已知可沥滤物测定方法验证及确认技术审查指导原则.docx
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已知可沥滤物测定方法验证及确认技术审查指导原则
已知可沥滤物测定方法验证及确认
技术审查指导原则
一、前言
医疗器械的可沥滤物（Leachables）是指在临床使用过程中，医疗器械与水或使用中有关的液体、气体作用等介质作用时，从该医疗器械中释放出的化学物质的统称。
可沥滤物一般包括灭菌残留剂、工艺残留物、降解产物以及材料中的单体及添加剂（包括稳定剂、抗氧化剂、增塑剂、着色剂等）。
在医疗器械产品与人体接触并发挥作用的过程中，可沥滤物也在或短期或长期地对人体产生安全性方面的危害。
可沥滤物安全性评价首要任务是建立拟研究物质的允许限量（Allowablelimit），其次，应在临床模拟最坏使用环境下测定其释放量（Release），并根据其释放量是否超过其在该产品该预期用途下的允许限量，形成完整的可沥滤物安全性研究报告，其中，可沥滤物的释放量测定方法的设计和方法学验证是评价可沥滤物安全性研究报告质量和可靠性的重要依据。
本指导原则是对医疗器械已知可沥滤物测定方法研究的一般要求，申请者应依据具体产品的特性和拟研究可沥滤物性质对注册申报资料的内容进行充实和细化。
申请者还应依据具体可沥滤物的特性和分析方法确定释放量测定方法的设计和方法学验证参数的具体内容是否适用，若不适用，需具体阐述其理由及相应的科学依据。
本指导原则旨在帮助和指导申请者对医疗器械产品注册申报资料进行准备，以满足技术审评的基本要求。
同时有助于审评机构对该类产品进行科学规范的审评，提高审评工作的质量和效率。
本指导原则是对申请者和审查人员的指导性文件,但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其它方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料。
应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。
本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时的进行调整。
二、适用范围
本指导原则适用于医疗器械注册申报时对已知可沥滤物释放量的研究和产品技术审评的参考。
本指导原则仅适用于已知可沥滤物研究，已知可沥滤物的信息可以通过以下途径获得：
1）从原料供应商处获得材料的组成信息并预测潜在的可沥滤物；2）通过生产工艺文件获得额外的加工助剂信息，例如脱模剂、粘合剂；3）通过已有医疗器械用材料的标准、文献等资料查阅获得潜在的可沥滤物信息；4）通过浸提试验（Extractionstudy）获得信息，预测潜在的可沥滤物。
本指导原则不适用于对未知可沥滤物的测定研究，但部分内容可参考使用。
三、注册申报资料要求
1.已知可沥滤物信息
企业应提供已知可沥滤物的基本信息，包括：
化学名称、化学式及结构式、CAS号（如有）、来源、最终医疗器械中的使用及加工方式、用途（适用时）、添加量（如适用），如可能，还应提供可沥滤物的理化性能，如酸碱性、密度、熔点、沸点、溶解特性及相应溶解度、极性特性等。
2.已知可沥滤物安全性研究的基本步骤
应首先确认该已知可沥滤物是否为原材料或最终医疗器械生产过程中添加的添加剂剂，如抗氧化剂、稳定剂等成分。
如果是，应进一步确认该添加剂在原材料或最终医疗器械中的添加总量是否超过该已知可沥滤物的允许限量，如果未超过，则一般无需对该可沥滤物本身的安全性做进一步的研究，如果超过了允许限量，则应模拟临床实际使用最恶劣环境，通过浸提试验研究，获得其最大溶出量（可参考附录1流程图），并根据其允许限量形成完整的安全性评价报告。
值得注意的是，可沥滤物来源可能不仅是器械原材料及工艺信息中提供的添加剂、单体、加工助剂本身，某些情况下，器械及其原材料在生产、制造、贮存及使用等过程中产生的上述化学物质的水解、降解或反应产物等宜同时纳入可沥滤物风险评估的考虑。
