植物细胞工程.docx
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植物细胞工程
绪论
1．.生物技术:
以生物科学为基础，利用生物个体或生物器官、组织、细胞的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系（包括细胞系），以及与工程原理相结合进行产品加工生产的综合性技术体系。
生物技术的内涵是：
运用现代生物学理论与科学技术改造细胞的遗传物质，培育出人们需要的生物新品种；工业规模地利用现有生物体系，制备生物产品；模拟生物体系，以生物化学工程代替化学工程，制备工业产品；发展相应的科学理论与工程技术。
其主要技术范畴包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程以及生化工程。
2．细胞工程:
是应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的实验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的学科。
广义包括所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术。
狭义是指细胞融合和细胞培养技术。
根据研究对象不同:
高等生物的细胞工程分动物细胞工程和植物细胞工程。
动物细胞工程包括细胞培养技术（包括组织培养、器官培养），细胞融合技术，胚胎工程技术（核移植、胚胎分割等）,克隆技术（单细胞系克隆、器官克隆和个体克隆）。
植物细胞工程包括植物组织、器官培养技术，细胞培养技术，原生质体融合与培养技术，亚细胞水平的操作技术等。
3．细胞工程在现代生物技术中的地位及其实践意义:
现代生物技术是典型的高技术密集型的综合技术体系。
一个生物技术产品或技术的形成，需要涉及生物学、信息学、工程学等多学科领域知识和技术的应用。
细胞工程本身作为生物技术的重要组成部分，在现代生物技术领域中也发挥着技术载体和桥梁的作用，是现代分子技术向产接技术，比如经分子重组技术改良后的基因，必须通过细胞工程的途径，才能培养成新个体品过渡的中间链或生产新产品。
另外，细胞工程技术亦可作为独立的生物技术在现代生物学研究与应用中发挥重要作用，如利用植物离体快速繁殖技术大量生产健康种苗，已在无性繁殖中获得广泛应用；离体培养中体细胞胚胎发生，已成为植物胚胎发育研究的重要实验体系等如１）改善农业生产技术２）保护自然资源，维护生态平衡３）生物医药开发
4．植物细胞工程是一门以植物组织和细胞的离体操作为基础的实验性学科，以植物组织细胞为基本单位，在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精细操作，使细胞的某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而改良品种或创造新物种，或加速繁殖植物个体，或获得有用物质的过程统称为植物细胞工程，其发展阶段与标志性成就１）探索阶段；２）培养技术建立阶段３）应用研究阶段，标志性成就：
其一组织培养领域的研究迅速在世界各国的有关实验室广泛展开。
其二技术体系更加完善。
这一阶段的技术体系包括：
根据不同的培养目的外植体的取材和灭菌方法，不同外植体及其培养产物的培养程序，适合于不同植物种类和外植体类型的培养基等。
