生化实验技术与方法.docx
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生化实验技术与方法
实验一糖的薄层层析
一实验目的：
（1）熟悉硅胶H薄板的制备过程与方法；
（2）掌握薄层层析的原理以及利用薄层层析对糖类进行定性分析。
二实验原理：
层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。
按操作形式不同可将层析法分为3种类型：
柱层析，将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离；纸层析，用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的；薄层层析，将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。
按机理不同，可分为：
吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析。
薄层层析是一种微量而快速的层析方法。
该法是把吸附剂或支持剂涂布在玻璃板上成为一薄层，将要分析的样品滴加到薄层上，然后用合适的溶剂进行展开，使样品各个成分分离，然后进行定性鉴定和定量测定。
根据原理的不同，薄层层析通常有4种类型：
吸附薄层层析、分配薄层层析、离子交换薄层层析和薄层电泳。
薄层层析兼有柱层析和纸层析的优点，操作方便，设备简单，展开时间短，灵敏度高，还可在支持物中加入荧光染料有助于鉴别。
本次实验是以硅胶H为吸附剂的薄层层析。
三实验用品及器材：
试剂：
硅胶H、CMC溶液、鼠李糖、葡萄糖、两种糖混合液、展层溶剂（乙酸乙酯：
甲醇：
乙酸：
水=12：
3：
3：
2（体积比）、显色剂（苯胺-二苯胺-磷酸试剂）；
仪器：
薄板、烘箱、微量注射器、层析缸。
四实验步骤及结果：
（1）硅胶H薄板的制备
称取1.2g硅胶H放入事先准备好的研钵中，缓缓加入4.0ml0.5%CMC溶液并研磨，以赶出硅胶当中的气泡，研磨数分钟后，倒在预先准备好的玻璃板上，用手拿着玻板的一角轻轻震荡，使浆液均匀铺开（注意胶一定要均匀），放在水平台上，带水分蒸发后，置105℃烘箱30min。
（2）板的处理
薄板的活化：
将制备好的胶板放置与105℃烘箱中30min进行活化，活化后放在烘箱中慢慢冷却。
薄板的刮分：
把活化后的薄板放的上部刮成一个扇形，可以使样品展开后图谱呈弧形带状，使Rf值相近的化合物也能清楚地分开。
（3）点样
样品为鼠李糖和葡萄糖的混合溶液，点样量为10μL，为了使样品在点样过程中不至于太扩散，点样时不能一次性挤出微量注射器中的混合溶液，要小心的多点几次，每次5μL左右，等上一次的干了，在点下一次，注意微量注射器的针头不要扎破硅胶。
（4）展层
展层溶剂为新鲜配制的乙酸乙酯：
甲醇：
乙酸：
水=12：
3：
3：
2（体积比）混合液，点样完毕后将胶板放入层析缸中，室温展开。
待展开剂前沿走至距点样位置10cm时，将其取出，用风机吹干。
（5）显色
在通风橱内将展层好的薄板喷上适量的显色剂（苯胺-二苯胺-磷酸），放入烘箱中烘干。
（6）观察结果
样品距原点距离
前沿距原点距离
Rf值
葡萄糖
3.9cm
9.6cm
0.41
鼠李糖
4.6cm
8.1cm
0.57
混合糖
3.9cm和5.3cm
8.9cm
0.44和0.60
预期实验结果图实验结果图
五结果分析
葡萄糖与混合糖1的Rf值有一定的偏差，正常情况下葡萄糖Rf值为0.28，实验结果Rf值为0.41，造成实验结果有偏差的的原因可能是：
1、薄层层析板制备时胶板的厚度不一致，层析过程中受到阻力；
2、活化后在操作的过程中可能有一个胶板受潮，导致毛细孔受到一定的影响，吸附作用受到影响；
3、点样时不均匀，点样点的大小有差别，而造成结果误差；
4、除此之外，层析时展层的时间不同，也可能会造成一定的误差。
鼠李糖与混合糖2的Rf值比较相近，结果令人十分满意。
5、显色时显色剂喷洒不均匀，局部喷洒太多，用力过大，导致部分图谱不成弧度，影响测量。
注意事项：
（1）制备硅胶板时一点要一边研磨，一边加入CMC溶液，以便赶紧硅胶中的气泡。
（2）涂板完毕用手拿着玻板的一个角落，轻轻震荡使硅胶铺满整个玻板。
（3）薄板活化后冷却的速度不能过快。
（4）点样点的直径小于2mm，点样要少量多次，吹风机风力不能过大。
（5）展层试剂不能倒太多，千万不能碰到点样点；胶板的位置一定要放正。
（6）显色剂喷洒要均匀，不能太多，安全操作。
实验二苯丙氨酸解氨酶的提取纯化、活力及蛋白质分子量测定
苯丙氨酸解氨酶的提取纯化
一实验目的
学习掌握植物体内酶的提取，分离纯化
二实验原理
苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine：
ammonialyase，简称PAL；EC4.3.1.5）是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶，与一些重要的次生物质如木质素、异黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切有关，在植物正常生长发育和抵御病菌侵害过程中起重要作用。
本次实验是以茶花花蕊为原料采用分步盐析、透析脱盐、离子交换等方法得到苯丙氨酸解氨酶。
离子交换层析法主要是利用溶液中各种带电离子与离子交换剂之间的结合力的差异进行的分离方法。
各种氨基酸分子的等电点不同，在同一pH时所带电荷不同，与离子交换树脂的结合力有差异，因此可依据结合力从小到大的顺序被洗脱液洗脱下来，达到分离的效果。
离子交换剂为固定相。
带电离子与离子交换剂之间的作用力主要是静电力，它们的结合是可逆的。
离子交换剂由基质（惰性不溶性载体）、电荷基团（功能基团）和反离子（平衡离子）三部分组成。
离子交换剂的种类按载体种类不同可分为离子交换树脂（主要有聚苯乙烯树脂）、离子交换纤维素和离子交换凝胶，按功能基团带电荷性质不同可分为阳离子交换剂，功能基团带负电荷（平衡离子带正电荷），与阳离子交换；阴离子交换剂，功能基团带正电荷（平衡离子带负电荷），与阴离子交换。
聚苯乙烯-苯二乙烯是由苯乙烯（单体）和苯二乙烯（交联剂）进行聚合和交联反应生成的具有网状结构的高聚物。
它是离子交换树脂的基质，带电基团是通过后来的反应引入基质的，树脂一般都制成球形颗粒。
从交换剂上洗脱目的物的方法有两种：
1.调节洗脱液的pH，使目的物在此pH下失去电荷甚至带相反电荷。
2.用高浓度的同性离子，将目的离子取代下来。
三实验试剂及器材
试剂：
酶提取液（0.1mol/L硼酸-硼砂缓冲液，含1mmol/LEDTA、20mmol/Lβ-巯基乙醇）、固体硫酸铵、0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH8.0，含0.5mmol/LEDTA，2.5%甘油，20mmol/Lβ-巯基乙醇）、EDAE纤维素52、考马斯亮蓝、脱色液（冰醋酸：
蒸馏水：
甲醇=75：
875：
50）。
仪器：
高速冷冻离心机、恒温水浴、电子天平、柱层析系统、透析袋、电泳槽。
四实验步骤
1、酶液提取
（1）取茶花花蕊2g，剪成小片，加入5倍体积的酶提取液，于冰浴上用研钵研磨。
（2）将已匀浆的酶液转入离心管，4000rpm冷冻离心30min。
（3）取离心后的上清液（酶粗提液），量出其体积，留样0.5mL，放置冰浴中备用。
2、硫酸铵分级沉淀酶蛋白
（1）根据实际体积、温度和硫酸铵饱和度用量表，算出达到38%饱和度应加入酶粗提液中的硫酸铵量，并称硫酸铵。
（240g/L）
（2）将酶液倒入烧杯内，边缓慢搅拌边缓慢加入称好的固体硫酸铵，待全部加完后，再缓慢搅拌10min；然后于9000r离心15min，保留上清液于烧杯内。
（3）根据硫酸铵饱和度用量表，算出从38%到75%饱和度所需硫酸铵用量。
（222g/L）
（4）按上述
（2）步同法处理，离心后，弃去上清液，保留沉淀。
（5）将沉淀溶于2ml酶抽提液中,留样0.5ml。
3、透析脱盐
从酶粗提液中吸出0.5ml，作活力测定用，余下酶液装入透析袋，放入低盐溶液中透析过夜。
4、离子交换层析-DEAE纤维素
（1）称取DEAE纤维素52干粉1~1.5g，加20ml的0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH8.0）浸泡4h以上（或浸泡过夜）。
（2）装柱：
把预处理的DEAE纤维素52装柱。
装柱完成后，用2~3个床体积的0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH8.0）洗脱平衡该柱。
（3）上样：
把所得的酶洗脱液小心地注入柱床面中央，上样结束后，在床面以上小心地加入0.02mol/L磷酸盐缓冲液2~3cm厚液层。
注意上样开始就收集流出液。
（4）洗柱：
用A液（0.01mol/LTris-HCl（pH8.8））及B液（含1mol/LNaCl的0.01mol/LTris-HCl（pH8.8））洗柱，流速为1mL/min，3ml/管,紫外检测仪检测，取A280值高的管中洗脱液测其PAL的活力；合并主要含有PAL活力的各管洗脱液，并量出其体积（ml）。
苯丙氨酸解氨酶的活力测定
一实验目的
学习苯丙氨酸解氨酶活力测定方法。
二实验原理
PAL催化L-苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸，反式肉桂酸在290nm处有最大吸收值。