3.浸提液制备的论述
3.1浸提方式选择
浸提是通过最大限度的实验室模拟获得医疗器械临床实际使用环境获下可沥滤物释放的进入人体的物质的量，然而大部分医疗器械很难模拟临床使用条件，特别是长期植入类器械，因此某些情况下可通过可浸提物（extractables）研究替代可沥滤物研究，即采用浸提方式制备浸提液进行已知可沥滤物测定，但是务必对浸提方式进行论述，证明浸提条件是严于器械临床使用条件。
常用的浸提方式包括模拟浸提、加严浸提、加速浸提和极限浸提（具体可参考GB/T16886.12部分定义），一般来说模拟浸提最接近于实际，极限浸提（此处及此后提到的极限浸提均指的是所用溶剂符合下面论述前提下的溶剂）获得结果可能大于或等于患者实际可能接受到的剂量或模拟浸提获得的结果。
但有些特殊情况下，因实际使用条件很难在实验室进行模拟，则优先推荐使用极限浸提法，比如产品属于持久接触（接触时间>30天）等。
需要说明的是，某些器械采用模拟浸提法可能会导致相对较大的浸提体积，这种情况下，则可能需要极大地提高对残留物测定的灵敏度以满足安全性评价的要求。
极限浸提法排除了时间对剂量测定的影响，不能保证所测得的可沥滤物在与器械接触的第一天或第一个月完全放给患者，但如果通过极限浸提法测定出产品上存在的全部残留量符合安全性评价的要求，则一般不需要再进行模拟法研究。
除采用前述浸提的方式外，有时还可以采用其他方式获得拟研究物质。
比如分析某些医疗器械产品上易挥发性有机物时可以采用顶空进样分析，这种分析方法一般更加适用于挥发性可沥滤物，并同样能够达到预期的研究目的。
对于浸提方法，可采用加严方式进行浸提，如：
循环、剪碎浸泡、超声浸提等，如果通过加严方式溶出量超过毒理学评估阈值时，可考虑临床实际使用情况。
制备浸提液需要考虑典型样品的选择、浸提介质、浸提比例、浸提时间、浸提温度、浸提方式等。
但所选浸提条件均不应引起器械材料和目标可沥滤物发生化学变化。
3.2样品选择
科学的采样是获得代表性样品的关键，因产品的加工制造过程会对可沥滤物残留量产生影响，所以试验样品优先选择最终产品或取自最终产品中有代表性的样品或经论述的与最终产品相同的工艺过程制得的材料制备的适合浸提液。
但某些情况下，因产品大型和/或复杂的器械使得无法在终产品上进行浸提时，实验室应建立完整的采样操作规程，特别注意样品的代表性。
一般可选取有代表性的部分进行浸提，然后推导出整个器械的结果，代表性的部分可采用如下方法：
如果含有几种不同的材料，选取的样品中每一组分占样品的比例宜与该组分占被测器械的比例一致，或选择经评价证明是器械上残留含量最高的一个组成部分进行试验，有时还可以通过相同原材料在相同工艺条件下加工成的最终品检测等方式进行，采样方法应经过确认并保留相关理由、记录，必要时，提供相关支持性资料。
值得注意的是，某些产品需要在使用前现场制备，比如某些需要通过光固化、化学固化的口腔修复类产品等，该类产品的样品应严格按照产品使用说明书中规定的时间、浓度、剂量等要求制备后获得试验样本。
3.3浸提介质
浸提介质的选择需要考虑以下因素：
（1）临床接触介质性质（酸性、碱性、极性、非极性等）。
例如对于一次性使用输注器具拟输注的药物是最佳的提取溶剂，但是输注器具和拟输注的药品种类繁多，且不同输注器械在临床的应用情况有很大的差异。
因此对于无法按照临床使用情况制备检验液的样品，或者药品中某些成分对已知可沥滤物分析存在干扰时，可以使用替代溶剂开展研究。
如对于聚氯乙烯输注器具中增塑剂DEHP的研究，可通过充分的论证或实验研究分析后一般情况下可采用乙醇/水（ρ=0.9373g/ml~0.9378g/ml）进行浸提研究。
（2）已知物的溶解特性，结合临床接触介质性质，初步确定拟采用的替代溶剂。
（3）根据已知物的毒理学推导TE值及浸提液体积，计算得到的浸提液中的允许浓度，确认该已知物在初步确定的替代溶剂中的溶解度能够满足该允许浓度的要求。