在这一阶段中，由于控制细胞分化的需要，对培养基、激素、营养条件和培养方法都进行了大量的研究，产生了ＭＳ、Ｂ５，Ｎｉｔｓｃｈ、ＬＳ、Ｎ６等用于不同组织培养类型的培养基，也建立了各种培养方法，如平板培养法、微室悬滴培养法、看护培养法等多种特殊培养方法。
其三形成了较为完整的理论体系。
在植物组织培养研究的基础上，植物细胞工程现已形成了以细胞全能性为基本理论基础，以细胞脱分化和再分化调控为中心的理论体系。
并且对细胞脱分化与再分化的调控机理的研究，从本质上揭示了细胞全能性的表达机理。
其四研究目的性更加明确广泛应用到生物科学研究的各个领域。
建立的脱毒技术和离体繁殖技术已广泛用于多种作物无毒苗生产，如甘蔗、草莓、马铃薯等。
植物离体快速繁殖技术已在许多植物的种苗繁殖上实现了农业生产的工业化。
5．植物细胞工程可以分为不同的类别：
根据培养层次的不同可分为：
ａ植株培养，即通常的试管小植株培养，如从植株到植株的继代繁殖；ｂ器官培养，包括茎尖、根茎、叶、花（包括花器官的各部位如花药）及幼嫩果实等类型的培养；ｃ胚胎培养，包括胚、胚乳、胚珠和子房等培养；ｄ愈伤组织培养，即经植物各种外植体培养形成的愈伤组织培养；ｅ细胞培养，大多指具有良好分散性的单细胞及小细胞团的悬浮培养，包括花粉小孢子悬浮培养，同时也包括各种固体或半固体的单细胞培养；ｆ原生质体培养，植物细胞脱除细胞壁后的完整细胞培养即为原生质体培养。
根据工程技术策略的不同可分为：
ａ组织与细胞培养，包括上述所有培养类型；ｂ细胞融合，即原生质体融合，是获得体细胞杂种的技术途径：
ｃ胚胎工程，包括试管受精、以性细胞为基础的其它操作等；ｄ染色体工程，包括染色体替换、切割等；ｅ细胞遗传工程，包括通过细胞培养途径的各种外源遗传物质的摄入、体细胞突变和细胞器操作等。
按照在植物领域应用目的的不同，细胞工程还可分为植物快速繁殖的培养技术，获得特殊倍性的细胞工程技术，获得特殊杂种的细胞工程技术以及用于基因功能研究的细胞工程技术等。
6．植物细胞工程的作用与应用领域:
1）在植物育种上的应用
作用：
（１）快速获得特殊倍性材料 采用花药和花粉培养可以很快获得单倍体。
单倍体经过加倍即可获得纯合材料,大大缩短育种周期。
利用胚乳培养技术可获得三倍体，用于果实无核的瓜、果植物育种中。
（２）克服远缘杂交不亲和 采用原生质体融合技术可以获得亲缘关系相差很远的两亲本间的细胞杂种，不仅克服远缘杂交不亲和,且有可能创造新物种。
（３）克服杂种胚早期夭折 远缘杂种胚和某些果树如柑橘、早熟桃等的胚常常早期夭折，利用幼胚培养技术就可加以克服。
（４）导入外源基因 用细胞工程技术可以进行细胞器转移、基因转移、染色体转移等，实现外源基因的导入。
（５）突变体筛选 在细胞培养和原生质体培养中,常会发生各种自发的遗传变异，是十分广泛的变异来源。
同时，在细胞和原生质体水平上的人工诱变，其变异频率将会大大提高，为突变体的筛选提供了更多的机会。
（６）种质资源保存 采用组织培养技术保存植物种质，不仅节约人力物力和耕地，亦避免不可预测因素对种质资源造成的损失。
２）种苗脱病毒与快速繁殖植物病毒是引起无性繁殖作物品种退化的主要因素。
病毒防治除抗病育种外，脱除种用材料所携带的病毒是目前最有效的途径。
病毒在植物体内具有不均匀分布的特点，越靠近生长点，病毒含量越低，由此而发展了茎尖分生组织培养的脱毒技术。
利用茎尖培养脱毒，在组织培养条件下或在具有良好的病毒传播隔离的条件下进行无病毒种苗的快速繁殖，在许多无性繁殖植物中广泛应用，如马铃薯、甘蔗、香蕉、柑橘、苹果、草莓和一些珍稀花卉等。
