果酒酿造实验报告.docx

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果酒酿造实验报告

果酒酿造实验报告

果酒酵母的分离纯化和选育

一、实验目的和内容

1.学习掌握果酒酵母分离纯化的方法；

2.对分离纯化得到的酵母菌进行筛选使其适合果酒酿造。

二、实验原理

酿酒酵母细胞透明，呈圆形或椭圆形，形体比较大，一般为

7×12μm，含有转化酶能将葡萄汁中的糖转化成乙醇、二氧化碳和其它代谢产物。

优良纯种酵母应具备下列性能：

（1）除酿酒水果本身的果香外，酵母也应产生良好的果香与酒香。

（2）生长速度快，有较高的发酵能力，能将糖分全部发酵完。

（3）具有较高的抗S02能力，有较好的凝集力和较快的沉降速度。

（4）培养基成分简单，来源广泛，价格低廉，对温度，pH，离子强度，溶氧等环境因素不敏感。

（5）能在低温或果酒适宜温度下发酵，以保持果香和新奇清爽的口味。

三、实验仪器与材料

样品：

新奇水果榨汁。

YEPD培养基（富集培养基）:

蛋白胨20g，葡萄糖20g，酵母膏10g，蒸馏水定容至1000ml.

PD培养基（酿酒酵母培养基）：

马铃薯200g，葡萄糖20g，XX脂20g，蒸馏水定容至1000ml.（马铃薯去皮，切成块煮沸后再煮

30分钟，然后用纱布过滤，再加糖及XX脂溶化后定容至1000ml。

121℃灭菌30分钟。

）

PYG培养基（菌种保XX培养基）：

蛋白胨3.5g，葡萄糖15g，酵母膏1.5g，KH2PO42.0g，MgSO4·7H2O1.0g，（NH4）2SO41.0g，XX脂20g，蒸馏水定容至1000ml.试剂：

亚硫酸钠、乙醇，碘液，无菌生理盐水等。

发酵培养基：

蔗糖200克，磷酸氢二钾1克，酵母膏10克，硫酸铵1克，七水硫酸镁1克。

器具：

三角烧瓶（250mL）、无菌试管、无菌吸管（1mL及5mL）、无菌滴管、接种环、冰箱、酒精喷灯、冰箱、玻璃涂棒，血细胞计数板，显微镜，磁力搅拌器，XX式离心机，震荡混合器等。

4、实验方法

（1）获得菌种配制YEPD培养基分装于100ml三角瓶内每瓶50ml高温灭菌冷却，然后分别取适量样品好的苹果、腐果果皮若干，将腐果，好果部分皮装入将富集培养液，各三份接种，120r/min，28℃摇床培养4天。

用接种环划线接种在PD培养基上，每个样品接三个平板，28℃恒温培养。

待菌种长出小菌落，镜检为酵母菌后，将其挑取于PD平板划线并标号后28℃恒温培养。

待再次长出单菌落后，挑取划线于PD培养基上，28℃恒温培养。

菌种划线三到四次后基本纯化。

2．酵母菌种的复筛选择果酒生产中生产性能优良的新奇果汁液

作为复筛培养基。

将初选菌种接入保XX培养基。

培养24h后每支斜面接入三角瓶培养，置于23-25℃的培养箱中培养，测定其发酵水平及产香水平，选育出优良健壮、耐性强的适合果酒发酵的酵母菌种。

发酵力试验：

采纳CO2失重法，取100mL三角瓶（已经烘干、称重），各加入80mL果汁，置于80℃的水浴杀菌5min，冷却到30℃后，按每升接种30mL的比例分别接入酵母种子液，在20℃下发酵。

发酵过程中每24h测定1次CO2损失量，每次测定时，摇晃瓶子，以排出CO2。

随着发酵时间的连续，瓶重逐渐减轻，直到减轻量不高于0.2g，即表示发酵结束，以CO2失重量为纵坐标，发酵时间为横坐标，绘制发酵力曲线，并确定菌株发酵力的强弱。

3．酵母菌的耐受性试验采纳杜氏管发酵法测定所筛选的酵母菌对乙醇（8%、10%、12%、14%、16%、18%、20%）、二氧化硫（60、80、100、120、140、160、180、200mg/L）的耐性。

将酵母菌分别接入含不同浓度的乙醇和不同浓度SO2的果汁培养基中，在相同条件下培养，观察杜氏管中气泡产生情况，重复3次。

活化条件：

28℃条件下，将纯种分离的菌种接种在PD培养基培养48h发酵条件：

28℃条件下，水果原汁培养基中静止发酵4d；

接种量：

1×107cfu/mL。

（1）耐酒精度试验采纳先分别量取无水酒精8、10、12、14、16ml，再以水果原汁为培养基，制成含酒精量为10%、12%、14%、16%、18%系列的液体培养基。

