超分辨率荧光显微技术的原理和进展.docx

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超分辨率荧光显微技术的原理和进展

超分辨率荧光显微技术的原理和进展

姓名：

曹宁

学号:

104753141002

专业：

药理学

2015年2月

超分辨率荧光显微技术的原理和进展

摘要：

在生命科学领域，人们常常需要在细胞内精确定位特定的蛋白质以研究其位置与功能的关系。

多年来，宽场/共聚焦荧光显微镜的分辨率受限于光的阿贝/瑞利极限，不能分辨出200nm以下的结构。

近年来，随着新的荧光探针和成像理论的出现，研究者开发了多种实现超出普通共聚焦显微镜分辨率的三维超分辨率成像方法．主要介绍这些方法的原理、近期进展和发展趋势。

史蒂芬·赫尔（Stefanw．Hell）、埃里克·本茨格（EricBetzig）和威廉·默尔纳（WilliamE.Moerner）因在超分辨率荧光显微技术方面的贡献共享了2014年的诺贝尔化学奖。

他们使用荧光分子和特殊的光物理原理，巧妙地突破了普通光学显微镜无法突破的“阿贝极限”，其开创性的成就使光学显微技术发展为“显纳”技术，能够窥探纳米世界。

关键词：

超分辨率荧光显微技术，光激活定位显微技术，随机光学重构显微技术，点扩散函数

现代生物医学研究中为了更好地理解人体生命的作用过程和疾病的产生机理，需要观察细胞内细胞器、病毒、寄生虫等在三维细胞空间的精确定位和分布．另一方面，后基因组时代蛋白质科学的研究也要求阐明：

蛋白质结构、定位与功能的关系以及蛋白质-蛋白质之间发生相互作用的时空顺序；生物大分子，主要是结构蛋白与RNA及其复合物，如何组成细胞的基本结构体系；重要的活性因子如何调节细胞的主要生命活动，如细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡与细胞信号传递等．反映这些体系性质的特征尺度都在纳米量级，远远超出了常规的光学显微镜（激光扫描共聚焦显微镜等）的分辨极限（xy向分辨率：

200nm，z向分辨率：

500nm）[1].应用传统的电子显微镜（EM）可以达到纳米量级的分辨率，能够观察到细胞内部囊泡、线粒体等细胞器的定位，但是由于缺乏特异性的探针标记，不适合定位单个蛋白质分子，也不适合观察活细胞和细胞膜的动态变化过程．因此，生物学家迫切希望有一种实验显微方法，它既具有亚微米甚至纳米尺度的光学分辨本领，又可以连续监测生物大分子和细胞器微小结构的演化，而并不影响生物体系的生物活性．

近年来，随着新型荧光分子探针的出现和成像方法的改进，光学成像的分辨率得到极大的改进，达到可以与电子显微镜相媲美的精度，并可以在活细胞上看到纳米尺度的蛋白质

[2～5]．这些技术上的进步势必极大地推动生命科学的发展，为了增强生物学家对于超分辨率荧光显微成像（super-resolutionfluorescentmicroscopy）机理的理解，以下我们将介绍传统的荧光显微成像的极限，突破此极限超分辨率成像的原理以及目前国际上的最新进展.

1.光学显微镜与阿贝极限

最简单的光学显微镜由2个凸透镜组成，它利用的就是凸透镜能将物体的像放大的原理。

在此之后，荷兰微生物学家安东尼·范·列文虎克（AntonievanLeeuwennhoek）和英国物理学家罗伯特·虎克（Roberthooke）对物体的成像原理进行了深入研究，并改进了显微镜的结构，发明了调焦系统、照明装置和载物台，制造出了具有现代雏形的光学显微镜［32］。

他们利用改进后的光学显微镜做了一系列生物学观察实验。

1873年德国显微技术专家恩斯特·阿贝（ErostAbbe）揭示了光学显微镜由于光的衍射效应和有限孔径分辨率存在极限的原理［33］。

根据点扩散函数简称PSF，是一个无限小物点通过光学系统在像平面处的光强分布函数［3］，也可以理解为艾里斑的光强分布函数），艾里斑的大小可以用其半高宽／半宽度（fullwidthathalfmaximum，简称FWHM）来表示。

