丹参的生物技术.docx

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丹参的生物技术

丹参的生物技术

摘要：

现代生物工程技术是进行中药材品质改良的可行途径之一。

本文对丹参的组织培养、毛状根诱导培养及基因工程等方面的研究进展与具体方法以及目前存在的问题做一综述。

关键词：

丹参生物技术细胞与组织培养基因工程毛壮根培养

一、概述

中药丹参是唇形科鼠尾草属的多年生草本植物丹参（SalviamiltiorrhizaBunge）的干燥根及根茎,因其色红且形状似参而得名“丹参”,又称血参、紫丹参、红丹参等。

丹参作为一传统中药在我国沿用已久,始载于《神农本草经》,被列为上品。

《本草经疏》《、本草纲目》中都有记载。

丹参具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦的功效,主治冠心病、心绞痛、心烦不眠、月经不调、经闭痛经等症。

近年来研究发现用来治疗心血管疾病,疗效显著。

丹参属于用量较大的常用药材。

丹参商品野生、家种均有（50年代以前野生为药用主要来源，仅有四川一地有家种产品，60年代后全国各地均有引种）。

野生资源主要分布于河北、北京、山西、山东、湖北，湖南、辽宁、江苏、江西、云南、贵州、甘肃、陕西；家种则主要分布于河北、天津，江苏、上海、浙江、安徽、河南、山东、四川等省。

当中，以四川中江等地栽培品为最佳。

二、国内外研究现状及研究所取得的成果

现代生物技术是以基因工程、细胞工程、发酵工业、酶工程、生化工程以及后来衍生出来的第二代、第三代的蛋白质工程、抗体工程和糖链工程等为主体的高新技术,它被看作是21世纪科学技术的核心。

纵观这一领域,生物技术的产业化首先是从医药领域开始的,现代生物技术的发展使医药产业发生了革命性的变化。

近10多年来,从天然产物中寻找新的生理活性成分或先导化合物以开发新药已成为全球关注和研究的热点。

由于野生药材资源日益枯竭,人工栽培品种品质不稳定,生物技术的兴起对传统药材的生产展示了广泛的应用前景。

为了提高品质,满足市场需求,近年来利用细胞工程、基因工程等现代生物工程技术对丹参作了深入的应用性研究。

（一）离体培养丹参试管苗的增殖

蔡朝晖[1]等研究表明:

以丹参叶为外植体,接种在附加6-BA0.5～1mg/L的MS培养基上出芽效果最好。

试管苗转移到1/2MS附加IBA0.2mg/L的培养基上生根效果最好。

另有报道:

在含有不同激素组合的B5固体培养基上建立的丹参不定根培养物在不同培养条件下产生了4种主要的丹参酮类,在IAA或NAA配合有或无6-BA的B5培养基中不定根生长很快;当加入IBA于培养基中时得到了丹参酮的最高生产量,液体培养基中不定根培养物的丹参酮含量超过80mg/g（DW）（6倍于亲体植物根中的含量）；通过丹参的快速繁殖，试管苗移栽到大田里后,6个月龄的丹参根产生的丹参酮比商品丹参根（通常来自3～4年龄植物）高。

这些关于丹参的快速繁殖的研究,对丹参的栽培生产有重要的意义。

另外，客绍英[2]等比较了不同温度、不同pH值对愈伤组织诱导的影响，确定以MS为基本培养基，温度25℃，pH5．8对丹参茎尖愈伤组织的诱导效果最好。

赵洁[3]等进一步研究了不同光质和温度对丹参叶片丛生芽形成的影响。

冯玲玲[4]等以丹参幼嫩叶片为外植体进行诱导，测定了在黑暗和光照条件下愈伤组织培养增殖过程中的生长曲线，并测定了其中可溶性蛋白含量、过氧化物酶活性（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性的变化，表明在光照条件下细胞生长和分化速度较快。

（二）人工诱导多倍体

多倍体植株由于染色体的加倍，细胞和器官表现出“巨型性”的特征，因此对外界环境具有较强的生态适应性和抗逆性。

药用植物大多以根、茎和叶等器官为收获对象，其染色体加倍后，根、茎、叶巨型化；另一方面，药用植物的倍性变化往往能导致次生代谢产物含量的变化，这就有可能获得优质的药用植物新品种。

