细胞工程要点复习笔记.docx
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细胞工程要点复习笔记
细胞融合（cellfusion），
-指两个或更多个相同或不同细胞通过膜融合形成单个细胞的
过程。
-自然过程：
受精
（四）细胞融合的意义
可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。
这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。
融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。
体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。
淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。
二细胞融合的基本原理
显微镜下细胞融合过程
融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解
用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图
Fusionprotein在细胞融合过程中的作用
三细胞融合的常用方法
（一）仙台病毒法
仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段：
①两种细胞在一起培养，加入病毒，在4℃条件下病毒附着在细胞膜上。
并使两细胞相互凝聚；
②在37℃中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此时需要Ca2+和Mg2+，最适PH为8.0一8.2；
③细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和ATP；
④融合成巨大细胞，仍需ATP。
病毒促使细胞融合的主要步骤如下：
1.两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近；
2.通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透；
3.两个原生质体的细胞核互相融合，两个细胞融为一体；
4.进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种细胞。
（二）聚乙二醇（PEG）法
用法简单，融合效果稳定。
PEG的作用机理：
PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在在质膜之间形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。
PEG诱导融合的特点：
融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。
缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。
（三）电融合法
电融合法是80年代出现的细胞融合技术，在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形成融合体。
电融合法的优点：
融合率高、重复性强、对细胞伤害小；
装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程；
免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。
电融合的基本过程：
细胞膜的接触：
当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；膜的击穿：
原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。
根据已经发生融合的细胞中所含有核的类型，可将其
分为以下几种类型：
异核细胞：
非同源细胞的融合体。
同核细胞：
两个相同细胞的融合体。
多核细胞：
含有双亲不同比例核物质的融合体。
常用的杂种细胞筛选方法
基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选
基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选
由温度敏感型细胞组成的杂种细胞的筛选
具有所需性状杂种细胞的筛选
单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞（myelomacell）与经特定抗源免疫刺激的B淋巴细胞（antigenstimulatedBlymphoblast）融合得到杂交瘤细胞（hybridomacell），杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。
二、杂交瘤技术的基本原理
（一）杂交瘤技术的理论基础
_淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克隆只产生一种抗体；
_细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性；
_利用代谢缺陷补救机理筛选杂交瘤细胞，并克隆化，制备单克隆抗体（McAb）。
三、杂交瘤细胞的制备
（一）骨髓瘤细胞选择及选择性培养基
.骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体
.选择次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）
.胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）
HAT培养基
次黄嘌呤（hypoxanthine，H）
氨基喋呤（aminopterin，A）
胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidine，T）
四、单克隆抗体的应用
单克隆抗体具有高度的特异性与灵敏性，可以广泛地由于临床医学的疾病诊断，以提高疾病诊断的准确性。
利用单克隆抗体技术可以生产各种免疫疫苗，这不仅能大大降低生产成本，同时也增加了疫苗的安全性。
单克隆抗体还有可能用于某些肿瘤的治疗，是人类战胜癌症十分有望的潜在技术。
单克隆抗体技术还可广泛用于各种基础医学研究，从而推动现代医学的不断发展。
动物细胞大规模培养的用途
-蛋白质蛋白质药物蛋白质疫苗诊断用蛋白质或抗体
-病毒疫苗生产基因治疗
-干细胞的大规模培养体细胞的大规模培养:
组织工程，免疫治疗，肿瘤疫苗等等。
。
。
。
4.大规模细胞培养的方法
1）贴壁培养
a.转瓶或细胞工厂培养
b.贴壁-悬浮培养（假悬浮培养）如:
Vero细胞
-微载体和多孔微球培养
-提供充足的贴附面积、传氧条件好
-避免了剪切力的损伤
-适用于多种生物反应器进行大规模培
养
-培养过程中需要血清
2）悬浮培养
-操作简便，培养条件均一，容易扩大培养
-细胞密度大，生产效率高
-适用于生物反应器放大
-是蛋白质药物生产的主流技术
5.大规模细胞培养的模式
批式操作（batchculture）：
细胞生长一定密度后，收获上清液或细胞
-技术简单
-原核细胞常用
-常用于病毒疫苗制备
-一般不用于真核细胞的蛋白质表达
-蛋白表达量低
-成本高
半连续式操作：
每间隔一定时间取出部分培养物，补充新鲜培养基，继续培养。
灌流式操作（Perfusionculture）：
培养过程中不断有培养液取出，同时不断补充新鲜培养基
-细胞密度高，可达到1x10e8cell/ml
-生物反应器利用率高，需要较小的生物反应器
-产品在罐内停留时间缩短，可及时收获蛋白质
-有利于产品质量的提高。
-培养时间长，工艺复杂
-污染风险大
-容易堵塞
流加培养（fed-batchculture）：
*培养物过程中定期加入营养及补充成分培养基
–补加氨基酸，糖，谷氨酰胺，维生素，生长因子等
–蛋白质产量高
–工艺稳定
–条件易控
–时间周期相对较短
–是单克隆抗体和许多蛋白质药物的首选培养方法
6.细胞培养的规模
bioreactor30L-15000L
7.生物反应器新发展：
singleusebagbioreactor配合Wavebioreactor
-一次性使用，防止污染
-无需复杂的在线灭菌过程
-建设成本低
8.生物反应器的条件优化
1.温度2.pH，CO23.渗透压4.氨,谷氨酰胺5.糖，流加6.氧气，供养7.乳酸8.氨基酸及其他营养成分
9.蛋白质药物生产过程
10.常用细胞
CHO细胞的优点
（1）既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力；
（2）具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源基因的整合稳定；
（3）具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化；
（4）能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。
且培养体积能达到25000L以上，可以大规模生产。
（5）糖基化与人细胞相似。
鼠骨髓瘤细胞：
骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合后形成杂交瘤细胞
–它们是“专业”的分泌细胞，在培养上清中可产生高达5g/L的Ig，
–容易转染，容易生长，
–无血清培养基中高密度悬浮培养。
–常用的细胞有NS0、Sp2/0、J558L和等。
干细胞
是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。
干细胞的特性：
1，形态和生化特征:
圆形、体积小、核质比例大，端粒酶活性高
2，干细胞的增殖特点
缓慢性：
干细胞的增殖速度一般比较慢。
而一旦机体需要时，干细胞就可以进入分化。
自稳性：
会自我更新维持自身数目的恒定。
（self-maintenance）干细胞维持自稳性的机制：
对称分裂和不对称分裂
3，干细胞的分化特点
1）.多潜能性2）.去分化和转分化的能力