在垂直于光传播方向的平面上（x，y平面），其半高宽大约为（Δx，Δy）＝λ/2nsina＝λ/2NA，在光传播的方向上（z轴），其半高宽大约为Δz＝2λ/2nsin2n[9]。

其中λ是入射光的波长，n是介质的折射率，a是物镜的半孔径角度，NA是物镜的数值孔径。

分辨率不仅与光斑的半高宽相关，还与成像的对比度有关．以xy平面为例，对比度的概念是：

在两个同样亮度的点光源光斑中间存在亮度的最小值，而点光源光斑的中心为亮度的最大值，此两值之间的差与亮度最大值的比值即为对比度．当两个点光源光斑距离靠近时，对比度下降，而距离分开时，对比度上升，其分布范围在0～1之间．瑞利分辨率（r）的概念是：

在理想的光学成像环境下，当两个点光源光斑的对比度为26.4%时，两个光斑中心点之间的距离即为瑞利分辨率．将显微镜的光斑在xy平面上的分布用二维的贝塞尔函数或是高斯函数来拟合（点扩散函数pointspreadfunction,PSF）[34]，计算对比度为26.4%时光斑的距离，就可以得到瑞利分辨率．宽场荧光成像时xy平面的分辨率为rx,y=0.6λ/NA．用共聚焦显微成像时，由于在同样的荧光发射波长上，其光斑大小约是宽场荧光成像时光斑大小的平方根，所以xy平面的分辨率可以提高约30%，r

x,y=0.4λ/NA[35]．若以波长为500nm的光成像，水折射率为1.33，得到分辨率极限约为200nm［33］，即前文提到的0.2μm，这就是所谓的传统光学显微镜中的“阿贝极限”。

Fig．2RayleighCriterion

图2　瑞利判据［8］

2xy平面上的超分辨率显微技术

2.1

单分子荧光成像需要指出的是，当显微镜需要分辨两个或者更多点光源的时候，很难突破光学分辨率的极限来进行精确定位．而当显微镜的物镜视野下仅有单个荧光分子的时候，通过特定的算法拟合，此荧光分子位置的精度可以很容易超过光学分辨率的极限，达到纳米级．1981年，Barak和Webb[8]首先将单分子跟踪技术引入到生命科学中，在成纤维细胞上跟踪了一个荧光标记的低密度脂蛋白受体的动力学过程．2000年初，人们开始讨论优化算法，改进成像器械，来进一步提高单个荧光分子的定位精度．Cheezum等[9]比较了四种定位算法，确认在同样的信噪比图像上，用高斯函数拟合单分子荧光的点扩散函数可以达到最佳的定位精度．Thompson等[10]结合了理论推导和计算机模拟，综合考虑了各种因素的影响，如离散时间段检测到的发出光子数的泊松噪声、CCD相机的背景读出噪声以及CCD像素点的大小等，得到了单分子在二维定位精度上的近似公式：

其中x为定位的误差，s为点扩散函数的标准方差，a为CCD像素的大小，N为收集到的光子数，b为背景噪声。

在建立了上述单分子定位精度公式的基础上，人们开始测量一些荧光标记生物分子的纳米级定位和运动。

例如，PaulSelvin研究小组将肌凝蛋白myosin标记上Cy3分子，应用单分子成像技术在体外优化的条件下研究myosin步进的长短，其分辨率达到1.5nm[11]。

尽管活细胞上单分子荧光成像的精度（20nm）通常还不能达到体外的水（1.5nm），通过提取单分子成像的信息人们仍然可以解决一些超出其分辨率范围的问题。

例如，细胞质膜上的离子通道，通常大小在2～3nm之间，其结构一般只能够通过X射线晶体衍射得到．我们发展了单分子成像技术，成功确定细胞膜上钙库释放诱发的钙通道（CRAC）是由4个Orai1蛋白和2个STIM1蛋白组成的[12]。