利用组织培养技术，亦使许多传统上繁殖系数很低的有性繁殖植物得以快速繁殖，大大提高了经济效益。
３）细胞培养生产有用次生产物,植物几乎能生产人类所需要的一切天然有机化合物，如蛋白质、脂肪、糖类、天然药物、香料、生物碱及其它活性物质，其生物合成均是在细胞内进行的，利用细胞的大规模培养，可能生产这些化合物。
这些有用次生产物主要集中在价格高、栽培困难、产量低、需求大的药品上，其它次生代谢产物如香料、食品调味剂、染料和树胶等。
利用植物生产这些有用次生产物具有广阔的应用前景。
首先，它能够节约大量耕地。
因为这些产物在植物中的含量常常是很低的，要获得一定的产量就必须大面积种植,节约出种植相应植物所占用的耕地。
另外，大多数目前所利用的可以产生次生产物的植物，其栽培常常十分困难，或是需要特殊条件，或是栽培周期相当长，利用细胞培养生产相应的次生产物还可以保护生态环境、提高生产效率。
从医药工业的角度利用细胞培养生产的医药原料，其含量稳定性会更好，有利于以中药植物为基础的民族医药事业的发展。
４）在细胞生物学和发育生物学研究中的应用，植物不同组织、细胞培养获得再生个体，及其在此过程中所形成的调控技术本身，进一步揭示了植物细胞全能性学说的本质和内涵，是对细胞生物学领域的重要贡献。
长期以来，植物细胞由于细胞壁的屏障，使植物单细胞活动的相关研究受到一定影响，原生质体体系的建立为植物细胞的单细胞研究提供了良好的实验体系。
利用原生质体系统在植物细胞分裂周期调控，细胞分化等细胞生物学领域的研究取得了重要成就，不仅分离出与这些细胞学现象相关的基因，而且通过原生质体系统明确了这些基因在细胞中的表达调控机理，从而明确了相关细胞生物学现象的本质。
同时，通过细胞工程途径，在植物细胞的一些特殊领域如细胞壁生物学研究中也取得了重要进展。
发育生物学研究一般是在个体水平上进行的，由于个体水平上的变异频率低，因而很难对某一特定发育阶段的生物学现象进行正方向和负方向的比较研究。
由于细胞工程技术的应用，利用人工细胞突变体，可以定向观察某一发育负方向所产生的生物学效应。
通过这一途径，现已分离出许多与发育相关的基因，为揭示生物发育的遗传调控机理奠定了基础。
离体培养的器官发生和体细胞胚发生及其调控已成为植物形态建成的良好实验体系，从而加速了发育生物学研究的发展。
５）在植物遗传、生理生化以及植物病理等基础研究中的应用,植物细胞工程技术在植物学研究的各个领域都得到广泛应用，推动了植物遗传、生理、生化和病理学的研究，现已成为这些领域研究中的常规手段之一。
花药和花粉培养获得的单倍体和纯合二倍体植株，是研究细胞遗传的极好材料。
在单倍体条件下更易获得遗传变异，便于遗传操作，较其它方法更易获得大量变异材料。
同时，利用细胞途径进行染色体操作，可以有目的地创造植物附加系、代换系和易位系，为染色体工程的研究开辟了新途径。
此外，花粉单倍体加倍获得纯合系的方法，还为有性繁殖植物的遗传分离群体构建提供了有效途径，从而为遗传图谱构建、基因定位等提供稳定的基础材料，其应用又促进了遗传学的发展。
细胞是进行一切生理功能的场所。
因此，细胞培养和组织培养为研究植物生理活动提供了一个理想的技术体系。
植物营养研究一直是植物组织培养工作的重点，已在矿物营养、有机营养和生长活性物质方面开展了大量的研究，并取得很多重要成果。
用单细胞培养研究植物的光合代谢是其它方法难以取代的技术途径，近年来，光自养培养研究也取得了重要成果。
在细胞的生物合成研究中，细胞培养为物质代谢途径及其调控研究奠定了基础。