按下表在试管中加入果汁。

然后加入杜氏小管倒置使其充满果

汁，塞好棉塞，115℃20min灭菌。

灭菌完后，待试管温度为常温后

按下表加入酒精，加完后摇匀。

最后在每个编号试管中接入对数期酵

母1×107个，28℃静止培养。

观察产气情况，选出耐酒度比较好的菌

种。

将标签贴于各试管上，标10、12、14、16、18，按下表每管加

入果汁量：

试管编号010121416182095%酒精/mL01.051.261.41.681.902.15果汁/mL108.958.748.608.328.107.85培养液含酒精%

0101214161820（v/v）

（2）耐SO2试验按亚硫酸含量为6%计，计算出60、100、120、180、240mg/L浓度所需的量，分别加入到果汁中制成SO2不同浓度

系列的液体培养基。

按下表加入果汁，然后加入杜氏小管倒置使其充满果汁，塞好

棉塞，115℃20min灭菌。

灭菌完后，待试管温度常温后按上表加亚硫

酸（科密欧试剂SO2含量≥6%），加完后摇匀。

最后在每发酵管中接入

对数期酵母1×107个，28℃静止培养。

观察产气情况，选出耐SO2比较

好的菌种。

将标签贴于各试管上，标1、2、3、4、5，按下表每管加

入果汁量：

试管编号012345

亚硫酸/uL01017203040果汁/mL101010101010培养液含SO2mg/L060100120180240发酵3-4天，观察记录发泡状况，用加号表示发泡多少，选择耐二氧

化硫和酒精度都较高的菌株做保XX，供以后利用。

5、技术指标

（1）随着菌种的发酵，质量会降低，降低的越快，发酵速率越高根

据它质量随时间的变化曲线可以了解它发酵速度的快慢

（2）酒精，二氧化硫对菌种有抑制作用，表现为发泡少，综合比较

两种对发酵的抑制作用大小，选择耐受性较高的菌株做保XX。

6、分析实验数据，讨论结果。

果酒酵母的发酵

1、实验目的、意义

1．掌握果酒酿造的原理并对筛选果酒酵母菌种进行发酵性能测定（起酵时间、产酒精度、耐受性能）。

2．用实验十三所筛选果酒酵母进行小型酿酒实验，掌握果酒酿造一般工艺流程，并对自酿果酒进行感官品评和理化分析检测（糖度、酸度、酒精度）。

2、实验原理

果酒发酵：

果浆或果汁中的葡萄糖和果糖在酵母菌的作用下，最后生成酒精和二氧化碳。

可用以下反应式来说明：

果酒发酵是一个极其复杂的生物化学现象。

在每一步反应过程中都有酶的参与，除了最后生成酒精、二氧化碳和少量的XX油、高级醇类、醛类物质之外，还会生成二磷酸己糖、磷酸XX油醛、丙酮酸、乙醛等许多中间产物。

果酒的发酵分主发酵和后发酵两个阶段，主发酵是将发酵液的糖分变成酒精，后发酵是继续分解残糖为酒精，加速酒的转化，使酒更加稳定。

用人工培养的酵母发酵的称为人工发酵，利用天然酵母发酵

的称为自然发酵。

按照工艺的不同又可分为渣汁混合发酵和渣汁分离发酵两种形式。

3、实验材料

样品：

新奇水果及压榨汁。

试剂：

亚硫酸钠、乙醇、无菌水、化学纯液体石蜡、五氧化二磷、脱脂奶粉、10%HCl、干冰、95%乙醇、食盐、无水氯化钙、河沙、瘦黄土（有机物含量少的黄土）或者红土；

器皿：

三角烧瓶（250mL）、无菌试管、无菌吸管（1mL及5mL）、无菌滴管、接种环、40目及100目筛子、干燥器、安瓿管、冰箱、冷冻真空干燥装置、酒精喷灯、滤纸条（0.5×1.2cm）冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保XX器，玻璃涂棒，血细胞计数板，显微镜，紫外线等（15W），磁力搅拌器，XX式离心机，震荡混合器等。