若酶的加入量适当，A290升高的速率可在几小时内保持不变，因此通过测定A290升高的速率以测定PAL活力。
规定1h内A290增加0.01为PAL的一个活力单位。
三实验步骤
取试管两支，按表中所述，从上到下加入试剂（0号为调零管，1号为测定管），（单位：
mL）。
试剂类型
调零管（0号）
测定管（1号）
pH8.7的0.1mol/L硼酸缓冲液
3.5
3.5
0.2mol/LL-苯丙氨酸溶液
1
1
6mol/L盐酸
0.2
0
样品（酶）溶液
缓冲液0.5
0.5
将各管混匀，放入40℃恒温水浴保温1h（准确计时），到时在待测管加0.2mL2mol/LHCl终止反应。
紫外分光光度于波长290nm处测定1号管的A290。
蛋白质含量测定（考马斯亮蓝染色法）
取酶液0.1mL，用蒸馏水稀释至5mL。
取试管10支，按下表加入各溶液：
试管编号
0
1
2
3
4
5
6
7
8
标准蛋白质溶液（mL）100ug/mL
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0
0
0
稀释酶液（mL）
0
0
0
0
0
0
1.0
1.0
1.0
蒸馏水（mL）
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
1.0
1.0
1.0
考马斯亮蓝（mL）
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
将上述各管混匀，静置2min，测定各管的A595。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定蛋白质分子量
一实验目的
掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理和方法
二实验原理
SDS－PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。
电泳迁移率与颗粒的电荷、形状、大小（分子量）有关，如电荷、形状都一样，则电泳迁移率只与分子量有关。
SDS-PAGE是在PAG系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）。
SDS的作用有：
1.能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂（巯基乙醇）能使二硫键断裂，使蛋白质完全变性。
2.能与变性的蛋白质按比例结合，形成SDS-蛋白质复合物。
SDS-蛋白质复合物的特点：
1.由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异。
2.复合物都是椭圆棒状，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的形状差异。
因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
测定各条带的相对迁移率，根据已知蛋白质分子量和它们的相对迁移率，以相对迁移率为横坐标，lgMr为纵坐标作标准曲线。
根据未知蛋白质的相对迁移率从标准曲线上查出它们的lgMr，再换算成蛋白质分子量．
在一定范围内，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：
logMW=K-bX，式中：
MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数。
若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
操作如同PAGE。
样品：
蛋白质要完全变性。
蛋白质+SDS+巯基乙醇100℃2-5分钟
标准蛋白市场有售，被测蛋白质的分子量应在标准蛋白分子量以内。
染色：
考马氏亮蓝、银染色
该法测定蛋白质分子量的局限性：
1.蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如胰凝乳蛋白酶）组成的，测定时只是它们的亚基或单条肽链的MW。
2.电荷异常的蛋白质（如组蛋白，带大量正电荷）
3.结构异常，不于分子量呈线性关系（如胶原蛋白）
4.带有较大辅基的蛋白质（如糖蛋白）
三实验步骤
（1）胶的制备
编号
溶液名称
12%分离胶
4%浓缩胶
1
30%Acr-0.8%Bis
2.0mL
0.2mL
2
pH8.8Tris-HCl
1.25mL
-
3
pH6.8Tris-HCl
-
0.375mL
4
10%SDS
50uL
15uL
5
TEMED
5uL
