微生物浅析熏马肉制品中沙门氏菌的检测方法教案.docx

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微生物浅析熏马肉制品中沙门氏菌的检测方法教案

浅析熏马肉制品中沙门氏菌的检测方法

摘要3

1.熏马肉介绍3

2.熏马肉制品的感官指标3

3.熏马肉制品的理化指标4

4.熏马肉微生物指标4

5.熏马肉中沙门氏菌的检测5

5.1沙门氏菌性质5

5.2沙门氏菌的检测方法5

5.2.1传统标准检测方法5

5.2.2普通PCR检测方法11

6.总结14

致谢15

参考文献15

浅析熏马肉制品中沙门氏菌的检测方法

摘要：

20世纪50年代以来,国内外学者进行了大量的研究,从以传统方法为基础发展到以免疫学为基础的或以分子生物学为基础的快速检测方法,并在实践检验中不断取得新进展。

这些方法包括酶联免疫吸附试验法、免疫磁珠法、免疫荧光标记法、噬菌体裂解试验法、核酸探针法等[3]。

现对其传统标准检测方法和普通PCR检测方法作以介绍，并分析比较。

关键字：

熏马肉制品沙门氏菌PCR检测

一、熏马肉介绍

熏马肉是新疆地方特产，是哈萨克族风味食品，以马为原料，通过腌制、熏烤、蒸煮等工艺加工而成的熟制品。

其肉制品具有特殊的烟熏味呈棕褐色、肉色鲜艳、味道适中、耐藏性好。

熏马肉含有十八种氨基酸，高钙富铁、蛋白质含量高；而且脂肪含量低，维生素E含量高，胆固醇含量低。

资料显示它的蛋白质含量为20.1%，脂肪含量为2.5%，并含有人体所需的多种维生素。

如：

VA、VB1、VB2、VC等。

马肉含有的十几种氨基酸及人体必需的多种维生素。

还含有钙、锌、铁、硒等矿物质，含量丰富，可促进血液循环，预防动脉硬化，增强人体免疫力。

马肉脂肪的质量优于牛、羊、猪的脂肪。

马肉脂肪近似于植物油，不饱和脂肪酸含量高。

不饱和脂肪酸可溶解掉胆固醇，使其不能在血管壁上沉积，对预防动脉硬化有特殊作用。

二、熏马肉制品的感官指标

熏马制品的感观指标主要从其色泽、分味、外观、组织结构等方面来进行评定，评定表如下：

感官指标

项目

评价

色泽

在自然光线下，产品表面呈褐红色、

切面为粉红色

风味

具有熏马肠特有的香味，咸淡适中，鲜嫩可口，

入口香味浓厚，回味无穷，无异味

外观

衣表面干燥完整，并与内容物密切结合，

肠头无流油滴，无烧黑、粘液及霉斑；

组织结构

紧密而坚实，有弹性，切面坚实而湿润，

切片性好，无碎屑

三、熏马肉制品的理化指标

熏马肉的的理化指标很重要，其中包括了重金属砷、铅的指标控制，还有在熏烤过程中产生的苯丙芘的控制，以及向其中加入的抗氧化剂亚硝酸盐的检测。

最后的净重按照其包装容量的不同各有所异。

以下是熏马制品的理化指标标准：

理化指标

项目

指标

亚硝酸盐（以亚硝酸钠计）

≤30mg／kg

铅（以Pb计）

≤1.0mg／kg

砷（以As计）

≤0.5mg／kg；

苯并芘（a）

≤5mg／kg

净含量（用感量1／10的天平称重）

（200±5）g、（300±8）g

四、熏马肉微生物指标

熏马制品的微生物指标有细菌总数、大肠菌群及致病菌，其中致病菌不得检出。

以下为微生物检测标准：

微生物指标

项目

指标

细菌总数

<2000个／g

大肠菌群

<30个／100g

致病菌

不得检出

五、熏马肉中沙门氏菌的检测

5.1沙门氏菌性质

沙门氏菌是肠杆菌科中一种重要的人畜共患病原菌，革兰氏阴性，是细菌性食物中毒的重要致病菌。

血清型种类繁多，目前全世界已分离出2523个血清型，我国已发现216个[1].。

与人类疾病有关的血清型主要集中于A~E群，包括伤寒沙门氏菌、（甲、乙、丙型）副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌等，其中以鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌及猪霍乱沙门氏菌最为常见。