2）.去分化和转分化的能力
（1）去分化一种干细胞向其前体细胞的逆向转化的过程。
（2）转分化（transdifferentiation）一种组织类型的干细胞在适当条件下分化为另一种组织类型细胞的过程。
4，特点
干细胞本身不是终末分化细胞；
干细胞能无限增殖分裂；
干细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态；
干细胞分裂产生的子细胞只能有两种命运——保持为干细胞或分化为特定细胞。
三，干细胞的分类
按分化潜能
全能干细胞（Totipotentstemcell）
是指具有无限分化潜能,能分化成所有组织和器官的干细胞。
换句话说,也就是具有形成完整个体分化潜能。
多能干细胞（pluripotentstemcell）具有分化出多种细胞组织的潜能。
如造血干细胞、神经干细胞。
单能干细胞（monopotentialcell）只能向一种或两种密切相关的细胞类型分化。
按发育状态（来源）
胚胎干细胞embryonicstemcell,ES细胞
指从着床前的内细胞团或原始生殖细胞获得的一种具有多潜能性、可发育成为各种细胞、同时可保持不分化状态而持续生长的克隆细胞系。
成体干细胞（Adult-derivedStemCell）
是成体组织内具有自我更新及分化一种或一种以上子细胞的未成熟细胞。
a取自终止妊娠的胎儿的性器官组织b取自体外受精胚胎囊胚期内层细胞c通过体细胞核转移技术获得
过渡放大细胞
是介于干细胞和分化细胞之间的中间态细胞。
它可以起到通过较少的干细胞产生较多的分化细胞的作用。
细胞工程
是指以细胞为基本单位进行培养、增殖或按照人们的意愿改造细胞的某些生物学特性，从而创造新的生物和物种，以获得具有经济价值的生物产品。
它主要由两部分构成，其一是上游工程，包含细胞培养、细胞遗传操作和细胞保藏三个步骤。
另一个则是下游工程，是将已转化的细胞应用到生产实践中去，以生产生物产品的过程。
组织培养
首先将外植体分离出来，然后在无菌及适当条件下培养以诱导出愈伤组织，另外在愈伤组织随外植体生长一段时间后还需要进行继代培养，以避免代谢产物积累及水分散失等因素的影响。
细胞培养
可分为悬浮细胞培养、平板培养、饲养层培养和双层滤纸植板几类，它们都是将选定的植物细胞于适当的条件下进行培养，以得到大量基本同步化的细胞，为遗传操作提供材料。
花粉及花药培养
主要是使花粉改变正常发育途径而转向形成胚状体和愈伤组织，从而产生单倍体植株。
离体胚培养
有幼胚与成熟胚培养两类，通过使用相应的培养基使离体胚正常的萌发生殖，以供研究和操作使用。
原生质体的培养
是一切利用原生质体进行遗传操作的基础，它是将取得的植物细胞去除细胞壁形成原生质体后进行培养，具体方法与细胞培养有一定的相似之处。
将外源DNA导入靶细胞的方法有
除了以前经常使用的质粒载体、病毒载体、转座因子和APC（酵母人工染色体）等途径外，通过lipoplex\polyplex介导、裸DNA、"基因枪"、超声波法和电注射法等非病毒方式转换细胞的方法也开始被广泛的使用
液氮超低温保藏
这种方法利用液氮的温度可以达到-196℃
标准的组织培养实验室包括：
1.准备室器具的洗涤、干燥、消毒。
2.配置室进行药品的保存、配置、消毒、分装等。
3.灭菌室培养基及使用器具的消毒与灭菌
4.接种室进行材料的接种，内置超净工作台或接种箱。
外设缓冲间,放置拖鞋、工作服、工作帽等。
5.培养室将接种的材料进行无菌培养生长的场所
6.细胞学观察实验室进行培养材料的组织学、细胞学、观察照相等
培养条件
温度
温度是植物组织培养中的重要因素，大多数植物组织培养在23～27℃之间进行，一般采用25±2℃。
低于15℃时生长停止，高于35℃时对植物生长不利。
光照
光强、光质、光照时间
光照强度：
1000lx-1500lx
黑暗条件：
利于细胞、愈伤组织的诱导增殖。
光照条件：
利于器官的分化
光质：
对愈伤组织生长红光促进蓝光阻碍
光暗周期16光照8黑暗
湿度
影响包括培养容器内湿度的保持和环境的湿度条件
渗透压
通常1-2个大气压对植物生长有促进作用，2个大气压以上就对植物生长有阻碍作用，而5-6个大气压植物生长就会完全停止，6个大气压植物细胞就不能生存
PH
大多在5-6.5左右，一般培养基皆要求5.8，这基本能适应大多数植物培养的需要。
一般来说PH值高于6.5时，培养基会变硬；低于5时，琼脂不能很好地凝固。
因为高温灭菌会降低PH值（约0.2-0.3个PH值）因此在配制时常提高PH值0.2-0.3单位
外植体（explant）
由活体（invivo）植物体上提取下来的，接种在培养基上的细胞、组织、器官等。
细胞脱分化（dedifferentiation）
是指在离体培养条件下，分化细胞失去其原有分化的典型特征，转变为分生状态，形成胚性细胞团或愈伤组织的现象。
分化细胞的脱分化需要两个条件：
创伤和外源激素
愈伤组织
脱分化后的细胞，经过分裂，产生无组织结构、无明显极性的细胞团。
愈伤组织细胞大而不规则，高度液泡化，没有次生细胞壁和胞间连丝。
继代培养：
外植体在培养基上培养一段时间后，营养物质枯竭、水分散失，并且积累一些代谢产物，需将培养物转到新的培养基上继续培养，这种转移称为继代培养或传代培养。
