素概况3

1细菌内毒素简介3

1.1细菌内毒素出现时间3

1.2G-菌细胞壁结构构造4

1.3细菌内毒素的化学成份4

2细菌毒素分类5

3细菌内毒素生物活性6

3.1细菌内毒素的生物活性6

3.2细菌内毒素不同水平上的生物活性6

3.3内毒素的生物活性与疾病的相关性6

4细菌内毒素的量值（单位）7

5细菌内毒素的检测7

6细菌内毒素工作标准品振荡的理论依据8

二鲎与鲎试剂概况8

1鲎的简介8

1.1鲎的种属8

1.3鲎的生活习性9

1.5鲎的特殊作用9

1.6鲎血细胞与凝固原9

2鲎试剂简介9

3鲎试剂的分类10

三体液细菌内毒素的检测研究10

1人体体液简介11

1.1人体体液的分类11

1.2人体体液中的干扰物质11

1.3除去体液中干扰物质的方法11

1.4细菌内毒素的人体正常值11

2体液细菌内毒素简介11

2.1体液中细菌内毒素来源11

2.2细菌内毒素在机体内反应及临床表现12

2.3细菌内毒素水平检测在临床上应用12

2.4体液内毒素水平测定的临床意义12

2.5细菌内毒素的致病机理研究12

2.6抗生素与细菌内毒素的释放13

3内毒素与疾病13

3.1内毒素与胆道感染13

3.2内毒素与肺炎14

3.3内毒素与革兰氏阴性球菌脑膜炎14

3.4内毒素与急性胰腺炎15

3.5内毒素与口腔疾病15

3.6内毒素与慢性肾衰15

3.7内毒素与慢性阻塞性肺疾病16

3.8内毒素与中耳炎16

3.9内毒素与皮肤软组织感染17

3.10内毒素与肾孟肾炎（尿路感染）17

四内毒素血症的临床检测研究17

1内毒素血症简介17

1.1内毒素血症发生的原因17

1.2内毒素血症的临床症状18

1.3内毒素血症的后果18

1.4各类疾病内毒素血症的发生率18

1.5内毒素血症的治疗18

2内毒素血症与疾病18

2.1肠源性内毒素血症18

2.2烧伤内毒素血症19

2.3内毒素血症——发烧病人败血症的早期预测19

2.4内毒素血症－免疫低下儿童发烧的一个重要原因19

2.5细菌性痢疾与内毒素血症20

2.6小儿急性器官功能衰竭与内毒素血症20

2.7重型肝炎内毒素血症21

五细菌内毒素定量检测系统22

1微生物检测仪Elx808（配套IU）22

1.1产品特点22

1.2性能指标22

1.3技术参数23

2TALgent专业分析软件23

2.1产品特点23

3辅助器具24

3.1旋涡混匀器24

3.2干热恒温仪24

3.3可调移液器24

4细菌内毒素定量检测鲎试剂25

4.1动态浊度法内毒素检测鲎试剂盒25

4.2四肽显色基质鲎试剂盒25

5辅剂与耗材25

引言

近几十年，人们对疾病病因、病理的认识不断深化，发现了许多疾病与内毒素的关系。

由于很小剂量的内毒素即能引起极广泛的生物作用及病理作用，因而加强内毒素的检测研究便成为临床、公卫及药检等领域的重要课题。

　　细菌内毒素检查法又称鲎试验法，它是1964年由美国学者Levih和Bang发现，并在1968年正式建立的一种定性或定量检测微量细菌内毒素的分析方法。

该法具有灵敏度高、特异性强和操作简便快捷的特点，不仅在药学，而且在微生物学及临床检验等领域应用较为广泛。

1973年，美国食品药品管理局承认鲎制剂是一种生物制剂。

1980年，美国药典首先收载此法，其后英、德、意、日等国相继收载了这一检查方法。

1983年我国卫生部授权中国药品生物制品检定所组织全国范围的大输液及放射性药品鲎试验检查方法。

1995年，中国药典收载了修订后的细菌内毒素检查法，并取消了原热原检查。

2003年，对细菌内毒素定量检测开始在我国临床全面开展应用。