4、实验方法

（1）果酒酿造的工艺流程

鲜果→分选→破碎、除梗→果浆→分离取汁→澄清→清汁→发酵→倒桶→贮酒→过滤→冷处理→调配→过滤→成品

（2）工艺简述

1）发酵前的处理

前处理包括水果的选别、破碎、压榨、果汁的澄清，果汁的改良等。

①破碎、除梗：

破碎要求每粒种子破裂，但不能将种子和果梗破碎，否则种子内的油酯、糖苷类物质及果梗内的一些物质会增加酒的苦味。

破碎后的果浆立马上果浆与果梗分离，防止果梗中的XX草味和苦涩物质溶出。

②二氧化硫处理：

二氧化硫在果酒中的作用有杀菌、澄清、抗氧化、增酸、使色素和单XX物质溶出、还原作用、使酒的风味变好等。

使用二氧化硫有气体二氧化硫及亚硫酸盐，前者可用管道直接通入，后者则需溶于水后加入。

发酵基质中二氧化硫浓度为60-100mg/L。

（以葡萄酒为例：

二氧化硫添加量的计算：

[葡萄果实×70%×60]/[0.06×1000]。

）此外，尚需考虑下述因素：

原料含糖高时，二氧化硫结合机会增加，用量略增；原料含酸量高时，活性二氧化硫含量高，用量略减；温度高，易被结合且易挥发，用量略减；微生物含量和活性越高、越杂，用量越高；霉变严峻，用量增加。

2）果汁的调整：

取汁测定果汁中糖度和酸度，根据发酵需要调整糖度和酸度。

①糖的调整：

酿造酒精含量为10%-12%的酒，果汁的糖度需17-20°Bx。

如果糖度达不到要求则需加糖，实际加工中常用蔗糖或浓缩汁。

②酸的调整：

酸可抑制细菌生殖，使发酵顺利进行；使酒颜色鲜亮；使酒味清爽，并具有柔软感；与醇生成酯，增加酒的芳香；增加酒的贮XX性和稳定性。

干酒易在0.6%-0.8%，甜酒0.8%-1%一般pH

大于3.6或可滴定酸低于0.65%时应该对果汁加酸。

发酵

调整后的果汁里加上酵母菌,于28度温度下培养一周，每天测含糖量，含酸量，分别制成曲线。

发酵结束后用蒸馏设备将酒蒸出，并用酒度计测量酒度。

另外：

糖的滴定实验

1.实验目的掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用直接滴定法测定还原糖的方法。

2.实验原理斐林氏溶液与还原糖共沸，其中斐林氏溶液中的Cu2+被还原糖还原为Cu2O（砖红色）时，反应达到终点，过量的还原糖使次甲基蓝指示剂蓝色褪去，显露出Cu2O的红色即为终点。

3.实验材料和用具

1）试剂

费林甲液：

称取68.29g硫酸铜（CuSO4·5H2O），溶于蒸馏水中并稀释到1000ml。

费林乙液：

称取346g酒石酸钾钠及100gNOH，溶于蒸馏水中，完全溶解后，用蒸馏水稀释到1000ml，贮存于具橡皮塞玻璃瓶中。

0.25％葡萄糖标准溶液：

准确称取2.500g经98-105℃干燥至恒重的无水葡萄糖，加蒸馏水溶解后移入1000ml容量瓶中，加入5ml浓HCl（防止微生物生长），用蒸馏水稀释到1000ml。

2）器具：

电热恒温水浴锅，调温电炉，250ml锥形瓶，滴定管。

4.操作步骤

1）标定预备试验：

吸取费林溶液、B各5.00mL于250mL三角瓶中，加50mL水，摇匀，在电炉上加热至沸，在沸腾状态下用制备好的葡萄糖标准溶液滴定，当溶液的蓝色将消逝呈红色时，加2滴次甲基蓝指示液，继续滴至蓝色消逝，记录消耗的葡萄糖标准溶液的体积。

2）标定正式试验：

戏取费林溶液、B各5.00mL于250mL三角瓶中，加50mL水和比预备试验少1mL的葡萄糖标准溶液，加热至沸，并保持2min，加2滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下于1min内用葡萄糖标准溶液滴至终点，记录消耗的葡萄糖标准溶液的总体积。

计算

式中：

F——费林溶液、B各5mL相当于葡萄糖的克数，g；m——称取葡萄糖的质量，g；V——消耗葡萄糖标准溶液的总体积，mL。

3）苹果酒样品还原糖测定：

准确吸取一定量的样品（V1）于100mL容量瓶中，使之所含还原糖量为0.2～0.4g，加水定容至刻度。

吸取费林溶液、B各5.00mL于250mL三角瓶中，加50mL水和一定量的试样（试样所含还原糖量为0.2-0.4g），加热至沸，并保持2min，加2滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下于1min内用葡萄糖标准溶液滴至终点，记录消耗的葡萄糖标准溶液的总体积。

按式（5）计算。

式中：

X——总糖或还原糖的含量，g／L；F——费林溶液Ⅰ、Ⅱ各5mL相当于葡萄糖的克数，g；V1——吸取的样品体积，mL；V2——样品稀释后或水解定容的体积，mL；V3——消耗试样的体积，mL；G——葡萄糖标准溶液的准确浓度，g／mL；V——消耗葡萄糖标准溶液的体积，mL。