此结果被随后发表在Nature上的文章所验证[13]，并进一步证明了单分子成像作为一种新的确定通道成分方法的可靠性。

2.2PALM和STORM

如上所述，尽管单分子的定位精度可以达到纳米级，但它并不能提高光学显微镜在分辨两个或者多个点光源时的分辨率．2002年，Patterson和Lippincott-Schwartz[14]首次利用一种绿色荧光蛋白（GFP）的变种（PA-GFP）来观察特定蛋白质在细胞内的运动轨迹．这种荧光蛋白PA-GFP在未激活之前不发光，用405nm的激光激活一段时间后才可以观察到488nm激光激发出来的绿色荧光。

德国科学家EricBetzig敏锐地认识到，应用单分子荧光成像的定位精度，结合这种荧光蛋白的发光特性，可以来突破光学分辨率的极限。

2006年9月，Betzig和Lippincott-Schwartz等[2]首次在Science上提出了光激活定位显微技术（photoactivatedlocalizationmicroscopy,PALM）的概念。

其基本原理是用PA-GFP来标记蛋白质，通过调节405nm激光器的能量，低能量照射细胞表面，一次仅激活出视野下稀疏分布的几个荧光分子，然后用488nm激光照射，通过高斯拟合来精确定位这些荧光单分子。

在确定这些分子的位置后，再长时间使用488nm激光照射来漂白这些已经定位正确的荧光分子，使它们不能够被下一轮的激光再激活出来。

之后，分别用405nm和488nm激光来激活和漂白其他的荧光分子，进入下一次循环。

这个循环持续上百次后，我们将得到细胞内所有荧光分子的精确定位。

将这些分子的图像合成到一张图上，最后得到了一种比传统光学显微镜至少高10倍以上分辨率的显微技术。

PALM显微镜的分辨率仅仅受限于单分子成像的定位精度，理论上来说可以达到1nm的数量级。

2007年，Betzig的研究小组更进一步将PALM技术应用在记录两种蛋白质的相对位置

[15]，并于次年开发出可应用于活细胞上的PALM成像技术来记录细胞黏附蛋白的动力学过程[16]。

STED显微镜凭借其超高的分辨率很快被应用到生物细胞研究方面并取得一系列重要的新发现。

例如：

在对突触传递（SynapticTransims-sion）过程的研究中，STED显微镜分辨出直径仅40nm的突触囊泡，并发现突触囊泡膜蛋白Ｉ（SynaptotagminＩ）在突触囊泡胞吐（Endocyto-sis）后保持独立团簇状态的现象［11］；对果蝇神经肌肉突触激活区的观察发现蛋白Byuchpilot环状的超精细结构［12］；对哺乳动物细胞核内蛋白SC35的斑状结构观察的分辨率达到了20nm；识别了细胞核内直径25-40nm的突触囊泡膜蛋白Ｉ；对人类神经母细胞瘤（neuroblastoma）的神经丝可以分辨30nm以下的细节［13］；利用STED显微镜对哺乳动物细胞内细胞膜观察到SNARE蛋白SNAP-25的纳米排列结构，第一次揭示了SNAP-25以小于60nm的团簇排列的现象［14］等。

PALM的成像方法只能用来观察外源表达的蛋白质，而对于分辨细胞内源蛋白质的定位无能为力。

2006年底，美国霍华德-休斯研究所的华裔科学家庄晓薇实验组开发出来一种类似于PALM的方法，应用特定波长的激光来激活探针，然后应用另一个波长激光来观察、精确定位以及漂白荧光分子，此过程循环上百次后就可以得到最后的内源蛋白的高分辨率影像，被他们命名为随机光学重构显微技术（stochasticopticalreconstructionmicroscopy,STORM）[3]。

