高效液相色谱仪操作指导书.docx

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高效液相色谱仪操作指导书

高效液相色谱仪操作指导书

.y.h_{t_]_c_V_D-R

v_e0

1．检测环境分析化学博客"{i.{_Q_[0p7y_M0_;Y.v9V

1.1仪器安置房间应清洁无尘，无易燃易爆和腐蚀性气体，室内排风良好。

分析化学博客_qE:

QV1R_\+i_b

1.2仪器工作台应平稳，周围无强烈机械振动和电磁干扰，仪器有良好接地。

_W{8V_P-x

^.i_p6W9m01.3环境温度为10℃～30℃，8小时内室温波动不超过±3℃（使用RI检测器时温度变化不超过±2℃或用恒温水浴控制检测器），相对湿度低于70％。

分析化学博客+~J_E*v4~X6r&t|_L_Cz

!

Z_T_k8F_c0Y_N_p7p_u4p02．样品条件

_|&f0O0@_h

a4y

A_`02.1待测样品必须能溶解于水或其它有机溶剂中。

3M&M;v#d1v:

y9x_s_X1o_b02.2根据试样物理化学特性，应注意试样的保存温度，吸潮挥发及光照等性能，并采取相应有效措施保存。

6s8~_m,`-E02.3对剧毒试样，应专柜保管，防止发生意外事故。

7s:

eB_k&D%J_W（R_I#L02.4要求定量检测的试样，必须附有法定的检测方法或规程。

否则按照科研试样处理。

a_u!

Y_es_AeZ_e02.5定量检测的试样不能少于100毫克的样品量。

+U_c_d_o_m_x_p0n_I$q_F5Q;aG6e03．检测项目分析化学博客|6i$yH_q%m

3.1检测项目包括定性（对已知物的保留时间）及定量分析两部分。

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{!

c03.2定量检测按法定检测方法或规程执行，科研试样按用户要求或协商的方法实施。

分析化学博客z3Z/T6w）x}&C_a

3.3有关定量检测的标准物质，一般由用户提供，本测定结果只对样品负责，若用户要求对产品负责，用户必须提供现场取样的方便。

2G）~'dz）t_J0分析化学博客1S,S3W_D-M74．样品检测前检查分析化学博客!

U_y7\_^"f9n

4.1检查仪器室的环境温度，湿度及电源。

检查仪器各部件的运行状态，并记录于原始记录表中。

U_P'o%S_K_l04.2检查化学试剂的规格标准，流动相的组成，浓度等是否与分析方法一致。

_g^_C_Y8y_x$@v_C_U_x2S04.3检查样品在保存时是否有沉淀，蒸发，变色等变质现象，若有应重新提取原来样品进行测试。

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PS_T0_D_ZV2O_O1b5．样品检测

!

q_O;X_`+V4z05.1按照法定方法选定色谱柱，流动相及检测器。

待仪器稳定后，检查仪器噪音及基线，待达标后才能开始作样品测试。

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u_u0n_J_a

a_H_p05.2检查色谱柱的分离效能，其塔板数及峰对称性应符合分析方法的规定。

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5.3严格按照指定的分析方法配制标准溶液及试样浓度，制取标准物质校正曲线或单点校正系数，其分析误差必须满足方法要求。

分析化学博客8\/[0|\%D2};G3v_{

5.4若样品溶剂的纯度不能完全满足方法规定时，可以先征得用户同意后作适当修改，但必须进行空白溶剂测定，并在色谱图上注明溶剂峰，而且不应存在对待测组分峰的干扰。

分析化学博客1va_^_U_N

5.5标准及样品溶液在注入色谱柱前必须检查其清洁程度，且与流动相混合时不应出现沉淀，对易挥发及怕光照的样品应采用密闭避光的相应措施。

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C

5.6按照分析方法规定的计算方法，设定数据采集程序，选定峰高或峰面积计算，按照峰面积，归一化内标，外标采集数据。

_d_v_\_Z.Y_T_p/M05.7严格按照法定计量单位标示分析过程及结果的有关数据。

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X_U_?