所得结果应表示至一位小数。

滴定酸的测定—中和滴定法

1.实验目的和内容

（1）采纳中和滴定法测定葡萄酒（果酒）中滴定酸的含量。

（2）适用于各种类型葡萄酒（果酒）中滴定酸含量的测定。

以g/L报告其结果，测定值保留一位小数。

2.实验原理利用酸碱中和的原理，以氢氧化钠标准溶液直接滴定葡萄酒（果

酒）样品中的滴定酸，用酚酞指示剂指示滴定终点，由所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积计算葡萄酒（果酒）中滴定酸的含量。

3.试剂酚酞指示剂溶液，10g/L：

称取酚酞1.0g，溶于60mL乙醇中，用水稀释至100mL。

0.1mol/L氢氧化钠标准滴定溶液。

氢氧化钠标准溶液，c（NOH）＝0.1mol/L。

（1）配制将氢氧化钠配成饱和溶液，注入塑料瓶（或桶）中，封闭放置至溶液清亮，使用前虹吸上层清液。

量取5mL氢氧化钠饱和溶液，注入1000mL不含二氧化碳的水中，混匀。

（2）标定称取0.6g于105～110℃烘至恒量的基准邻苯二甲酸氢钾，精确至0.0001g。

溶于50mL不含二氧化碳的水中，加入2滴酚酞指示剂溶液，以新制备的氢氧化钠标准溶液滴定至溶液呈微红色为其终点。

同时做空白试验。

（3）计算按下式计算氢氧化钠标准溶液的浓度：

C＝m/（V1-V2）×0.2042

式中：

C——氢氧化钠标准溶液浓度，mol/L；m——基准邻苯二甲酸氢钾的质量，g；V——滴定时所消耗氢氧化钠溶液的体积，mL；V1——空白试验消耗氢氧化钠溶液的体积，mL；0.2042——与1.00mL氢氧化钠标准溶液

[c（NOH）=1.000mol/L]相当的，以克表示的邻苯二甲酸氢钾的质量。

4.操作步骤

（1）样品的测定取调温至20℃的样品2.00-5.00mL（取样量可根据酒的颜色深浅而增减）置于250mL三角瓶中，加入中性蒸馏水50mL，同时加入2滴酚酞指示剂溶液，摇匀后，马上用氢氧化钠标准溶液（c（NOH）＝0.1mol/L）滴定至溶液微红色为终点，并保持30s内不变色，记录所消耗氢氧化钠标准溶液的体积V1。

起泡葡萄酒和加气起泡葡萄酒需排除二氧化碳后，再进行测定。

（2）空白的测定吸取中性蒸馏水50mL置于250mL三角瓶中，同时加入2滴酚酞指示剂溶液，其余操作同1。

（3）结果计算按下式计算滴定酸的量，以g/L表示：

式中：

X——样品中滴定酸的含量，g/L；c——氢氧化钠标准溶液浓度，mol/L；V1——样品滴定时，消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；V0——空白滴定时，消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；V2——吸取样品的体积，mL；Si——与1.00mL氢氧化钠标准溶液[c（NOH）=1.000mol/L]相当的，以克表示的试样主体酸的质量。

S酒石酸＝0.075；S苹果酸＝0.067；S柠檬酸＝0.064；S草酸＝0.045

酒度的测定

1.实验目的和内容

（1）采纳酒精计法测定葡萄酒（果酒）中酒精度。

（2）适用于各种类型葡萄酒（果酒）中酒精度的测定，结果表示为体积百分数，即%（v/v），保留一位小数。

2.实验原理以蒸馏法去除样品中的不挥发物质，利用酒精计和温度计直接读取酒精度和温度的示值，并加以温度校正，求得20℃时乙醇的体积百分数，即酒精度。

3.实验材料全玻璃蒸馏器、酒精计、量筒。

4.操作步骤

（1）用一洁净、干燥的100mL容量瓶准确量取100mL（具体取样量应按酒精计的要求增减）样品（液温20℃）于500mL蒸馏瓶中，用50蒸馏水连续三次冲洗容量瓶，连接酒精蒸馏装置，加热蒸馏，直到蒸出的液体大约100毫升时，用蒸馏水定容至100mL

（2）将试样倒入洁净、干燥的100mL量筒中，静置数分钟，待其中气泡消逝后，放入洗净、干燥的酒精计，再轻轻按一下，不得接触量筒壁，同时插入温度计，平衡5min，水平观测，读取与弯月面相切处的刻度示值，同时记录温度。

根据测得的酒精计示值和温度，查附录，换算成20℃时酒精度。

所得结果表示至一位小数。

5、技术指标

（1）还原糖能产生酒精，所以可以用苹果酿酒。

（2）二氧化硫有还原性，果汁里面放二氧化硫可以阻止果汁被氧化。

（3）随着发酵进行，果汁当中的含糖量减少，含酸量增加，可以将其制成曲线，显示其随时间变化。

6、分析数据，讨论结果