高山林[5]等用10–50ppm的秋水仙碱已成功诱导出丹参的四倍体株系。

测定结果表明：

在供试的10个多倍体株系中，3种丹参酮总含量是对照的211.1%。

因此，进一步探索采用多倍体技术培育出高产的丹参多倍体新品种具有重要的意义。

（三）细胞培养

陶璐璐[6]等用海藻胶包埋丹参愈伤组织细胞，证实了细胞经固定处理后，在培养基中收获代谢产物是可行性的。

固定化技术能够克服培养过程中的许多缺点诸如细胞过于分散，不易更换新鲜营养液、不易挑选优质细胞系及代谢产物与分散的细胞不易分离等，因而在生产中被广泛应用。

摸清丹参细胞系在不同生长时期的营养供给条件和相应的激素调节是实现用细胞培养的方法生产次生代谢产物的基础。

研究结果表明，MS培养基中蔗糖、氮源和硫胺素（VB1）是生产隐丹参酮和铁锈醇所必需的，硫酸盐、MnSO4和激动素表现出一些有益的影响，而MS培养基所有其他成分被认为不必需，甚至有抑制作用。

B5培养基最适合愈伤的生长，其次是6,7-V培养基；MS培养基介于两者之间。

对愈伤悬浮细胞生长的最适蔗糖浓度为3％，对迷迭香酸的形成的最适合浓度为5％。

植物生长激素2,4-D抑制水溶性总酚的形成,高浓度的KT能显著提高总丹参酮的含量。

MS+KT1.0mg／L+NAA0.1mg／L对水溶性总酚和丹参酮的形成促进作用最大。

WU[7]等试验发现，以MS为基本培养基时附加0.2mg／LBA，60d后最有利于隐丹参醌的积累，达到4.59±0.09mg／g干重。

鉴于采取细胞培养在生产次生代谢产物方面的优点，因此，有必要进一步探索丹参细胞悬浮培养的营养供给条件，如培养基中有利的营养成分的最佳配比、添加量以及添加的最佳时期与代谢产物的积累规律之间的关系等。

（四）农杆菌介导丹参的遗传转化

农杆菌遗传转化方法具有简单易行，成本低，转化率高，拷贝数少，遗传表达稳定性较好的优点，是一种很有潜力的转化方法。

在丹参研究中，利用转化的组织和器官培养生产丹参中的活性成分是近年来丹参组织培养的新亮点。

宋经元、张荫麟[8]等,以根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）直接感染的方式进行Ti-质粒转化诱导丹参冠瘿组织,筛选出丹参高产株系C1，其丹参酮含量是生药的1.9倍,且在无激素的67-V培养基上有利于选择高产株系,并指出利用选出的高产株系在配合诱导子诱导进行液体静止培养,可能是生产丹参酮的可行途径。

王倩[9]用根癌农杆菌介导法将来源于构巢曲霉（Aspergillusmidulans）的HMGR基因导入到丹参中，经过抗性筛选获得一批丹参的再生植株。

通过PCR和Southernblotting检测，证实了HMGR基因已整合到丹参的基因组，并用PT—PCR证实了HMGR在mRNA水平上的转录。

王丽娟将采自小麦的抗逆基因Talea3整合到丹参基因组中。

对转基因丹参进行耐逆性实验分析，结果表明转Talea3基因的丹参植株提高了耐盐和耐干旱的能力。

上述实验证实了对丹参进行有目的的遗传转化是完全可行的。

遗传转化对丹参的原有特性如株高、产量、生长势等是否会造成影响，尚无相关报道。

越来越多的报道表明，一些植物通过导入外源基因后使其表型发生变化后，新获得的遗传特性并不都会稳定遗传，会发生转基因失活或转基因沉默的现象，在丹参的遗传转化中是否会发生这种情况值得关注。

（五）丹参毛状根的离体培养

黄炼栋[10]等报道利用发根农杆菌Agrobacteriumrhizagenes诱导毛状根，发现丹参毛状根可在无外源激素条件下自发形成再生植株，生命力旺盛，根系发达，分枝多。