（4）替代溶剂的选择，适用时可采用试验证明替代溶剂的提取能力应高于实际临床接触介质。
如采用替代溶剂获得的结果不能满足毒理学风险评估要求时，可采用经论述的更加接近临床实际的方式进行评估。
替代溶剂的选择应综合考虑上述4个因素。
对于无机物（金属元素）可选择水或弱酸性介质作为浸提液，但还要考虑实际使用环境，比如因酸性饮料等的使用，会使得口腔内医疗器械常接触较酸的液体环境，因此在进行口腔产品的金属离子释放研究时，可采用较酸的浸提液，具体可参考相关标准及指南规定。
除此之外还应注意，在进行溶剂选择时，还应避免所用溶剂是否会与要研究的物质发生反应使得检测不出或低于其实际的量。
比如，异氰酸酯是合成一系列性能优良的聚氨酯材料的单体，但由于异氰酸酯类单体易与水发生水解反应生成胺类物质，因此当对含聚氨酯材料产品中进行异氰酸酯单体残留研究时采用含水溶剂，如某些药物的生理盐水溶液、乙醇/水混合溶剂等，这种情况下获得的结果一般是不被认可的。
3.4浸提体积
浸提体积的选择首先应保证浸提液能够完全浸没浸提样品，其次浸提液中可沥滤物浓度能够满足检测灵敏度要求，同时还应避免因其浓度过大影响被浸提物质的进一步析出。
如果供试品溶液中待测成分浓度超过线性范围，一般需通过稀释的方法降低待测成分浓度后再行测定。
3.5浸提温度
对于浸提温度，首先应考虑器械临床实际的使用温度，如选择提高温度进行加速浸提、加严浸提或极限浸提时应注意，浸提温度不应引起器械材料和目标可沥滤物发生化学变化。
3.6浸提时间
对于浸提时间，应按照器械作用于患者的性质和接触时间来确定并尽可能模拟产品临床实际，特别是临床最大可能接触时间。
3.7其他因素
除上述条件外，还应考虑是否需要采用动态模拟、浸提液的循环速度等因素，无论采取何种浸提条件，均需证明器械所选用的浸提条件代表产品在预期使用中带给患者的最大风险。
4.分析测试方法
对于某些已经建立起相关标准检测方法的研究物质，优先选用标准方法，如国际标准、区域标准或国家标准发布的方法，或由知名技术组织或有关科技文献或期刊中公布的方法，在使用有关科技文献或期刊中公布的方法之前，应参照本指南中方法学验证参数进行验证，以确保方法的适用性。
如果不能确定方法的适用性，应开发合适的新方法。
对于无标准检测方法的可沥滤物，企业需开发新的检测方法并进行方法学验证及确认工作。
开发新的可沥滤物检测方法应根据拟研究物质的理化性质（包括极性、稳定性、溶解特性、环境敏感性等）、浸提选用溶剂、法规或毒理学评估所需的精度等合理选择检测仪器及检测方法，同时，应进行必要的方法学验证以保证方法的可靠性满足安全性评价要求。
对于无机物（元素）检测方法有：
电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-OES），电感耦合等离子体-质谱法（ICP-MS），原子吸收分光光度法（AAS）、离子色谱（IC）等；
对于有机物的主要检测方法有：
高效液相色谱/质谱（HPLC/MS）、离子色谱法/质谱（IC/MS）、气相色谱/质谱（GC/MS）、傅里叶变换红外光谱法（FTIR）等。
对于浸提液中可沥滤含量较低的微量或痕量分析，如分析方法足够灵敏，可采用浸提液直接进行分析测定，无需富集处理；如直接测定提取液或模拟提取液，分析方法的灵敏度达不到检测要求时，常用的检测样本处理方法有：
①氮吹浓缩（一般适用于有机溶剂），需要注意的是氮吹的气流速度和温度；②减压浓缩富集：
采用减压旋转蒸发浓缩的方法制备检测样本，但需注意防止温度过高影响样本中待测物的稳定性，避免样本在富集处理过程中待测物进一步降解的情况发生，同时需考虑待测物的挥发性对测定准确性的影响；③液相/固相萃取：
对提取液或模拟提取液进行液相/固相萃取；但需注意液相萃取溶剂和固相填料及洗脱溶剂的选择，建议采用加内标的方法，确保待测物的有效富集。
④衍生化：
为提高待测物的可测性，可选择适宜的衍生化试剂对待测物进行衍生化处理。