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5.8分析误差必须达到方法的要求。

一般要求为定性（保留时间）测量重复性误差小于或等于1.5％，定量测量重复性误差小于或等于3.0％。

'u__F3v_x{&C8W_I_i0分析化学博客J%u_}_^_j（~*6．样品测试过程中异常现象处理

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h_y1[_D06.1原样品或配制的样品溶液发生沉淀，挥发，变质等异常现象时，应重新取样或重新配制溶液.分析化学博客l_|$u{_F&I_gy

6.2分析重复性误差大于规定值时，应检查仪器测定条件。

待条件复原后，重新配制样品，再次进行测定。

分析化学博客$B+r.@_X+`_H2M）X_F）a;f

6.3在检测过程中发生停电时，应按仪器操作规程依次关机，且原检测结果无效。

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eK&[3u_E_|

6.4检测仪器设备受损坏或发生人身伤亡事故时，应保护现场，及时向技术负责人报告，待妥善处理后再进行检测。

分析化学博客;w-]^1S1w_B+h

7．检测样品后检查

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z_E__B*D07.1实验室的环境条件波动范围应符合规定，否则检测结果无效。

"O&wz0L_u4rw）{07.2仪器运行条件应符合测定方法的要求，否则检测结果无效。

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g_p_H*k_D__07.3样品制备液发生沉淀，挥发或其它异变时，检测结果为无效。

分析化学博客#w_D_R-`_F_u_g

分析化学博客1V_{Nu_QDd8．测定结果报告分析化学博客]_N7b$ut_N_U

c$s_z

8.1按照测定方法要求计算结果，定量分析应标出分析重复性误差。

分析化学博客}2d_Y9G_C_e_L

8.2测定数据及计算结果必须经过校核。

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;^'l_U_J_D'F08.3原始记录，测定数据及计算结果记录必须整齐清洁，符合规范，且一并送交中心业务办公室审核。

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为了保证仪器随时处于良好状态，在两次仪器检定之间至少对仪器进行一次期间检查。

期间检查的主要参数包括：

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（1）流量准确度On/B5O;T.C0

（2）基线噪声分析化学博客_P_d:

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（3）基线漂移分析化学博客_L1N"`$_6d-D

Waters高效液相色谱仪操作规程分析化学博客_S&__q6N_^u4H~

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o_B/p_M0

1、打开不间断电源市电输入开关，5秒钟后打开电源输出开关，待电源正常后，按电源主机市电蓄电转换开关3秒，将电源由市电供电转为电源蓄电池供电。

2、检查1～4号瓶，准备好实验所用流动相，并预先用超声脱气至少20分钟，保证实验过程中各液体足用，如不足请依照实验和仪器要求配制各种流动相，并用0.45微米相应膜过滤后使用。