细胞培养研究现已在许多物质的合成代谢途径研究中取得了进展，为生物大分子物质的代谢调控奠定了基础。
植物细胞培养体系为植物病理学的深入研究提供了条件。
在人工培养条件下对植物抗病性进行研究，免除了环境条件的干扰，使得结果更加真实可靠。
同时，在细胞水平上对抗性的研究，绪论能够更好地揭示植物的抗性本质，从而也促进了植物病理学的发展。
总之，随着生物科学技术的不断发展，细胞工程的应用范围将日益扩大。
细胞工程作为一个相对独立的学科和技术体系，它能直接应用于遗传改良、繁殖、物质生产等与人类社会的生存发展密切相关的各个方面，并被认为是最有可能取得突破性成就的生物技术领域。
细胞工程作为一个由多学科渗透融合而形成的综合技术体系，其发展既依赖于分子生物学、细胞生物学、遗传学和生理学等相关学科理论的技术进步，同时也能作为这些学科发展的桥梁和载体，促进整个生命科学的发展与进步。
第一章
1．细胞的全能性：
指一个生活细胞所具有的产生完整生物个体的潜在能力
2．根据细胞脱分化过程中细胞结构发生变化的时空顺序分为３个阶段：
第一阶段为启动阶段，表现为细胞质增生，并开始向细胞中央伸出细胞质丝，液泡蛋白体出现；第二阶段为演变阶段，此时细胞核开始向中央移动，质体演变成原质体；第三阶段为脱分化终结期，回复到分生细胞状态，细胞分裂即将开始。
3.细胞脱分化的调控机理一个培养体系成功建立的关键在于如何启动细胞从分化状态回复到分生状态，此反应了脱分化过程中可能发生的可视事件，或者说是细胞脱分化的一些标志性转变，这些转变必然是在一系列调控机制的作用下产生的。
细胞脱分化调控的实质是Ｇ０期细胞回复到分裂周期的调控过程，在细胞正常生长情况下，细胞周期是一个连续的不可逆过程，一旦ＤＮＡ发生复制，随后即进入有丝分裂状态形成２个子细胞。
因此，细胞通常在Ｇ１期通过某些机制来决定是否进入Ｓ期。
如在哺乳动物Ｇ１期细胞中存在有特定的调控点，称为“限制点”在这个点之前，如果缺少外界生长信号（通常是肽生长因子）或某些必需的营养成分（如必需氨基酸），细胞会终止其Ｇ１期的进程，进入静止状态称为Ｇ０期，一旦补充了所缺少的因子，细胞即会从Ｇ０期回到Ｇ１期继续分裂周期。
真核生物细胞中存在有复杂的调节细胞周期的关键分子，它们通过相互制约或偶联形成复杂而精确的细胞周期调控网络。
在这些关键分子中，细胞周期蛋白和周期蛋白依赖激酶是两类主要的调控分子。
细胞周期运行的动力主要来自周期蛋白依赖激酶，其活性则主要通过细胞周期蛋白调节。
为了保证细胞在分裂时各环节的正确性，周期蛋白依赖激酶（ＣＤＫ）的活性还受另外一类蛋白质的负向调节，这类蛋白质被称为ＣＫＩ（周期蛋白依赖激酶抑制子）ＣＤＫ比引擎，而细胞周期蛋白则是油门，ＣＫＩ是刹车，有助于解释正常静止细胞为何会转向无序分裂的癌细胞，也为理解分化细胞脱分化进而启动分裂和再生器官或个体奠定了基础。
植物细胞具有细胞壁，通过胞间联丝将细胞相连，从而组成各种器官和组织。
在同一器官和组织内，又时常存在不同状态的细胞。
植物细胞周期的调控，除了细胞本身外，还受到周围细胞状态的影响。
由于细胞壁的屏障和胞间联丝的作用，使植物的单细胞操作十分困难，从而使植物细胞脱分化调控的研究更加复杂化。
植物激素本身并不能直接作用于ＤＮＡ从而导致特定基因的激活，需要其受体蛋白以及其它信号转导过程的参与。
植物细胞感受生长素的信号是通过生长素受体和生长素分子相结合，使生长素受体被活化来完成的称生长素感应。
激活的受体可能引起某些特定的反应，如某些离子的吸收或释放、特定蛋白的磷酸化或去磷酸化等，引起一系列连锁信号的传导反应，最终导致生长素诱导的基因表达