原生质体（protoplast）
脱去细胞壁、裸露的细胞。
又称原生质球。
原生质体是为质膜所包围的裸露细胞。
亚原生质体（subprotoplast）
在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成的一些较小的原生质体。
它可以具有细胞核，也可不具有细胞核。
核质体（nuclearplast）
由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。
也称为微小原生质体。
胞质体（cytoplast）
不含细胞核，而仅含有细胞质的原生质体。
原生质体杂交融合意义
植物细胞育种中的核质替换，细胞质杂种的获得，远缘杂交创造新物种细胞，细胞器的互作研究
原生质体分离的方法
机械法
先将细胞放在高渗糖溶液中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原生质体收缩成球形后，再用机械法磨碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。
缺点：
获得完整的原生质体的数量比较少，能够用此法产生原生质体的植物种类受到限制。
优点：
该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。
酶解法
指将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一定时间，在酶液的作用下，细胞壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方法。
优点：
获得量大，适用广泛。
缺点：
商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质。
会影响所获原生质体的活力。
原生质体纯化的方法
漂浮
采用比原生质体密度大的高渗溶液（蔗糖、Percoll、Ficoll），使原生质体漂浮在液体表层的纯化方法
优点：
可以避免分离的原生质体因震荡被组织碎片撞击而破损。
所用药品简单，成本低。
缺点及补救措施：
对离心力要求比较严格，掌握不好，原生质体则不易漂浮。
可采用不同浓度和不同离心速度分次漂浮的方法。
沉降
利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中，先进行过滤然后低速离心，使纯净完整的原生质体沉积于试管底部。
优缺点：
纯化原生质体比较简单。
由于原生质体沉积于试管底部，造成相互挤压，常引起原生质体的破碎。
不连续梯度
又称界面法，采用两种密度不同的溶液形成不连续梯度，通过离心使原生质体与破损细胞分别处于不同液相中，从而纯化原生质体的方法。
优点：
可以收集到数量较大的纯净原生质体，同时避免收集过程中原生质体因相互挤压而破碎。
原生质体培养
液体浅层培养法
优点：
原生质体在液体环境中有较强的吸收营养物质的能力，表现出较强的细胞分裂能力。
操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物。
缺点：
原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。
此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。
双层培养法——液体-固体双层培养法
优点：
固体培养基中的营养物质可以缓慢放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中添加一定量的活性炭，则还可能吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。
缺点：
不易观察细胞的发育过程。
固体薄层培养法
优点：
使原生质体处于固定位置，避免了原生质体的漂浮游动，有利于对单个原生质体的细胞壁再生及细胞团形成的全过程进行定点观察。
缺点：
培养基温度对薄层质量和原生质体分布有一定影响；另外，固体中单细胞生活能力弱，通气状况不良，第一次细胞分裂时间会推迟2d左右。
琼脂糖珠培养
将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约50ml一滴的量滴于直径6cm的培养皿，待其固化后向其中添加3ml液体培养基并于摇床上低速旋转培养。
培养过程中，通过调整液体培养基的渗透压来调节培养物的渗透压以利于其进一步的生长和发育，这种方法由于改善了培养物的通气和营养环境，从而促进了原生质体的分裂和细胞团的形成。
影响原生质体培养的因素
?
（1）原生体的活力
（2）原生质体密度（3）细胞壁再生速度（4）培养条件
原生质体融合方法
化学NaNO3高pH高Ca2+PEG电融合
融合类型
异核体（heterokaryon）或异核细胞
基因型不同的原生质体融合成杂交细胞
同核体（homokaryon）
基因型相同的原生质体融合成的杂交细胞
非对称杂种或细胞质杂种
细胞质工程又称细胞拆合工程
是通过物理或化学方法将细胞质与细胞核分开，再进行不同细胞间核质的重新组合，重建成新细胞。
可用于研究细胞核与细胞质的关系的基础研究和育种工作。