它不仅能导致鸡白痢、鸡伤寒、副伤寒、仔猪副伤寒等动物疾病，还能使人类发生伤寒、副伤寒、败血症、胃肠炎和食物中毒[2]。

5.2沙门氏菌的检测方法

肉制品中沙门氏菌的检测有很多方法，这些方法包括酶联免疫吸附试验法、免疫磁珠法、免疫荧光标记法、噬菌体裂解试验法、核酸探针法等[3]。

现对其传统标准检测方法和普通PCR检测方法作详细介绍。

5.2.1传统标准检测方法

传统标准检测方法，包括前增菌,选择性增菌,选择性平板分离,生化试验,血清学分型鉴定五个步骤。

5.2.1.1设备和材料

5.2.2.1.1恒温培养箱：

36℃±1℃，42℃±1℃

5.2.2.1.2拍击式均质器

5.2.2.1.3电子天平：

感量0.1g

5.2.2.1.4无菌锥型瓶：

容量500ml,250ml

5.2.2.1.5微量移液器及吸管

5.2.2.1.6无菌培养皿：

直径90mm

5.2.2.1.7无菌试管：

3mm×5mm、10mm×75mm

5.2.2.1.8无菌毛细管

5.2.2.1..9三角烧瓶

5.2.1.2培养基和试剂

5.2.1.2.1缓冲蛋白胨水（BPW）：

称取蛋白胨10g，NaCl5g，Na2HPO4`12H2O9g，KH2PO41.5g,加蒸馏水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三瓶，121℃，灭菌20min。

5.2.1.2.2四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液：

称取18.72g,加蒸馏水200ml，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装试管，每管10ml，121℃，灭菌20min，此上配制的为基础液，冷却至50℃，每100ml基础液加入碘液2ml，0.1%煌绿液1ml，混匀备用。

5.2.1.2.3亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：

称取4.6g，加蒸馏水200ml，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装试管，每管10ml，无需高压灭菌，冷却至常温立即使用。

5.2.1.2.4亚硫酸铋（BS）琼脂：

称取39.3g，加蒸馏水950ml，搅拌加热煮沸至完全溶解，无需高压灭菌，为基础液；称取8g指示剂，加水50ml，水浴50℃左右，搅拌溶解，将50ml指示剂加入950ml已冷却到50℃的基础液，混匀后立即倾注平板。

5.2.1.2.5HE（HektoenEnteric）琼脂：

称取牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂20g，加蒸馏水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，无需高压灭菌，冷却到50℃，立即倾注平板。

5.2.1.2.6三糖铁（TSI）琼脂：

5.2.1.2.7蛋白胨水、靛基质试剂：

5.2.1.2.8尿素琼脂（PH7.2）：

5.2.1.2.9氰化钾（KCN）培养基及其对照氰化钾培养基：

5.2.1.2.10赖氨酸脱羧酶试验培养基及其对照培养基：

5.2.1.2.11甘露醇及山梨醇培养基：

5.2.1.2.11邻硝基酚β-D半乳糖苷（ONPG）培养基：

5.2.1.3检验程序[4]

5.2.1.3.1沙门氏菌检验程序见图1.