　　鲎试验法可广泛用于革兰氏阴性菌感染的快速诊断，可对患者的血液、尿液及脑脊液进行直接检查，有助临床医生及时发现内毒素疾病，以迅速采取果断的治疗。

在公共卫生方面，鲎试验法可对水源、食物、饮料等进行内毒素测定，以便将其控制在规定水平以下，预防疾病，保障人民健康。

用此法检测药品和生物制品等开展较早，如美国收载检测品种已上升为600多个。

而且，国外用此法检测医疗用具中内毒素污染含量的研究进行的比较深入。

　　据有关资料，正常人血中内毒素浓度为：

＜0.1EU／ml，超过此值即可诊断为内毒素血症。

许多研究表明，内毒素与多种疾病密切相关，内毒素血症多随病情恶化而加重，随病情缓解而减轻。

因此，内毒素可以作为一个衡量病情和判断预后的参考指标。

也可用于临床治疗及判定疗效或筛选恰当药物的指标之一。

一细菌内毒素概况

1细菌内毒素简介

细菌内毒素，英文称作Endotoxin，是革兰氏阴性菌（G-菌）细胞壁上的一种脂多糖（LipoplySaccharide）和微量蛋白（Protein）的复合物。

内毒素为外源性致热原，它可激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热。

细菌内毒素的特殊性不是细菌或细菌的代谢产物，而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质。

1.1细菌内毒素出现时间

　　细菌内毒素这个概念在1890年的时候就已被提了出来，它是在研究发热物质过程所引起的，1933年Boivin最先由小鼠伤寒杆菌提取出来，进行化学免疫学方面的研究，到1940年时候，Morgan使用志贺氏痢疾菌阐明了细菌内毒素是由多糖脂质及蛋白质三部分所组成的复合体，到了1950年以后，随着生物学，物理化学，免疫学以及遗传学等的进步发展，细菌内毒素的研究工作，尤其是其化学结构组成及各种生物活性间的关系也更加明确起来。

细菌英文叫Bacteria：

为原核生物中的一类单细胞微生物由二分裂法繁殖。

若按革兰氏染色法可将细菌分为G+菌和G-菌两大类。

这两类细菌细胞壁的结构和化学组成存在很大差异。

唯有肽聚糖为其共同成分，但其含量的多少和肽链的性质有所不同，见下表：

表1G+菌和G-菌细胞壁的结构和化学组成

细胞壁结构

革兰氏阳性菌

革兰氏阴性菌

厚度

厚，15—50

薄，10—15

肽聚糖含量

多，占胞壁干重50—80%

少，占胞壁干重10%左右

脂类含量

少，约1—4%

多，约11—22%

磷壁酸

有

无

外膜

无

有

脂蛋白

无

有

脂多糖

无

有

1.2G-菌细胞壁结构构造

G-菌细胞壁较薄，厚约10-15nm，结构也较复杂。

肽聚糖含量低，仅占细胞干生10％左右，层薄又较疏松，因肽聚糖之间仅四肽侧链直接联结，缺乏五肽桥；肽聚糖居于细胞最内层，外面由内向外还有脂蛋白，外膜和脂多糖的三层聚合物。

蛋白质

图1革兰氏阴性菌细胞壁结构图

（1）脂蛋白（lipoprotein）由类脂和蛋白质构成，联结在外膜与肽聚糖层之间，类脂一端经非共价键联结到外膜的磷脂上，另一端由共价键联结到肽聚糖肽链中的二氧基庚二酸残基上，使外膜和肽聚糖层构成一个整体。

外膜

（2）外膜（outermembrane）是革兰氏阴性菌细胞壁的重要结构，位于肽聚糖的外侧，其结构类似细胞膜，为液态的磷脂双层，其中镶嵌一些特异蛋白质，穿透外膜的内外双层，呈液态镶嵌体。

外膜中间有微小孔道，容许水溶性的小分子通过，以进行细胞内外的物质运输和交换。

除此之外，外膜还能防止胰蛋白酶和溶菌酶等进入，起到保护性屏障作用。

脂多糖

（3）脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）由多糖O抗原、核心多糖和类脂A（lipidA）组成（图1-8），位于最外层。