检查色谱柱看是否符合实验要求，否则，仔细更换。

3、接通仪器电源前应检查仪器开关是否处于正常关机状态，否则应先将开关关上再接通电源。

4、打开液相色谱600泵电源开关，自动进样器电源开关，检查仪器自检情况，根据实验要求打开486检测器或410示差检测器电源开关并观察其自检情况。

5、打开在线脱气机电源开关，600泵抽气转换开关，旋松抽液口旋钮用针管吸取2～3管流动相液体，排出管道中的气泡。

6、关闭抽气转换开关及抽气旋钮。

7、仪器各模块自检通过后，打开计算机，点击开色谱工作站，并登录，根据实验要求建立仪器方法，设定实验方法，包括柱温、流速、柱最大压力、检测器参数、温度参数等。

8、将处理好的样品注入样品杯，用杯帽或封口膜封好杯口，将样品顺序放入样品盘中。

9、调入编辑好的仪器方法及实验方法，观察联机情况，稳定一小时后开始实验。

10、样品全部分析结束后，手动输入清洗程序，洗自动进样器2～3次。

11、实验结束后，根据色谱柱类型用相应的流动相清洗柱30分钟，若使用过缓冲液，还要用去离子水清洗管道泵头，以防堵塞。

12、停泵时，注意流速应逐渐降低，不能从工作状态一下降低为零。

13、退出色谱工作站，关闭各模块电源开关，清洁实验工作面。

14、关闭仪器总电源开关，不间断电源开关，结束实验,填写仪器使用记录。

注意事项：

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1.使用仪器前必须仔细阅读仪器使用说明书。

2.研究生必须在导师或熟悉仪器使用人员的指导下操作仪器。

3.按仪器使用要求准备测试样品，不得测试不符合要求的样品。

4.小心操作，防止样品污染和腐蚀仪器。

5.仪器使用后按操作程序，切断电源，清理擦拭仪器，盖上仪器罩，研究生使用仪器应由管理人员对仪器进行检查验收。

6.在操作时发生故障应停止使用，并及时通知管理人员。

wters600型高效能液相色谱仪操作步骤分析化学博客X5_1k8[j9Y5{h2Q1V_w

高效液相色谱仪的主要部件输液泵、进样阀、检测器和色谱处理机在电路上相互独立，各个部件的启动的先后顺序并无特别要求，各个部件的操作如下：

准备：

溶剂脱气

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输液泵：

N'r_^_f6i'i?

01、启动  

l_ND_z_b,V_~0通电前，进入direct,设置流动相流速,设置流动相组成。

每次设置后按enter.此时泵开始工作，可以听到泵工作的声音。

8k%O_[0L_E_[%D_Y02、暂停和关闭分析化学博客B-Aa-{]!

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在工作当中，如要暂停或停止泵的工作，只要把flowrate设为0泵即停止工作。

_[`_t_A&j_M5z*u2}_N0B:

检测器：

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I

接通电源，由于检测器需要一定时间后才达到稳定状态，可在其它部件未启动前先启动。

达到稳定后，设置检测波长，然后enter。

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I_N（z_Fz0但流动相洗脱到无信号出现，基线平稳，可以开始实验。

在输液泵把分析时所用的流动相压至柱子进行洗脱直到检测器检测不到组分时，才可以第二次进样分析。

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C:

色谱处理机：

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打开电脑，进入色谱处理系统。

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设置方法－面积归一化法。

当柱子洗脱结束，检测器稳定，样品被注射到系统中时，按下“启动”，色谱工作站开始收集数据。

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当所有组份从柱子中流出，按下“停止”键。

工作站停止收集数据。

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然后进入数据分析，打印分析结果。

结束实验：

按下stopflow，停止泵工作。

关闭检测器电源。

关闭泵系统电源。

高效液相色谱仪操作步骤分析化学博客3^_N_h'l（R7p

高效液相色谱仪操作步骤：

1）．过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。

3）．打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。

8）．进样和进样后操作。

9）．关机时，先关计算机，再关液相色谱。

...分析化学博客v_z.Z!

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高效液相色谱仪操作步骤：

;A%P+M2|.Rg_P_p__01）． 过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。

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2）． 对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。

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3）． 打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。

分析化学博客4L.W_M;A*im（l

4）． 进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。

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5）． 有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。

冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽龋冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10 ml/min。

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f'~06）． 调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。

点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。

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7）． 设计走样方法。

点击file，选取select user and methods，可以选取现有的各种走样方法。

若需建立一个新的方法，点击new method。

选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。

选完后，点击protocol。

一个完整的走样方法需要包括：

a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。

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8）． 进样和进样后操作。

选定走样方法，点击start。

进样，所有的样品均需过滤。

方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。

全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。

-S_Oi（n%\z_}09）． 关机时，先关计算机，再关液相色谱。

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10）． 填写登记本，由负责人签字。

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注意事项：

_@）]0P7R%yB%P_l_u_l01）． 流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。

脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。

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C'n_x_wu3]02）． 柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。

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3）． 所有过柱子的液体均需严格的过滤。

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4）． 压力不能太大，最好不要超过2000 i。

Waters600E-2487高效液相色谱系统操作规程

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s_`01.目的分析化学博客Z$n_l_jx8i#~*Z（j*z