5.2.1.3.2.操作步骤

5.2.1.3.2.1培养基的配制,按照1.2的部分配制。

5.2.1.3.2.2前增菌

称取25g样品放入盛有25mlBPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1~2min。

样品为液态，直接进行培养，于36℃±1℃培养8h~18h。

5.2.1.3.2.3选择性增菌

轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1ml，转种于10mlTTB培养基内；于42℃±1℃,18h~24h培养。

另取1ml,转种于10mlSC内，于36℃±1℃,18h~24h培养。

5.2.1.3.2.4选择性平板分离

分别用接种环取经TTB增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个HE琼脂平板。

同时，另取SC增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个HE琼脂平板。

于36℃±1℃分别培养18h~24h（HE琼脂平板）或40h~48h（BS琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落，各个平板上的菌落特征见表1

表1沙门氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征

选择性琼脂平板

沙门氏菌

BS琼脂

菌落为黑色有金色光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变

HE琼脂

蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色

5.2.1.3.2.5生化试验

5.2.1.3.2.5.1扩培典型或可以菌落

自选择性琼脂平板上挑取一个典型或可以菌落，营养琼脂平板，与36℃±1℃培养18h~24h，必要时可延长至48h。

得到纯培养。

5.2.1.3.2.5.2接种生化培养基

将营养琼脂平板上的纯培养物接种三糖铁琼脂，现在先在斜面划线，在于底层穿刺；接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基。

赖氨酸脱羧酶实验要同时接种试验管和对照管。

同时，可直接接种蛋白胨水（供作靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾（KCN）培养基、甘露醇和山梨醇试验。

所有试管于36℃±1℃培养18h~24h氰化钾必要时可延长至48h，将已挑菌落的平板储存于2℃~5℃或室温至少保留24h，以备必要时复查。

5.2.1.4.结果观察与判断

5.2.1.4.1通过TSI和赖氨酸脱羧酶试验进行初步判断，反应结果见表2

表2沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反

应结果：

三糖铁琼脂

赖氨酸脱羧酶试验培养基

初步判断

斜面

底层

产气

硫化氢

-

+

+（-）

+（-）

+

可疑沙门氏菌属

-

+

+（-）

+（-）

-

可疑沙门氏菌属

+

+

+（-）

+（-）

+

可疑沙门氏菌属

+

+

+/-

+/-

-

非沙门氏菌

注：

+阳性，-阴性；+（-）多数阳性，少数阴性；+/-阳性或阴性

表2说明，在三糖铁琼脂内斜面产酸，底层产酸，同时赖氨酸脱羧酶试验阴性的菌株可以排除。

其他的反应结果均有沙门氏菌属的可能，同时也有不是沙门氏菌属的可能。

注：

TSI结果判定方法：

斜面黄色为+，红色为-；底层黄色为+，红色为-；产气可以观察培养基内的气孔；硫化氢的判断是培养基转黑色为+，黄色为-，入试管地步全部为黑色可以判断底层为+。

赖氨酸脱羧酶试验试管为蓝绿色，对照变黄为阳性，试验管和对照管均变黄为阴性。

5.2.1.4.2通过TSI反应中的H2S、靛基质试验、尿素琼脂（pH7.2）、KCN实验结果，查表3将可疑反应分为A1、A2、A3。

表3沙门氏菌属生化反应初步鉴别表

反应序号

硫化氢（H2S）

靛基质

pH7.2尿素

氰化钾（KCN）

赖氨酸脱羧酶

A1

+

-

-

-

+

A2

+

+

-

-

+

A3

-

-

-

-

+/-

注：

+阳性；-阴性；+/-阳性或阴性

注：

靛基质试验在培养后加靛基质试剂2~3滴，立即观察，表面为红色为阳性，不变色为阴性；尿素实验结果为桃红色是阳性，淡橙红色是阴性；氰化钾浑浊，有菌生长为阳性，反之为阴性。

5.2.1.4.3反应系列号A1：

典型反应为沙门氏菌属。

如尿素、氰化钾和赖氨酸脱羧酶3项中有一项异常，按表4可判断为沙门氏菌属。

如2项异常为非沙门氏菌属。

表4沙门氏菌属生化反应初步鉴定表

pH7.2尿素

氰化钾（KCN）

赖氨酸脱羧酶

判定结果

-

-

-

甲型副伤寒沙门氏菌属（要求血清学鉴定结果）

-

+

+

沙门氏菌IV或V（要求符合本群生化特征）

+

-

+

沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果）

注：

+阳性；-阴性

5.2.1.4.4反应序号A2：

补做甘露醇和山梨醇实验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项实验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。