细胞器移植细胞核移植经典途径微生物移植
植物组织培养
是指植物的任何器官、组织或细胞，在人工预知的控制条件下，放在含有营养物质和植物生长调节物质等组成的培养基中，使其生长、分化并形成完整植株的过程。
其理论依据是植物细胞具有全能性。
特点取材少，培养材料经济；人为控制培养条件，不受自然条件影响；生长周期短，繁殖率高；管理方便，利于自动化控制。
培养基水无机有机生长调节物质琼脂pH值调节物质
组织培养
是指把活体的一小片组织置于底物上孵育，细胞自其周围移出并生长。
细胞培养
是指把取得的组织用机械或消化的方法分散成单个细胞悬液，然后进行培养。
组织或细胞培养优点
（1）研究对象是活细胞
（2）研究条件可人为控制
（3）研究样本可达到相对均一性
（4）研究内容便于观察、检测和记录
（5）研究范围较广
（6）研究相对较经济
悬浮型
见于少数细胞类型，体外培养时不附着于底物，悬浮在培养液中生长。
贴附型
为附着于底物表面生长的细胞，体外培养的大多数细胞以贴附方式生长。
培养细胞的生长特点
贴附和伸展
接触抑制和生长的密度抑制
原代培养（primaryculture）是指将培养物放置在体外培养，中途不分割培养物的过程。
即从体内取出组织接种到第一次传代的阶段。
传代培养（subcultureorpassage）是指当细胞增殖到一定密度后，需要分出一部分细胞并更换培养液的过程。
滞留期指数生长期（对数生长期）此期细胞增殖旺盛，活力最佳，可维持3～5天。
平台期：
（生长停止期）此期不再增殖，即达到生长饱和密度，应及时传代。
天然培养基合成培养基无血清培养基
原代培养细胞纯化的方法酶消化法机械刮除法反复贴壁法克隆法培养基限定方法流式细胞仪分离法
冻存与复苏的基本原则是慢冻快融
冻存
尽可能减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤，多用甘油或DMSO
复苏
以保证细胞外结晶在很短的时间内融化，避免融化的水分渗入细胞内再结晶。
细胞悬浮培养的建立
愈伤组织的诱导-悬浮系的建立与继代培养-悬浮细胞的生长动态-悬浮细胞同步化
成功的细胞悬浮系应当满足3个基本条件：
1）悬浮培养物分形散性良好，细胞团较小，一般由几十个以下的细胞组成，但很少完全由单细胞组成的县浮细胞系。
2）均一性好。
3）生长迅速。
悬浮培养细胞的同步化
同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。
饥饿法-导致的细胞分裂受阻常常是使细胞不能合成DNA，即不能进入S期，或细胞分裂不能进行，即不能进入M期。
因此，通过饥饿法可以获得处于G1和G2期的同步化细胞
抑制剂法-通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在DNA合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期（G1）的同步化细胞。
分选法-通过细胞形态大小利用离心等方法分选
低温处理-不同的温度对细胞的有丝分裂有极明显的影响，在一定范围内，温度下降使细胞分裂速度减慢，细胞周期延长，从而相应地延长了分裂期的时间，使分裂指数提高，细胞同步化率升高。
植物单细胞培养的意义
建立单细胞无性系，有助于研究植物细胞的特性和潜力，了解细胞间的相互关系，研究细胞分化、发育和形态发生的分子机理。
采用生物化学的方法，对培养的单细胞进行人工诱发突变，或建立遗传转化受体。
在细胞水平上对花粉进行培养，可排除体细胞干扰。
利用生物反应器可大规模地培养细胞，进行次生代谢产物的生产。
植物细胞大规模培养的技术要求
培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定的产物。
细胞生长速度快，短时间内能生产较多产物
产物不被迅速降解，最好能分泌到培养基中
无病毒苗木
是指不含该植物主要的危害病毒，即经检测主要病毒在植物体内的存在表现为阴性反应的苗木。
无病毒苗培育的意义
去除病毒危害，提高作物品质与产量
减少环境污染，有利于保护环境
无病毒苗培育的方法
一、热处理脱毒
二、微茎尖培养脱毒
三、其他途径脱毒愈伤组织培养脱毒茎尖微体嫁接化学疗法脱毒
无病毒植物的鉴定
一、指示植物（indicatingPlant）法
1.概念：
利用病毒在其他植物（指示植物或鉴别寄主）上产生特定症状（枯斑和空斑）作为鉴别病毒存在与否和种类的方法。
2.局限性：
它只能鉴定靠汁液传染的病毒。
3.适用：
草本与木本植物
4.优点：
灵敏、准确、可靠，操作方便。
二、抗血清（antiserum）鉴定法
1.原理：
植物病毒是由蛋白质和核酸组成的核蛋白，是一种较好的抗原，给动物注射后会产生抗体，抗体存在于血清之中称抗血清。
不同病毒产生的抗血清有各自的特异性。
用已知抗血清可以鉴定未知病毒的种类
2.特点
特异性高，测定速度快
三、电子显微镜（electricmicroscope）检查法
1.花药培养的概念：
是指将花粉发育到一定阶段的完整花药接种到培养基上，诱导形成单倍体再生植株的技术。
2.花粉培养的概念：
是指将离体的花粉粒接种到培
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