4.细胞分裂与愈伤组织形成：
细胞脱分化是细胞状态的改变，但成功的脱分化必然会导致细胞分裂。
在一个细胞群体培养或组织器官培养体系中，有时很难区分细胞脱分化与进入增殖状态的界限。
对于单个细胞而言，分化细胞启动分裂显然是发生在细胞完全脱分化之后，其第一次分裂方式常常比较复杂。
进入分裂周期的细胞第一次分裂即为正常的有丝分裂。
培养细胞的初期的前几次分裂为无丝分裂，以后才转入正常的有丝分裂，细胞初期的分裂方式与外植体细胞类型有关。
如外植体细胞均为正常二倍体细胞，第一次分裂通常是有丝分裂，如外植体含有高倍化细胞，脱分化的第一次分裂可能是无丝分裂。
对于组织器官培养而言，细胞分裂往往首先发生在组织分离时的伤口部位，在一个组织和细胞群体培养体系中，细胞脱分化和进入分裂的过程并非是同步，一旦伤口处某些细胞启动分裂，之后可很快影响整个外植体细胞进入分裂周期而启动分裂。
当细胞处于群体和组织结构状态下，细胞之间存在有敏感的相互联络机制，使细胞的状态和行为相互影响，细胞脱分化后进入细胞分裂的结果是形成愈伤组织，但绝不是说所有的细胞脱分化的结果都必然形成愈伤组织。
有些外植体的细胞脱分化以后直接形成胚性细胞，进而形成体细胞胚。
多数愈伤组织内的细胞并不都是未分化的，即同一愈伤组织内的细胞之间其状态存在一定差异。
特别是在组织器官培养时部分细胞不完全脱分化的现象，从而使其很容易再分化成再生植株，对培养是十分有
利的。
脱分化与愈伤组织的形成在性质上是不能等同的。
脱分化是细胞生理状态的改变，而形成愈伤组织是离体培养中的一个阶段。
5.细胞分化：
指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。
具有时间上的分化和空间上的分化。
单细胞生物仅有时间上的分化，如噬菌体的溶菌型和溶原型。
多细胞生物的细胞不但有时间上的分化，而且又有空间上的分化，如一个植物个体在其顶端、根、茎和叶等不同部位具有不同的细胞。
细胞分化是多细胞生物个体形态发生的基础，为其生活所必需，如果细胞分化有缺陷或失去控制，它们的个体乃至种族就无法生存。
从分化的遗传控制角度讲，细胞分化是各个处于不同时空条件下的细胞基因表达与修饰差异的反应所以，分化也是相同基因型的细胞由于基因选择性表达所反应的各种不同的表现型。
在离体条件下，当细胞脱分化以后，无序生长的细胞及其愈伤组织要重新进入有序生长才能再生为个体，在离体培养下的这一过程称为再分化再分化的过程，其是基因选择性表达与修饰的人工调控过程。
6．在动物的细胞分化过程中分为两种类型：
一是核内有丝分裂，二是多线染色体按照基因表达与生长发育的关系，基因可分为两类：
一类是维持细胞最低生命活动的基因，它们是细胞基本活动不可缺少的，如组蛋白基因称管家基因，另一类是与细胞行使特殊功能有关的基因，这类基因功能的丧失与细胞生存不会有直接影响，但在特定组织、器官内或特定发育时期内会导致细胞不能行使正常功能。
由于这类基因常常在一定条件下大量表达，因而称为奢侈基因，细胞分化从基因调控水平上来说即是这类奢侈基因选择性表达的结果，不同类型的奢侈基因的表达，会导致细胞分化产生不同功能的细胞。
7.极性与细胞分化
极性是植物细胞分化中的一个基本现象，没有极性就没有分化，它是指植物的器官、组织，甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。
极性无论在低等植物或高等植物中均普遍存在。