甘露醇和山梨醇实验结果为黄色是阳性，紫色是阴性。

5.2.1.4.5反应序号A3：

补做ONPG。

ONPG阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性，甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。

5.2.1.4.6API20E生化鉴定试剂盒

如选择API20E生化鉴定试剂盒可根据表2的初步判定结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用API生化鉴定试剂盒或VITEK全自动微生物鉴定系统进行鉴定。

5.2.1.4.6.1血清学鉴定

5.2.1.4.6.1.1抗原的准备

一般采用1.2%~1.5%琼脂培养物作为玻片凝集实验用的抗原。

本次试验采用扩大培养营养琼脂平皿上的菌落做实验。

5.2.1.4.6.1.2多价菌体抗原（O）鉴定

在玻片上画出两个约1cmX2cm的区域，挑取1环待测菌，各放1/2环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1滴多价菌体（O）抗血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为对照。

再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。

将玻片倾斜摇动混合1min，并对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。

5.2.1.5结果与分析

5.2.1.5.1样品在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果如下表

三糖铁琼脂

赖氨酸脱羧酶试验培养基

初步判断

斜面

底层

产气

硫化氢

-

+

+（-）

+（-）

+

可疑沙门氏菌属

结果显示有沙门氏菌属的可能，同时也有不是沙门氏菌属的可能。

5.2.1.5.2样品生化反应结果如下表

硫化氢（H2S）

靛基质

pH7.2尿素

氰化钾（KCN）

赖氨酸脱羧酶

+

+

-

-

+

结果符合序列A2，补做甘露醇和山梨醇实验。

结果显示，甘露醇和山梨醇实验结果为紫色，是阴性。

5.2.1.5.3血清学鉴定结果

经过多价菌体抗原（O）鉴定，样液没有凝集现象，结果是阴性。

5.2.1.6总结

5.2.2普通PCR检测方法

5.2.2.1试剂和材料

除另有规定外，所有试剂均采用分析纯。

5.2.2.1.1用于PCR的水要用DEPC水处理。

5.2.2.1.2DNA提取液：

主要成分是SDS,Tris,EDTA。

5.2.2.1.310×PCR缓冲液其中:

KCL500mmol/L;Tris.HCl（pH8.3）:

100mmol/L；明胶：

0.1%）

5.2.2.1.4PCR反应液：

含MgCl2的PCR缓冲液、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP、Taq酶、UNG酶。

5.2.2.1.5琼脂糖。

5.2.2.1.610×上样缓冲液：

含0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油水溶液。

5.2.2.1.750×TAE缓冲液。

称取484gTris，量取114.2mL冰醋酸，200mL0.5mol/LEDTA（pH:

8.0），溶于水中，定溶至2L。

分装后高压灭菌备用。

5.2.2.1.8DNA分子标记物（100bp～1000bp）。

5.2.2.1.9Eppendorf管和PCR反应管。

5.2.2.1.10沙门氏菌普通PCR检测试剂盒（试剂盒组成、功能及使用注意事项见附录A）。

5.2.2.1.11BAX®沙门氏菌的PCR检测试剂盒（Qualicon＃17710608，试剂盒组成见附录B），5±3℃放置。

5.2.2.2仪器和设备

5.2.2.2.1PCR仪。

5.2.2.2.2电泳装置。

5.2.2.2.3凝胶分析成像系统。

5.2.2.2.4PCR超净工作台。

5.2.2.2.5高速台式离心机（最高离心力12000g以上）,台式离心机（最高离心力2000g）。

5.2.2.2.6微量可调移液器（2μL、10μL、100μL、1000μL）和相应吸头。

5.2.2.2.7BAX®全自动病原菌检测系统（启动包）。

5.2.2.3检验程序

沙门氏菌PCR方法检验程序见图

5.2.2.4操作步骤

5.2.2.4.1样品制备、增菌培养和分离按照传统的标准方法进行，如GB/T4789.30，SN0170，ISO6579，FDA/BAMChapter5，USDA/FSISMLG4C.01等。