但是，STORM方法也存在缺陷，由于用抗体来标记内源蛋白并非一对一的关系，所以STORM不能量化胞内蛋白质分子的数量，同时也不能用于活细胞测量。

2.3STED

不管是PALM还是STORM的超分辨率成像方法，其点扩散函数成像仍然与传统显微成像一致。

由于需要反复激活-猝灭荧光分子，所以使得实验大多数在固定的细胞上完成。

即使是在活细胞上进行的实验，其时间分辨率也较低

[16]。

2000年，德国科学家StefanHell开发了另一种超高分辨率显微技术，其基本原理是通过物理过程来减少激发光的光斑大小，从而直接减少点扩散函数的半高宽来提高分辨率。

当特定的荧光分子被比激发波长长的激光照射时，可以被强行猝灭回到基准态。

利用这个特性，Hell等开发出了受激发射损耗显微技术（stimulatedemissiondepletion,STED）[4]。

从而减少荧光光点的衍射面积，显著地提高了显微镜的分辨。

2.4SSIM

改变光学的点扩散函数来突破光学极限的另一个方法是利用饱和结构照明显微技术（saturatedstructureilluminationmicroscopy,SSIM）。

3.三维SSIM成像

三维结构性照明成像的原理与二维结构性照明成像的原理是一致的，其区别是在原来的两束干涉光的基础上又加了一束干涉光束，来产生z轴方向的干涉模式，提取z轴的信息。

加州大学旧金山分校的Gustafsson、Sedat和Agard博士将自己开发出来的三维干涉光激发模块加到普通的显微镜系统上，成功地记录到细胞核膜上核孔复合体的精细三维结构，其分辨率达到xy平面100nm左右，z轴方向上200nm左右[28]，充分反映了这种成像方法对厚样本深度成像的能力。

此方法应用起来相对简单，不需要特殊的荧光标记。

但是，其最大的缺陷是三维分辨率远低于其他的超分辨率成像技术。

4.三维超分辨率显微技术的发展趋势

与21世纪初相比，三维超分辨率显微成像已有很大的发展，有多种不同成像技术实际应用于生物系统的范例，甚至已经出现了商业化的超分辨率显微成像系。

．但是，目前的成像模式仍然远远没有达到完美状态，对于固定样本成像其三维分辨率还没有达到可以和电子显微镜相媲美的几个纳米的范围。

当前的发展趋势是结合不同成像模式的优点，进一步提高成像的精度和准确度。

例如，2009年霍华德-休斯研究院的研究人员将PALM/STORM技术和光的干涉原理结合起来（类似于4π和SSIM成像的原理），将三维的分辨率提高到20nm以内，并极大地提高了收集同样光子后的定位精度[29]。

为了进一步提高图像的分辨率、对比度和成像的灵活性，人们努力的另一个方面是继续开发出量子效率更高、荧光更稳定、颜色不同的荧光蛋白或者是荧光染料。

例如，JenniferLippincott-Schwarz实验室于2009年开发出稳定的红色光激活荧光蛋白PA-mCherry，使对两种不同蛋白质同时进行超分辨率PALM成像成为可能

[30]。

由于生命现象是非静止的不停歇活动的本质，超分辨率成像应用的一个重要领域是活细胞成像，如近来已有报道的可应用于活细胞上的超分辨率成像技术包括SSIM技术[31]、PALM技术[16]和STED技术[21]等。

但是，活细胞上快速成像的分辨率远低于固定样本成像，其时间分辨率也较低。

因此，当前的研究热点集中在通过改进荧光探针和成像模式来进一步提高活细胞上超分辨率成像的时空分辨率。

应用和进一步完善超分辨率显微镜成像技术，将使得科学家实时动态观察生物有机体内的生化反应过程成为现实，为深刻认识复杂生命现象的本质打开了黑箱之窗，使得人们可以直观地从基因表达、蛋白质相互作用、信号网络、细胞功能等多层面、多视角观察研究有机体个体发育、遗传进化、重大疾病发生、环境对生命个体影响等生命现象发生、发展的过程，对阐释生命活动的基本规律、揭示疾病发生机理、建立疾病预警系统、提高医疗诊治水平、探寻发现新药物具有重大作用。

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23HuangB,WangW,BatesM,etal.Three-dimensionalsuper-resolutionimagingbystochasticopticalreconstructi