5uL
6
10%AP
50uL
15Ul
7
H2O
1.65uL
0.9Ml
总体积
约5mL
约1.5mL
（2）样品的处理：
按4:
1的比例向标准蛋白质或待测样品中加入样品溶解液（小试管），充分溶解后，置沸水浴3min，取出冷至室温。
（3）加样：
20μl，标准蛋白（M）全加。
（4）电泳：
点样端负极，恒压：
开始80V，待样品进入分离胶后100V。
电极缓冲液：
pH8.3Tris–Gly。
（5）染色：
脱色考马斯亮兰R-250，1h或过夜。
（6）脱色：
先用蒸馏水冲洗凝胶，再用脱色液（冰醋酸：
蒸馏水：
甲醇=75：
875：
50）脱色1h。
（7）测定各条带的相对迁移率，将已知分子量的标准蛋白质的相对迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，根据未知蛋白质的电泳相对迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
标准蛋白质
分子量
兔磷酸化酶B
97400
牛血清白蛋白
66200
兔肌动蛋白
43000
牛碳酸酐酶
31000
胰蛋白酶抑制剂
20100
鸡蛋清溶菌酶
14400
五、实验结果
1、苯丙氨酸解氨酶的活力测定结果：
其中1号管为酶粗提液，2号管为硫酸铵分级沉淀后的酶液，3号管为透析脱盐后的酶液，离子交换层析后的酶液没有得到。
试管编号
1
2
3
A290
0.0744
0.0319
0.0283
稀释倍数
2
5
10
酶活（U）
14.84
15.95
28.3
注：
酶活计算公式：
酶活=A290×稀释倍数/（0.1×0.1）
2、蛋白质含量测定结果：
试管
编号
0
1
2
3
4
5
6
7
8
A595
0
0.123
0.2
0.25
0.298
0.346
0.386
0.244
0.266
曲线上对应的蛋白含量（ug）
0
10
20
30
40
50
52.697
31.182
34.515
体积
/
/
/
/
/
/
4
3.5
344
蛋白含量（mg）
/
/
/
/
/
/
4.216
1.091
0.519
注：
其中1-5号管为标准曲线，6号管为酶粗提液，7号管为硫酸铵分级沉淀后的酶液，8号管为透析脱盐后的酶液，离子交换层析后的酶液未得到。
蛋白质标准曲线及各酶液在标准曲线上所得的浓度
3、PAL总活力、比活力、蛋白质含量的计算结果：
步骤
体积
（mL）
蛋白质含量（mg）
总活力
（m）
比活力
（m/mgprotein）
粗提
4
4.216
59.52
14.118
硫酸铵沉淀
3.5
1.091
55.83
51.173
透析
2
0.519
56.6
109.056
注：
PAL比活力计算：
酶的比活力=酶液中PAL总活力单位数/酶液中蛋白质mg数
4、SDS-PAGE测定蛋白质分子量结果
结果如下图所示，1号为Mark条带，2号为酶粗提液条带，3号为硫酸铵分级沉淀后的酶液条带，4号为透析脱盐后的酶液条带。
可以看出有Mark条带，但是条带不清晰，酶粗提液没有条带，并且有拖带现象，含杂质多，硫酸铵分级沉淀后的酶液条带不清晰，相对于酶粗提液而言含杂质少，透析脱盐后的酶液有条带，且较为清晰。
六、讨论
本次实验结果不够理想，蛋白质含量、总活力、比活力的变化都比较杂乱，没有规律。
理想状态下应该是蛋白质含量下降明显，总活力下降缓慢，比活力不断升高。
总结原因可能有以下几个方面：
做实验操之过急，如加硫酸铵时追求速度，搅拌过于剧烈等；对实验过程不熟悉，思维过乱；实验操作不规范等。
对于SDS聚丙烯酰胺凝点电泳来说从标准蛋白的条带来看，在凝胶制备以及电泳情况来看，出现较多问题。
标准蛋白的条带不清晰，而粗提液、硫酸铵分级沉淀后的酶液和透析后跑出条带杂质含量大，并且是发现酶含量过低造成。
此外，柱层析并未得到酶液，可能是实验过程中操作存在问题，操作过于急忙，并且分级洗脱时一开始B液为发生流动，仅仅是在用A也进行洗脱，这也是没有得到酶液可能存在的原因。
另外，从胶来看，也可能是凝胶制备的不均匀，或者是脱色的时间没有控制好，脱色不够彻底。
注意事项：
（1）测定酶活力及蛋白质含量时要注意稀释；
（2）硫酸铵沉淀操作时要遵循“细、慢、搅”的原则；
（3）透析时透析袋一定要扎紧；
（4）不同的凝胶浓度适用于不同的Mr范围，如在5%的凝胶中，Mr25000-200000的蛋白质，其Mr的对数与迁移率呈直线关系；在10%的凝胶中，10000-70000Mr蛋白质呈直线关系；在15%的凝胶中，10000-50000Mr的蛋白质呈直线关系；3.33%的凝胶可用于Mr更高的蛋白质。
要注意选择。
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