张荫麟等利用发根农杆菌直接感染的方式进行Ri-质粒转化诱导毛状根,用Southren印迹分子杂交法证实发根农杆菌Ri-质粒的T-DNA转化到丹参细胞的DNA中,实验结果显示丹参毛状根经MS+NAA0.1mg/L处理4d后在67-V培养基上悬浮培养44d,增殖倍数可达370.5倍,这是常规培养难以达到的增殖速度;而且还证实真菌诱导子对丹参毛状根丹参酮和隐丹参酮的积累是有效的[11]。

从而显示毛状根在生长量的增殖及有效成分的积累方面的优越性。

。

QiongYant[12]等在丹参毛状根的离体培养过程中，将添加酵母提取物（YE）、吸收树脂（X–5）和半连续培养模式等多种手段进行联合运用，结果发现毛状根产量可以增加3倍以上，而丹参酮的产量则达到87.5mg／L培养液，比常规培养增加了近15倍。

上述研究表明培养条件和调控因子对丹参毛状根的生长及其活性成分的积累具有极大的影响，所取得的成果为今后利用丹参毛状根培养系统大规模生产药用活性成分奠定了基础，并为其他名贵药材资源的可持续开发与利用以及绿色原料药的生产开辟了一条新途径。

二、研究的具体方法

（一）丹参组培快繁技术研究

1、方法

外植体用0.1％洗衣粉浸泡20min，自来水冲洗数次，在超净工作台内用75％酒精消毒30S。

0.1％升汞消毒6-12min，然后用无菌水冲洗3—4次。

经消毒后的嫩茎切成带一个腋芽的茎段，叶片切成0.5×0.5cm2，接种到MS培养基上，30d左右获得无菌苗，待无菌苗长至3～4片叶时，在40X解剖镜下切取0.2-0.4mm茎尖，在附加激素的培养基上培养。

丹参茎尖苗用添加多种激素诱导，以筛选最优的增殖和生根方式。

愈伤组织和丛生芽诱导用MS培养基（蔗糖3％，琼脂0.65％），附加不同种类和浓度的激素pH5.8，于温度28℃左右，18001x光照12h/d培养[13]。

2、结果

不论丹参的茎或叶外植体，在以上两种培养基上，除污染的材料外，在一个月的诱导培养期内，绝大多数都能发生愈伤组织。

出发生的丹参愈伤组织无色透明或稍暗，组织发生后生长较快，一般在2个月内均能将其自母体剥离，进行继代培养。

（二）丹参的基因工程

1、丹参抗病基因工程

植物抗病基因工程是指通过基因工程的手段,将外源或内源的抗病基因导入植物体内表达以提高转基因后代的抗病能力。

根据抗病对象不同,可以分为抗病毒、抗细菌和抗真菌基因工程。

河北农林科学院利用生物学、电镜观察、血清学和基因序列测定等方法对丹参花叶病的病原进行了初步研究,结果发现黄瓜花叶病毒[14]（Cucumbermosaicvirus,CMV）与该病害密切相关,同时也对CMV丹参分离物进行了其CP基因序列分析，并与CMV其他株系CP基因进行了比较。

随后的研究也曾提出将该CP基因的密码子变成植物不常用的稀有密码子后,导入植物后可能达到高抗甚至免疫的效果,该研究为下一步进行丹参的抗病毒基因工程育种奠定了良好的基础。

2、丹参抗逆基因工程

目前,在植物抗逆基因工程研究方面,人们利用现代分子生物学手段,已经能够在基因组成、表达调控及信号转导等分子水平上认识和探索植物的抗逆机制,并且也克隆出一些抗逆相关基因,如渗透调节物质生物合成关键酶脯氨酸合成酶基因、LEA蛋白基因、水通道蛋白（AQP）基因和抗冻蛋白（APF）基因等。

但是,目前植物抗逆基因工程在丹参方面的研究仍然处于起步阶段,最近,韩立敏[15]等成功克隆了丹参的抗坏血酸过氧化酶基因（SmAPX）和丹参谷胱甘肽过氧化酶基因（SmGPX）,并详细分析了这两种基因在丹参各部位的表达情况及表达量与不同盐胁迫时间和浓度之间的关系,从而开展了丹参体内抗氧化保护酶基因的研究,为研究植物在逆境下的生长发育的分子机制提供了理论基础。