极性一旦建立，在一般情况下不可逆转
8.ＴＥ细胞分化及其调控：
高等植物的维管系统具有水分和营养物质运输、传递生物与环境信息以及机械支撑以保持植物体的正常形态等多种功能。
作为维管系统的主要成分，管状分子（ＴＥｓ）在维管系统的形成中具有中心作用。
在植物系统发育条件下，ＴＥｓ由根和芽的原形成层或次生形成层细胞分化形成。
在离体培养条件下，ＴＥｓ则由愈伤组织薄壁细胞分化形成，是愈伤组织细胞分化器官的前提。
如果愈伤组织一直保持薄壁细胞状态，ＴＥｓ分化受阻，器官发生则不正常，只有愈伤组织的某些细胞分化形成ＴＥｓ，进而才可能形成维管系统，器官才能进一步分化形成。
而极性的建立似乎又是维管发生的一个信号。
极性建立后生长素按极性方向流动，导致ＴＥ细胞分化，离体培养中ＴＥ细胞的出现作为组织分化的标志。
由于ＴＥ细胞在分化过程中具有细胞壁加厚，原生质体自溶等容易观察的细胞特征，又为植物细胞分化研究提供了模式体系。
如叶肉细胞ＴＥ分化体系，在培养条件下，叶肉细胞不经过分裂而直接形成ＴＥ细胞，把叶肉细胞不经过分裂而直接通过分化转变成为ＴＥ细胞的过程称为转分化，ＴＥ细胞分化划分为３个阶段：
第一阶段是叶肉细胞脱分化的过程。
其典型的细胞学特征是，微丝发生重排形成网状结构，将叶绿体锚定在质膜上，进而叶绿体降解，同时细胞明显拉长。
在此期间表达的基因可划分成３组：
一组是受伤诱导基因，；第二组是一些与蛋白质合成组装相关的基因；第三组是延伸因子。
这阶段的基因表达，通常均与受伤诱导有关，但在此阶段的后期，基因的转录水平通常与培养基中是否有植物激素有关。
第二阶段为脱分化叶肉细胞向ＴＥ细胞的转分化阶段，涉及到许多基因的特异表达。
第三阶段进入ＴＥ细胞特化阶段，在此期间，细胞壁加厚，原生质自溶，细胞核和细胞器消失，细胞骨架呈网状螺旋排列，整个细胞变成管状细胞
9．激素在细胞分化中的调控作用：
激素在植物生长发育中具有重要的调控作用，也是离体培养条件下调控细胞脱分化和再分化的主要因素，其中生长素和细胞分裂素是两类主要的调控培养条件下细胞生长和分化的植物激素。
赤霉酸（ＧＡ３）、脱落酸（ＡＢＡ）和乙烯（ＥＴＨ）等也在细胞分化中起到一定的调节作用。
如果先用生长素处理，后用细胞分裂素处理，则有利于细胞分裂而不利于细胞分化。
反之，则有利于细胞分化。
如果两者同时处理，则可提高分化频率。
10.离体培养中器官发生的方式：
通过器官发生形成再生植株大体上有３种方式：
第一种方式是先芽后根。
即先分化芽，芽形成之后，在芽的基部长出根进而形成完整植株，这是植物离体培养中较为普遍的一种植株再生方式。
第二种方式为先根后芽。
即先分化根，再在根上产生不定芽进而形成完整植株。
培养物中如果先形成根则往往抑制芽的形成，通常通过分化培养基的调控来促进先形成芽。
第三种方式是在愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过维管组织的联系形成完整植株。
这种再生方式在许多植物离体培养中均有出现，它们的芽和根一般是同步发生的，也可能略有先后，在进一步的发育过程中，芽中的维管组织向下分化，最后芽和根的两种维管组织相互连接，形成统一的轴状结构，进而形成完整再生植株。
11.器官分化过程：
培养外植体再生个体可以直接由外植体某些细胞转分化形成，也可以
通过愈伤组织介导形成，即先诱导外植体形成愈伤组织，然后通过再分化形成。
离体培养条件下，经过愈伤组织再分化器官一般要经过３个生长阶段：