规范Waters高效液相色谱系统的使用和维护。

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R5A'T,h3o1S02.范围

1B9l__s-A1k0本规程适用于Waters高效液相色谱系统的使用和维护。

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3.职责

_G_z$pjO0质检室仪器分析员负责Waters高效液相色谱系统的日常使用和维护。

分析化学博客Z8B_C1}_Lo_s_V/e

4.系统组成分析化学博客_g_d_r_{

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本系统由Waters600E多溶剂输送系统（有梯度控制器的高压输液泵）、Waters在线脱气机、Rheodyne7725i手动进样阀、Waters2487双通道紫外检测器、Millennium32色谱工作站/电脑等组成，另外还包括打印机、UPS和通风柜等辅助设备。

9O_G_g_V_k_j_uQO05.程序分析化学博客_H:

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5.1.准备

_m_H_c,C+R_Q_B_N05.1.1.使用前应根据待检样品的检验方法准备所需的流动相（应足够；流动相必须用0.45μm滤膜过滤）、样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），更换合适的色谱柱（柱进出口位置应与流动相流向一致）和定量环。

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1F_g8d%w_QW_Y;X05.1.2.通电前应检查仪器设备之间的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。

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5.2.开机和泵操作

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05.2.1.开机分析化学博客`V_b_zK&O_X_`2g

5.2.1.1.接通UPS的电源，依次打开断电保护器、脱气机、600E泵、2487检测器，待检测器自检结束显示测量状态时，打开打印机、电脑显示器、主机。

w_p8E_q*x05.2.1.2.打开Millennium32软件，按「Login...」，输入用户名和密码，按「OK」注册进入系统主界面。

在Project档内选择所需的项目，右击『RunSamples』图标，选择色谱系统“600_2487”后打开QuickSet窗口。

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5.2.2.更换溶剂

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R05.2.2.1.打开600E泵后，转动进口集合管阀手柄（以下简称手柄）至RUN位置；

_[m0IZ_]X;b4}05.2.2.2.将一塑料烧杯放在参照阀出口管下以收集分流的溶剂，向右打开参照阀（断开柱和进样器）；

_H*?

f（H_v9_$T_y05.2.2.3.按［Direct］键使其显示直接控制屏幕，设流速为1ml/min（梯度配比阀在0ml/min时不工作）；

5J_lE_|'s_m&dW05.2.2.4.选择欲使用的某一溶剂通道，设其比例为100%，其它为0%；

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J9I_c05.2.2.5.将输液管从原有溶剂瓶中取出，放入一干净的空瓶中；分析化学博客C_A/?

+j_X-{_r_F_k8Y

5.2.2.6.逆时钟转动手柄至DRAW位置，用启动注射器从进口集合管阀的接口抽出约2ml溶剂；

*X.V]*i4I_E05.2.2.7.再将输液管放入新溶剂瓶内，继续抽吸直到新溶剂出来并无气泡为止；分析化学博客+{_ew_q_H#P;e

5.2.2.8.转动手柄至RUN位置，将启动注射器取下并排掉筒内的溶剂。

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5.2.2.9.重复5.2.2.4.~5.2.2.8.直至所有即将使用的溶剂更换完毕。

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5.2.3.排气泡

_x_nW_D_Pu_v_d05.2.3.1.打开参照阀，换流动相为100%超纯水，设流速为10ml/min（注意：

确认参照阀是打开的，否则可能损坏安装好的柱）；分析化学博客_^9T8@_h_j

5.2.3.2.转动进口集合管阀手柄至DRAW位置，用启动注射器抽出约10ml水；

（b_r2@4X3@_s_Z9r1m05.2.3.3.顺时钟转动手柄至INJ位置，缓慢用力使水通过泵头从参照阀出口管排出（注意不要将气泡注入泵中）；

}&B"n_`_z%}9^;}

A4B+V05.2.3.4.按［Stopflow］屏幕键停泵，关上参照阀。

c7v_N_S*B-E05.2.3.5.如按以上方法不能排尽气泡，从柱入口处拆下泵出口管，用塑料管连接至塑料烧杯中，设流速为10ml/min，冲洗2~5min（或更长时间）后停泵，重新接上柱。

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]9p_Z,i*R_Z_M_a05.3.平衡系统（分两种情况进行）分析化学博客X.C9n