王丽娟[16]等将源自小麦的抗逆基因TaLea3整合到丹参基因组中,并对转基因丹参进行耐逆性实验分析,结果表明,转基因丹参植株提高了耐盐和耐干旱的能力。

由此可见,利用现代转基因技术将抗逆基因转入到丹参中,从而获得新型、抗逆和高品质转基因丹参,对丹参品质改良和进一步提高药用成分的产量具有重要意义和广阔的应用前景。

3、丹参次生代谢产物基因工程

植物次生代谢产物基因工程是指利用基因工程技术对植物次生代谢途径的遗传特性进行修饰或改造，进而改变目标次生代谢物质的量。

目前,该类研究主要包括代谢关键酶基因工程及其转录因子或调节基因的基因工程两个方面通过基因工程途径，提高控制某一特定次生代谢物合成的限速酶活性或在植物中引入新的次生代谢物合成途径，可提高转基因植物目标次生代谢物的量和合成全新的外源次生代谢产物。

为了能将植物次生代谢产物基因工程技术也应用于丹参,以便其药用活性成分能更进一步积累,了解丹参药用活性物质的代谢合成途径的分子机制及其调控模式,从分子水平上阐述丹参药用活性物质的代谢途径和积累规律成为目前研究的重点[17]。

（三）丹参毛状根培养

利用丹参的无菌苗作为试验材料，用发根农杆菌15834直接感染的方式进行Ri-质粒转化诱导毛状根。

将所获的丹参毛状根先在固体67V-培养基上进行继代培养使之增殖。

丹参毛状根10g球状气升式反应器培养时，将整个反应器装置连结好后用0.12Mpa,120℃高压蒸气灭菌20min冷却后于超净工作台上接入3.68g的丹参毛状根，并加入7500ml经121℃高压蒸气灭菌20min后冷却至室温的67V-液体培养基。

反应器的通气量为0.05vvm三角瓶培养是采用1000ml玻璃三角瓶，内装250ml67V-液体培养基。

三角瓶培养培养基的灭菌方法及毛状根接种方法与球状气升式反应器培养时相同，接种量为0.12g，在转速为150rmp/min的摇床上进行振荡培养。

所有培养工作都在25℃和弱光下进行[18]。

（四）丹参的多倍体育种

1、化学诱导异源多倍体将已鉴定为杂交种的代株系作为材料,诱导多倍体的培养基为MS,添加5,15,30,45,60μg/g5种不同浓度的秋水仙碱,25～35d后获得的愈伤组织切成0.5cm直径团块接种到MS+0.4mg/L62BA,0.1mg/LIAA的繁殖培养基上,置于（25±1）℃下光照培养1个月。

2、生根培养将试管苗从繁殖培养基上取出,分成单株或单芽接种到生根培养基（1/2MS+0.2mg/LIBA+0.1mg/LBA）上15d后即陆续长出幼根形成植株[19]。

四、目前存在的问题

（一）丹参的组织和细胞培养：

1、长期以来,有用次生代谢物的获得方法主要是从植株中提取,但是,这种方法必然会导致野生资源逐渐匮乏和灭绝。

尽管目前已经有一些重要的药用物质可以采取化学合成的方法获得,但往往存在工艺流程复杂、成本高及易污染环境等缺点,且还有不少结构复杂的物质（如人参皂苷）尚难以合成。

2、丹参细胞系培养过程中存在许多缺点诸如细胞过于分散,不易更换新鲜营养液、不易挑选优质细胞系及代谢产物与分散的细胞不易分离等,。

利用固定化技术可以克服这些缺点。

细胞经固定处理后,在培养基中收获代谢产物是可行的。

摸清丹参细胞系在不同生长时期的营养供给条件和相应的激素调节是实现用细胞培养的方法生产次生代谢产物的基础。

3、植物组织和细胞培养与微生物发酵相比,生长速度慢、活性物质产量低。

4、适合植物组织和细胞培养的生物反应器尚有待研究解决。

这里需要指出的是:

问题的关键不是受制造生物反应器工程技术的制约,而是人们对植物组织和细胞在离体培养条件下的生长与发育的规律了解甚少。

在设计生物反应器中浓度较高时,培养液成非牛顿流体,如何解决充分混合与均一供氧,如何克服剪切力对培养细胞造成的伤害等一系列设计基础理论研究课题。

5、对植物次生代谢产物合成途径及所参与反应的各种酶的了解不多,有的甚至连有效成分的化学结构尚未明确,因此对次生代谢的调控存在着很大的盲目性。

（二）丹参的基因工程：

目前,尽管国内外在丹参的基因工程研究方面已开展了大量的工作,同时也取得了令人鼓舞的成果,如丹参抗病毒基因工程和抗逆基因工程也已经逐渐开展、丹参次生代谢途径获得进一步的明确以及利用生物信息学方法分离克隆丹参功能基因也步入成熟阶段。

但是,在丹参基因过程改良研究方面仍然存在着以下几方面问题:

1、丹参水溶性及脂溶性药用活性成分生物合成途径详细过程亟待进一步明确和阐明。

目前,各功能基因在生化合成途径中的功能虽部分得到证实,但整体而言仍缺乏系统的研究,而合成代谢途径中其他一些关键酶基因也有待开发和研究。

与此同时,在利用基因工程技术对植物次生代谢途径的遗传特性进行改造,进而改变次生代谢物质在植物体中的产量方面,对丹参的研究尚属空白。

2、利用分子生物学和生物信息学方法分析丹参品质相关基因的研究工作,不管从覆盖面和基因数目方面都十分有限,基因的克隆与分析及其后续的功能鉴定都有待进一步深化,因此,更多的相关基因需要被分离和克隆。

3、对于丹参土传病害的防治仍然停留在化学农药水平,这不仅危害环境,而且会大幅度降低药材的产量和品质。

植物抗病基因工程作为一种新型、清洁的技术,正在越来越受到重视,然而目前丹参抗病基因工程研究仍然进展缓慢,利用基因工程技术培育抗病虫害的优良丹参品种具有极大的开发潜力。

五、研究发展前景与展望

自1997年,天津天士力集团生产的复方丹参滴丸首次领取美新药“绿卡”,成为世界范围内通过FDA进行新药临床开发预审的唯一治疗心血管疾病的传统植物药以来,2000年该药又成功通过俄罗斯卫生部批准的第一例治疗心血管疾病的复方天然植物的处方用药注册,获准在俄罗斯上市,这些都表明中药作为治疗药物已引起全球医药界的重视和支持,逐步为国际社会所接受。

同时,由于我国中药在国际中草药市场上的占有额仅为3%,因此丹参有广阔的国际市场前景和发展潜力。

随着丹参市场的扩大、需求量的剧增,野生丹参资源已远远不能满足市场的需求,而栽培资源只种不选的状况又使各地产丹参质量参差不齐,品质退化严重,有效成分含量低,成为丹参作为高品质植物药大规模进军国际市场的一个最大障碍。

[20]因此有必要应用植物细胞工程和基因工程等现代生物工程技术,结合和利用前人的研究成果,通过寻找优良产地、筛选和推广优良品种、提高有效成分的含量等有效措施以保证丹参药材质量的稳定性和优良性,解决丹参供求矛盾、扩大我国丹参的市场份额及保护丹参的野生资源,促进药用植物和地区经济的良性发展。

迄今为止，在丹参生物工程研究方面开展了大量的工作，丹参离体条件下的再生系统已经比较成熟、丹参细胞培养过程中的代谢产物积累规律和调控措施有了初步了解、农杆菌介导的遗传转化已有了一定基础以及对丹参酮类物质生物合成的重要前体物质和相关催化酶基因也有了新的认识，这些新的成果无疑为利用现代生物工程技术来提升丹参的科技含量，最终更好地为人类服务奠定了基础[21]。

但是要想真正利用生物技术手段来规模化生产丹参酮类药用活性物质及培育高产优质抗逆的丹参新型品系，还有不少研究工作需要开展，具体如下：

（1）进一步了解丹参酮类物质生物合成的详细过程，阐明其生物合成的代谢规律和分子机理；

（2）借鉴模式植物如拟南芥及水稻等基因组研究的最新成果，将分子生物学和生物信息学相结合，加快丹参品质相关基因的分离克隆与功能鉴定；（3）充分利用成熟的转基因技术，大规模开展丹参的遗传转化工作，进行有针对性的遗传改良。

随着丹参生物工程研究的不断深入，相信在不远的将来，利用现代生物工程技术大规模、高效率、低成本地生产丹参活性成分的目标一定能够实现。