多糖O抗原向外，由若干个低聚糖的重复单位组成的多糖链，即革兰氏阴性菌的菌体抗原（O抗原），有特异性。

核心多糖由庚糖、半乳糖、2-酮基-3-脱氧辛酸（2-keto-3-deoxyoctonicacid,KDO）等组成，所有革兰氏阴性细菌都有此结构。

类脂A是以脂化的葡萄胺二糖为单位，通过焦磷酸酯键组成的一种独特的糖脂化合物，具有致热作用，是革兰氏阴性细菌内毒素的毒性成分。

细菌内毒素即：

许多病原性细菌所产生的毒素。

1.3细菌内毒素的化学成份

细菌内毒素的化学成分广泛分布于革兰氏阴性菌（如大肠杆菌、布氏杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌、沙门氏菌等）及其它微生物（如衣原体、立克次氏体、螺旋体等）的细胞壁层的脂多糖，其化学成份主要是由O-特异性链、核心多糖、类脂A三部分组成。

1.3.1O-特异性链

位于脂多糖分子最外层的多糖链，是由3-5个单糖（一般不多于25个）连成为一个多糖链。

其单糖包括戊糖、氨基戊糖、已糖、氨基已糖、脱氧已糖等，单糖的种类、位置和排列顺序和空间构型，因菌种不同而异。

因此，它决定菌体热原的特异性。

1.3.2核心多糖

核心多糖的变异性较小，位于类脂A和0—特异性链（内层）之间，在结构上分为内核心和外核心。

外核心含有数种己糖，包括葡萄糖、半乳糖、乙酰氨基葡萄糖等组成。

内核心含有庚糖及特殊的酮糖（3-脱氧-D-甘露糖-辛酮糖KDO）。

这部分结构对不同菌株的LPS基本相似，而且KDO是以不耐酸的酮糖链与类脂A的氨基葡萄糖连接，是构成内毒素脂多糖的核心部分。

1.3.3类脂A

位于LPS分子结构的外层，是由氨基葡萄糖、磷酸和脂肪酸（10—18C）组成，故称之为糖磷脂，也是细菌外膜的一种，形成单体聚合物。

具有疏水性（强）和亲水性（弱）的双相性。

但是，类脂A可从O-特异链及核心多糖分离出来，游离的类脂A可自身凝聚成大分子的复合体而难溶于水，并具有生物活性。

所以，类脂A（Lipida）是内毒素多种生物活性或毒性反应的主要基团。

该基团没有种属特异性，所以各属细菌的类脂A结构相似，其毒性反应相似。

如发热、血液流动力学改变、弥漫性血管内凝血，并导致休克等。

由于类脂A有4条主链和2条支链的脂肪酸与内酰胺连接组成，所以提纯的内毒素LPS是极为不稳定的。

这就要求内毒素应在低温条件下保存，在工作中内毒素稀释应尽可能地缩短时间，并要现配现用。

2细菌毒素分类

一般细菌毒素可分为两类，一类为外毒素（Exotoxin）；它是一种毒性蛋白质，是细菌在生长过程中分泌到菌体外的毒性物质。

产生外毒素的细菌主要是革兰氏阳性菌。

如白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌以及少数革兰氏阴性菌。

另一类为内毒素（Endotoxin）。

是革兰氏阴性菌的细胞壁的产物。

细菌在生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒性，内毒素的主要化学成分是脂多糖中的类脂A成分。

表2细菌外毒素与内毒素性质的比较

外毒素（Exotoxin）

内毒素（Endotoxin）

发热性

几乎无发热性

很强的发热性

来源

细菌的代谢产物

细菌外壁层上的特有结构细胞破裂后游离出来

毒性作用

毒性作用强

毒性作用比较弱

抗原性

很强的免疫原性，制成抗毒素能中和抗原毒素

抗原性弱

稳定性

单纯蛋白质，易被分解破坏

核酸多糖的高分子聚合物，不易被分解破坏

热稳定性及透析性

对热不稳定，无透析性

耐热性，无透析性

福尔马林影响

福尔马林可使其转化为类毒素

福尔马林不能使毒性消失

对肿瘤细胞的影响

对肿瘤细胞几乎无影响

破坏肿瘤细胞

种类

白喉毒素，肉毒毒素，破伤风毒素厌氧菌毒素，溶血性链球菌毒素等

大肠杆菌，霍乱绿脓菌，沙门氏菌，赤痢菌等

（1）外毒素（exotoxin）有些细菌在其生命活动过程中产生毒素能释放到周围环境中，称为外毒素。

产生外毒素的细菌主要