如果采用新开发方法进行测定，需要按照以下项目开展方法学验证，如果修改采用现有文献方法，则需要根据修改内容，参照选择以下项目进行方法学验证，并给与说明。
研究报告中除包含所采用的详细的测试方法和步骤外，还应明确使用的仪器信息及仪器设置参数，标准物质或对照品信息。
5.方法学验证资料
定量分析应进行方法学验证，验证的目的是证明采用的方法满足于检测的基本要求，药典（如中国药典、美国药典）和人用药品注册技术要求国际协调会（ICH）指南中均给出了特定定量分析要验证的内容，一般包括方法的准确度、精密度、专属性、线性、灵敏度（检出限和定量限）等。
需要说明的是，在方法开发和验证过程中，需要考虑基质效应的影响，基质效应指的是在对分析物的浓度或质量测定过程中，来自样品中其他化合物的一种或几种综合的影响。
为了测定可沥滤物含量时无其他成分的存在而对拟研究物质造成干扰。
5.1专属性
专属性是指在一些可能存在的组分，如其它可沥滤物、降解物、基质等存在时，对被分析物准确可靠测定的能力，是评价方法能否正确鉴定、检测出被测物的一种方法。
宜采用适宜的方法对专属性进行验证并排除各种稀释剂、降解产物等的影响，如色谱方法中，应用典型的色谱图来证明专属性。
5.2线性
线性是指在设计的范围内，测定响应值与样品中被测物浓度（量）成比例关系的程度，是定量测量的基础。
线性关系应以信号对被分析物的浓度或含量做图，根据图形是否线性进行评价。
如果有线性关系，可用适当的统计方法估算试验结果，如最小二乘法。
必要时，响应信号可经数学转换，再进行线性回归计算，或者采用描述浓度或含量—响应关系的非线性模型，并说明依据。
为建立线性，可用同一对照品贮备液经精确稀释，或分别精密称取对照品，制备一系列对照品溶液的方法进行测定，建议至少制备5个不同浓度的对照品溶液，同时应给出回归方程和相关系数（一般不小于0.99，在复杂基质或痕量分析时，接受范围可适当放宽），若用其他方法则应证明其合理性。
需要说明的是，建立方法过程中并不是线性范围越宽越好，实际上过宽的线性范围会让操作时不方便，且增加了测量误差的可能，可根据目标物浓度确定合适的工作曲线范围。
5.3范围
范围是指分析方法能达到一定的精密度、准确度和线性要求时的高低浓度或量的区间。
特定的范围一般是从线性研究中得到的，它依赖于分析方法应用目的。
选择的方法应保证实际样本中待测可沥滤物浓度在其线性范围内，当器械中可沥滤物大于定量限时，另一个考虑因素是该可沥滤物毒理学评估数值。
结合浸提液制备时的浸提比例、是否进行富集等因素，确认由毒理学评估数值转化的溶液浓度是否在所设定的线性范围内。
尤其是当器械适用于不同的人群，如儿童、婴儿甚至早产儿等人群，其线性最低点设置更应关注是否能够满足该类人群的毒理学评估结果的要求。
如果供试品溶液中待测成分浓度超过线性范围，一般需通过稀释的方法降低待测成分浓度后测定。
5.4检测限（LOD）
检测限是指样品中被测物能被检测出的最低量，方法的检出限必须满足待测物的毒理学评估数值要求，即可沥滤物的限度浓度应大于检测限。
应采用适宜的方法考察检测限，常用的评估方法有以下两种，除了下面所列的方法外其他经验证的方法也可被接受。
（1）信噪比法
该方法仅适用于出现基线噪音的分析方法。
信噪比的测定是通过比较含已知低浓度被分析物的样品与空白样品的测试信号，确定被分析物可被确切地检测的最小浓度，当信噪比在3:
1或2:
1时的检测限度通常被接受。
（2）根据响应值的标准差和斜率
检测限度（DL）表示为：
DL=3.3δ/S
δ：
响应值的标准差
S：
校正曲线的斜率
斜率S可从被分析物的校正曲线来估算，δ的值可由多种途径估算。
如通过对空白样品多次分析，然后计算其响应值的标准差。
5.5定量限（LOQ）
定量限是指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应符合准确度和精密度的要求。
常用的评估方法有以下两种，除了下面所列的方法外其他经验证的方法也可被接受。
（1）信噪比法
该方法仪适用于出现基线噪音的分析方法。