5.2.2.4.2细菌模板DNA的制备

5.2.2.4.2.1增菌液模板DNA的制备对于上述传统方法培养的增菌液，可直接取该增菌液1mL加到1.5mL无菌离心管中,8000r/min离心5min，尽量吸弃上清；加入50μL水或加入50μLDNA提取液（见附录A），混匀后沸水浴5min，12000r/min离心5min，取上清保存于-20℃备用以待检测。

-70℃可长期保存。

5.2.2.4.2.2可疑菌落模板DNA的制备对于5.2.2.4.2.1方法分离到的可疑菌落，可直接挑取可疑菌落，加入50μLDNA提取液，再按照5.2.2.4.2.1步骤制备模板DNA以待检测。

也可使用等效的商业化的DNA提取试剂盒并按其说明提取制备模板DNA。

5.2.2.4.3PCR扩增

5.2.2.4.3.1引物根据沙门氏菌属特有的靶序列invA设计一对特异性引物。

引物序列：

5’-gtgaaattatcgccacgttcgggcaa-3’；5’-tcatcgcaccgtcaaaggaacc-3’扩增片断长度：

284bp。

5.2.2.4.3.1阴性对照、阳性对照设置阴性对照设为PCR反应的空白对照（以水代替DNA模板）；阳性对照采用含有检测序列的DNA（或质粒）作为PCR反应的模板。

5.2.2.4.3.2PCR反应体系普通PCR反应体系见表

试剂

贮备液浓度

25μL反应体系中加样体积（μL）

10×PCR缓冲液

—

2.5

MgCL2

25mM

3.0

dNTPs（含dUTP）

各2.5mmol/L

1.0

NG酶

1U/μL

0.06

上游引物

20pmol/μL

1.0

下游引物

1.0

Taq酶

5U/μL

0.5

DNA模板

—

2.0

双蒸水

—

补至25

注：

1.反应体系种各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。

2.每个反应体系应设置两个平行反应

5.2.2.4.3.3PCR反应参数95℃预变性5min；95℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s,35个循环；72℃延伸5min。

4℃保存。

注：

PCR反应参数可根据基因的扩增仪型号的不同进行适当的调整。

9.3.5PCR扩增产物的电泳检测用电泳缓冲液（1×TAE）制备1.8％～2％琼脂糖凝胶（55～60℃时加入溴化乙锭至终浓度为0.5μg/mL，也可在电泳后进行染色）。

取8～15μLPCR扩增产物，分别和2μL上样缓冲液混合，进行点样。

用DNA分子量标记物做参照。

3～5V/cm恒压电泳，电泳20～40min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。

5.2.2.5结果判定和报告

在阴性对照未出现条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带条件下，如待测样品未出现284bp大小的扩增条带，则可报告该样品检验结果为阴性可以出具未检出沙门氏菌的报告；如待测样品出现284bp大小扩增条带则可判定该样品结果为假定阳性，则回到传统的检测步骤，进一步应按传统的沙门氏菌标准检测方法进行确认，最终结果以传统的方法结果为准。

六、总结

用传统方法检测，用各种方法对沙门氏菌进行排查，依次排出。

此方法结果精确，但耗费时间长。

标准PCR检测方法实验简单，但是若最终结果为阳性，则必需参照传统的沙门氏菌标准检测方法进行确认，最终结果以传统的方法结果为准。

致谢

本篇论文能够顺利完成，首先要感谢的是我的学校能够提供一个平台，让我图书馆和相关网站查阅资料。

其次是我的指导老师，在休息时间对我的论文作指导。

也感谢一起陪伴我的同学们。

参考文献

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