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5.3.1.等度模式

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VO3I$H）s%`05.3.1.1.每次以0.1ml/min的增量加大流速至1ml/min，以超纯水冲洗系统10min。

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5.3.1.2.检查管路连接、柱接口及泵头处是否漏液，如漏液应予以排除。

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5.3.1.3.观察泵控制屏幕上的压力值，压力波动应在平均值的5~10%以内。

如超出此范围，可初步判断为柱前管路仍有气泡，重复5.2.3.下的步骤。

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j_E6K,bd05.3.1.4.压力波动平稳后，换检验方法规定的流动相比例冲洗系统。

在检查基线稳定性前，让最少5~6倍柱体积的流动相通过系统。

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A@_k6c!

\_Q-U_q05.3.1.5.在QuickSet窗口下的InstrumentMethod档内选择所需的仪器方法，按「Monitor」（此后泵由软件控制），观察基线和压力变化。

如果冲洗至基线漂移<10-3Au/min，噪声为10-4Au数量级，且压力平稳时，可认为系统已达到平衡状态，可以进样。

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5.3.1.6.按「Abort」图标（左上第五个），停止监视基线。

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5.3.2.梯度模式分析化学博客U_f_e8t5t'at7K_U_x,h

5.3.2.1.按检验方法规定的条件冲洗平衡系统，并注意压力波动变化和排气泡。

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e"n05.3.2.2.在进样前运行1~2次空白梯度。

_K9n;z0c）["h_r_U_]05.4.进样分析化学博客_O_z_z3q_p/^_y,i+Y_@

5.4.1.在QuickSet窗口内左下部选〈Single〉标签，在SampleName档内填写试样名称；在Function档内选择试样类型（标准选“InjectStandards”；样品选“InjectSamples”）；在MethodSet档内选择所需的方法组；在InjectionVolume档内输入进样体积；在RunTime档内输入记录时间。

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R-t_@_B6C05.4.2.用针头滤器过滤试样溶液（注射液可不必过滤），用试样溶液清洗注射器，并排除气泡后抽取适量。

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n_Zb$v

5.4.2.1.如按部分装液法，用微量注射器定容进样时，进样量应不大于定量环体积的50%，并要求每次进样体积准确、相同；

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S_b*{_Zb_e_g_K,j05.4.2.2.如按完全装液法，用定量环定容进样时，进样量应不小于定量环体积的3倍（5~10倍准确性更佳）。

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J2z;d_Ul_O（e,aO4p05.4.3.按〈Single〉标签内右边的进样（Inject）按钮，等待窗口底部状态档内显示“Waiting”后，方可进样。

分析化学博客_{_N_V0\_}_z

5.4.4.将进样阀手柄转动至Load位置，将注射器针完全插入进样阀入口中，平稳地注入试样溶液，除另有规定外，让注射器留在进样阀上，将进样阀手柄快速转动至Inject位置，系统将自动运行，采集数据并记录图谱。

_^_y_mk0\$\0U05.4.5.让进样阀手柄保持在Inject位置，到下次进样前1~2min切换回Load位置，将注射器从进样阀中拔出。

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5.4.6.先用水再用试样溶液清洗注射器后，按以上程序继续进样，直至完成。

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5.5.数据处理（外标法）和打印

v3}uG_[05.5.1.右击系统主界面下的『BrowseProject』图标，选择相应的项目，按「OK」进入Project窗口，选〈Channels〉标签。

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HfA7H_b_\.b:

P05.5.2.建立处理方法　选择一个待积分的标准，右击后选“Review”进入Review窗口。

按「ProcessingMethodWizard」图标（左边第一个）进入NewProcessingMethod向导窗口，按「OK」。

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i_Z_c'P2['Z05.5.2.1.划入一个感兴趣的最窄的峰，按「Next>」；分析化学博客"I_}_S0u_i1I

5.5.2.2.划入一段包含噪声的基线，按「Next>」；

_M_H_t（K3R7g_S05.5.2.3.划入一段要积分的区间，按「Next>」；分析化学博客_v_]_[_B7C_a

5.5.2.4.根据情况选择最小峰面积和最小峰高