第一阶段是外植体经过诱导形成愈伤组织，愈伤组织实质上就是一团无序生长的细胞，这些细胞大多处于随机分裂状态。
组织学研究显示，处于非分化状态的愈伤组织细胞均为近圆形的液泡化薄壁细胞，蛋白质含量少，细胞器不发达。
组成同一愈伤组织的细胞大小不均一，处于表面或者说外围的细胞体积较小，越往愈伤组织中间的细胞越大。
第二阶段是“生长中心”形成，当把愈伤组织转移到有利于有序生长的条件下以后，首先在若干部位成丛出现类似形成层的细胞，通常称之为“生长中心”，也称为拟分生组织，它们是愈伤组织中形成器官的部位。
处“生长中心”的细胞体积小，细胞质稠密，蛋白质合成丰富，液泡逐渐消失。
“生长中心”形成是器官发生的一个转变时期，此时细胞从无序生长转为有序生长，这种转变通常首先发生于那些感受态细胞，感受态细胞首先进行一次定向分裂，随后即进入快速分裂期，进而在愈伤组织中出现排列有序的成束的致密细胞团。
第三阶段是器官原基及器官形成。
“生长中心”形成后，按照其已确立的极性，某些细胞开始分化形成管状细胞，进而形成维管组织“生长中心”部位开始形成不同的器官原基，进而分化出相应的组织和器官。
12.起始材料对器官分化的影响：
１母体植株的遗传基础，同种植物不同品种（基因型）的培养效果具有较大差异，基因型间芽再生能力具有显著差异，最高的可达９７％，而有些基因型则不能再生植株。
通常把组织培养反应的差异的现象称之为顽拗性，外植体的类型，外植体对诱导反应及其再生能力的影响体现在外植体的生理状态上。
总体来讲，生理状态
年轻，来源于生长活跃或生长潜力大的组织和器官的细胞更有利于培养，但具体到不同的植物类型则有较大差异。
对于多年生植物而言，以幼嫩组织为材料无论是诱导还是分化均较容易，而以较老组织为外植体的培养物分化则相对困难些。
有性繁殖植物在通常情况下以胚或幼嫩果实为外植体较好，一二年生无性繁殖植物的取材则可塑性较大，但仍以自然繁殖器官为外植体更易成功。
外植体选取合理与否，不仅影响培养的难易，而且有时甚至影响分化的程度和器官类型。
13.激素对器官分化的调控：
激素在细胞生长与个体发育中具有重要的调控作用。
离体培养下的器官分化，在大多数情况下是通过外源提供适宜的植物激素而实现的。
在众多的植物激素中，生长素与细胞分裂素是两类主要的植物激素，在离体器官分化调控中占有主导地位。
当ＩＡＡ与激动素的浓度比例高时有利于根的形成，比例低时有利于芽的形成。
赤霉素对于器官分化亦具有一定的调节作用，在适宜的浓度下有利于芽的伸长生长。
在大多数情况下，分化培养基勿需添加外源赤霉素，但有些植物在分化芽的过程中，还需加入一定浓度的赤霉素。
这是因为对于大多数培养物来讲，其本身的内源赤霉素水平已可以满足分化的需要，而少数植物则相反，其内源赤霉素水平相对较低，这时就需要加入适当的外源赤霉素以满足芽分化的需要。
赤霉素对器官发生具有抑制作用，可能与培养物本身内源赤霉素含量较高有关因为大多数植物激素在高浓度状态下，均表现出生长抑制或毒害作用。
植物多肽ＰＳＫ不仅具有促进细胞分裂的作用，同时也参与器官分化。
14.细胞全能性与形态发生化的调控：
添加ＰＳＫ可以极大地加强基本激素的作用效果，如在蓝猪耳草茎段培养中，如果只有生长素存在，外植体能分化不定根，添加ＰＳＫ以后，则可大大提高不定根的分化率。
而只有细胞分裂素存在时，外植体分化不定芽，当加入ＰＳＫ以后，则不定芽的分化率显著提高。
一般认为，细胞分裂素自由碱基形式是
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