信噪比的测定是通过比较含有已知低浓度被分析物的样品与空白样品的测定信号，来建立被测物能够准确定量的最小浓度，典型信噪比为10:
1。
（2）根据响应值的标准差和斜率
检测限度（DL）表示为：
DL=10δ/S
δ：
响应值的标准差
S：
校正曲线的斜率
斜率S可从被分析物的校正曲线来估算，δ的值可由多种途径估算。
如通过对空白样品多次分析，然后计算其响应值的标准差。
通常情况下，只有当目标分析物的含量在接近于“零”的时候才需要确定方法的检出限或定量限。
当分析物浓度远大于LOQ时，没有必要评估方法的LOD和LOQ。
但是对于那些浓度接近于LOD与LOQ的痕量和超痕量检测，并且报告为“未检出”时，或需要利用LOD与LOQ进行风险评估或法规决策时，实验室应确定LOD与LOQ。
5.6精密度
精密度是指在规定的条件下，同一份均匀供试品检验液，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。
精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示，考察方法一般可进行重复性研究。
重复性指由同一个分析人员在尽可能相同的条件下对配制的不同份相同浓度供试品溶液进行测试。
关于可沥滤物测定一般应采用重复性对精密度进行考察，评价方法如下：
在方法的规定线性范围内至少测定9次，如分别采用标准曲线范围内高、中、低3种浓度的供试品溶液重复测定3次。
不同含量的可沥滤物精密度考察可接受范围可参照下表进行考察，在复杂基质或更低浓度分析时，接受范围可适当放宽。
表1精密度考察可接受范围
被测组分含量
重复性（RSD%）
10μg/L
15
1mg/L
8
10mg/L
6
100mg/L
4
1000mg/L
3
5.7准确度
准确度是指采用该方法测定的结果与真实值接近的程度，通常用回收率评价。
验证时一般要求对不同浓度样品进行平行测定，计算平均回收率，用于回收率试验的样品以不含待测成分的空白样品为最好。
可以采用加标回收率试验，按样品的处理步骤分析，得到的结果与理论值的比值。
若采用加标回收率试验，加标样品的浓度应覆盖线性范围的高、中、低浓度，并分别计算平均回收率。
除平均回收率外，还应考察不同测试样本数据的离散程度，一般用相对标准偏差（RSD）表示。
一般来说，不同的分析水平的可接受的回收率及RSD范围也不同。
实验室内方法回收率偏差范围评价可参见表2，在复杂基质或更低浓度分析时，接受范围可适当放宽。
表2方法回收率偏差范围
被测组分含量
回收率（%）
10μg/L
70~125
1mg/L
75~120
10mg/L
80~115
100mg/L
85~110
1000mg/L
90~108
6.数据要求
前述所有取样、仪器使用、标准品及对照品信息、色谱柱、仪器的校准等记录均应被记录，且应通过各种方式确保其真实、准确、完整、可追溯，以确保能够完整重现数据产生的步骤和顺序，防止漏记和随意涂改、伪造或编造数据。
如适用，带有审计追踪功能的检验设备、计算机辅助系统等记录数据，应保证其追踪功能处于有效工作状态，如现有设备不具备审计追踪功能，应通过检验日志、变更控制、记录版本控制或原始电子记录辅以纸质记录来满足数据可追溯性的要求。
同时，检验数据应能归属到人，且应保证具有唯一性。
7.报告内容
应报告上述试验过程（包括所用设备及参数、标准品及其他试剂来源，样品处理过程、浸提介质、浸提体积等浸提条件确定依据）、结果、结论及典型性图谱。
8.方法学确认
建立合适的分析方法并对方法进行验证后，新的实验室采用该方法进行检验前还应进行方法确认。
方法确认是证明经过验证的方法适用于本次检验的过程及被测样品,同时还应证明方法使用人员有能力成功地操作国际标准、区域标准、国家标准发布的方法或者已建立并验证过的方法。
确认内容可根据方法本身的特点和检验人员对方法操作的熟练程度由检验实验室自己确定。
但USP在其附录〈1226〉“药典分析方法确认（verificationofcompendialmethods）”中对分析方法确认需要确认哪些内容给出了指导意见，此处不再赘述。
9.方法再验证
在某些情况下,如原材料的合成工艺改变、分析方法发生改变等，企业应进行充分的风险评估，并根据评估结果考虑是否需要对分析方法再次进行全面的或部分的验证,以确保分析方法可行。
当原材料的合成工艺发生改变时,可能引入新的物质,则原可沥滤物的检查方法和含量测定方法的专属性就需要重新进行验证,以证明新引入的物质对原有可沥滤物的含量测定无干扰。
当原材料的来源发生变化时,可能会影响可沥滤物含量测定的专属性和准确度,因此,需要对含量测定方法进行再验证。
当某一项目的分析方法发生改变时,如采用高效液相色谱法测定含量的检测波长发生改变,则要重新进行检测限、专属性、准确度、精密度、线性等内容的验证,同时还应进行方法改变前后所得结果的对比研究,证明变更后的方法合理、可行性。
参考文献：
1.GB/T27417-2017合格评定化学分析方法确认和验证指南
2.ICHValidationofAnalyticalProceduresTextandMethodologyQ2（R1）
3.中华人民共和国药典2015年版四部9101药品质量标准分析方法验证指导原则
4.ISO10993.1-2018Biologicalevaluationofmedicaldevices—Part1:
Evaluationandtestingwithinariskmanagementprocess
5.GB/T16886.12-2017医疗器械生物学评价第12部分：
样品制备与参照材料
6.GB/T16886.18-2011医疗器械生物学评价第18部分：
材料化学表征
7.GB/T16886.17-2005医疗器械生物学评价第17部分：
可沥滤物允许限量的建立
8.USP-35:
verificationofcompendialmethods（part1226）
9.许明哲，黄宝斌，杨青云等.分析方法确认内容介绍[J].药物分析杂志.2015,35
（1）:
183-189
10.ISO/IEC17025,Generalrequirementsforthecompetenceoftestingandcalibrationlaboratories[S].2017
确认该可沥滤物是否为添加剂
否
浸提研究
否
是
是
该添加剂无需
进一步评估
该添加剂添加总量是否超过其安全限量
1.查阅：
可沥滤物理化性质；产品预期接触方式
2.选择合适的样品
3.确定合理的浸提方式
4.选择合适的浸提溶剂
5.其他浸提条件的选择：
时间、温度、液体体积、是否需要动态浸提等
是否有标准检测方法
标准方法测定
最大溶出量
是
否
建立合理的方法并进行方法学验证
溶出量测定
根据其毒理学可接受限度，形成完整的毒理学评价报告
溶出量
附录1
案例：
一次性使用聚氯乙烯输血器中可沥滤物邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）增塑剂的研究
一、概述
DEHP，是Di-（2-ethylhexyl）phthalate的缩写，全名为邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯。
分子式：
C24H38O4
结构式：
分子量：
390.6
CAS编号：
117-81-7
物理状态：
常温下为无色无臭液体。
不溶于水，溶于乙醚、乙醇、矿物油等。
熔点：
-50℃或-55℃
沸点:
在5mmHg时大约230℃（BASF1994b;Clayoton1981,inHSDB2005）
在1013hP时385℃
蒸汽压：
0.000034Pa在20℃
水溶性：
0.003mg/L在20℃
醇溶性：
>100mg/ml（95%乙醇，22℃）
密度：
0.986g/cm³at20℃（IARC19
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