植物组织培养实验指导共9页word资料.docx

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植物组织培养实验指导共9页word资料

《植物组织培养》实验指导

与当今“教师”一称最接近的“老师”概念，最早也要追溯至宋元时期。

金代元好问《示侄孙伯安》诗云：

“伯安入小学，颖悟非凡貌，属句有夙性，说字惊老师。

”于是看，宋元时期小学教师被称为“老师”有案可稽。

清代称主考官也为“老师”，而一般学堂里的先生则称为“教师”或“教习”。

可见，“教师”一说是比较晚的事了。

如今体会，“教师”的含义比之“老师”一说，具有资历和学识程度上较低一些的差别。

辛亥革命后，教师与其他官员一样依法令任命，故又称“教师”为“教员”。

教师：

任峻

要练说，先练胆。

说话胆小是幼儿语言发展的障碍。

不少幼儿当众说话时显得胆怯：

有的结巴重复，面红耳赤；有的声音极低，自讲自听；有的低头不语，扯衣服，扭身子。

总之，说话时外部表现不自然。

我抓住练胆这个关键，面向全体，偏向差生。

一是和幼儿建立和谐的语言交流关系。

每当和幼儿讲话时，我总是笑脸相迎，声音亲切，动作亲昵，消除幼儿畏惧心理，让他能主动的、无拘无束地和我交谈。

二是注重培养幼儿敢于当众说话的习惯。

或在课堂教学中，改变过去老师讲学生听的传统的教学模式，取消了先举手后发言的约束，多采取自由讨论和谈话的形式，给每个幼儿较多的当众说话的机会，培养幼儿爱说话敢说话的兴趣，对一些说话有困难的幼儿，我总是认真地耐心地听，热情地帮助和鼓励他把话说完、说好，增强其说话的勇气和把话说好的信心。

三是要提明确的说话要求，在说话训练中不断提高，我要求每个幼儿在说话时要仪态大方，口齿清楚，声音响亮，学会用眼神。

对说得好的幼儿，即使是某一方面，我都抓住教育，提出表扬，并要其他幼儿模仿。

长期坚持，不断训练，幼儿说话胆量也在不断提高。

目录

“教书先生”恐怕是市井百姓最为熟悉的一种称呼，从最初的门馆、私塾到晚清的学堂，“教书先生”那一行当怎么说也算是让国人景仰甚或敬畏的一种社会职业。

只是更早的“先生”概念并非源于教书，最初出现的“先生”一词也并非有传授知识那般的含义。

《孟子》中的“先生何为出此言也？

”；《论语》中的“有酒食，先生馔”；《国策》中的“先生坐，何至于此？

”等等，均指“先生”为父兄或有学问、有德行的长辈。

其实《国策》中本身就有“先生长者，有德之称”的说法。

可见“先生”之原意非真正的“教师”之意，倒是与当今“先生”的称呼更接近。

看来，“先生”之本源含义在于礼貌和尊称，并非具学问者的专称。

称“老师”为“先生”的记载，首见于《礼记?

曲礼》，有“从于先生，不越礼而与人言”，其中之“先生”意为“年长、资深之传授知识者”，与教师、老师之意基本一致。

实验一参观植物组织培养实验室

实验二培养基母液配制

实验三培养基配制与灭菌

实验四植物快速繁殖培养

实验考核

一、课程的性质与任务

植物细胞工程实验技术一般包括植物细胞组织离体培养技术、细胞融合技术、细胞拆合技术、外源基因转移技术等一系列重要的基础技术。

通过实验课程的学习，实验方法立足于初学者的专业基础和一般实验室的条件，将《植物细胞组织培养技术》课程的理论知识、一般的实验技能和科学研究的初步方法融为一体。

培养学生理论联系实际、独立思考及实践动手能力。

二、实验的目的与基本要求

通过本课程的学习使学生掌握植物细胞工程技术的基本原理和实验操作方法，掌握植物细胞体外培养技术，结合科研和生产实际，提高学生分析问题、解决问题的能力。

以适应今后在教学、科研和生产开发等各方面对当代生命科学人才知识结构的需求。

在实验教学过程中，要求学生学习态度严谨，操作动作规范，观察记录耐心细致，独立思考，综合分析实验结果，充分理解后认真地完成实验报告。

09本《植物组织培养》实验考核

一、考核方式：

实验操作。

二、考核时间：

三、考核地点：

四、监考教师：

实验考核以实验操作形式进行，根据实验4或实验5实验的实验结果（失败或成功）决定实验方案，如果失败，分析失败原因，提出改进措施，在重做中进行实验操作考核，如果成功则继续下一步的实验，实施实验操作考核。

二．考核办法：

考核方法主要观察学生的实验操作是否正确，污染率是否高，并要求学生写出实验报告，总结实验中常出现的问题。

在3个课时内小组协作完成实验内容。

包括以下几个方面：

1．对实验仪器设备的选择及操作。

湿热灭菌操作过程；无菌操作过程。

2.培养基的配制

试剂的配制；母液的移取；实验配方计算。

3.培养条件的设置。

4.实验报告的规范性与科学性。

实验一参观植物组织培养实验室

一、实验的目的和要求

掌握植物组织培养实验室的设计要点和必备的仪器设备。

二、实验内容：

1.植物组织培养实验室的设计要点。

2.植物组织培养实验室必备的仪器设备。

三、需用的仪器或试剂

四、实验步骤

五、教学方式：

参观。

六、考核要求：

每小组对植物组织培养实验室各功能室的仪器设备进行有效配置。

七、实验报告要求

1.认真观察，如实记录：

记录参观实验室所用的设备。

2.说明准确，层次清晰

3.格式规范，表述科学：

用简图表示植物组织培养实验室的设计。

实验二培养基母液配制

一、实验的目的和要求

1.了解植物外植体离体培养所需各种营养成分及激素种类

2. 初步掌握培养基母液配制方法

二、实验内容：

母液配制方法，以MS培养基为例。

1．无机大量元素母液的配制

按培养基配方的需要量，将各种化合物称量扩大10倍，用粗天平称取，并分别用200ml蒸馏水溶解于400ml烧杯中，如溶解速度慢，可稍加热。

在1000ml烧杯中，按表1-1顺序依次混合已熔化合物溶液并搅拌，以免产生沉淀，用量筒定容至1000ml，倒入试剂瓶中并贴好标签。

保存于冰箱冷藏室待用。

 表1-1    MS无机大量元素母液配制         mg/L  

化合物名称    培养基配方用量       扩大10倍称量           备注

 KNO3            1900                   19000       定容于1000ml蒸馏

NH4NO3          1650                  16500       水中。

每升培养基取

MgSO4·7H2O       370                   3700       此液100ml

KH2PO4           170                   1700    

CaCl2·2H2O         440                   4400

2．无机微量元素母液配制

按培养基配方需要量，将各种化合物扩大10倍，用电子天平称取，并分别用50ml烧杯20ml蒸馏水溶解，在100ml烧杯中将上述溶液依次混合，用100ml量筒定容（药品已浓缩100倍），倒入试剂瓶中并贴好标签，保存于冰箱中。

表1-2    MS无机微量元素母液配制         mg/L

化合物名称   培养基配方用量    扩大10倍称量      备注

      MnSO4·4H2O        22.3             223    定容于100ml蒸馏

      ZnSO4·7H2O         8.6              86       水中。

每升培养基

      CuSO4·5H2O       0.025             0.25       吸此液10ml。

      H3BO3              6.2              62       

      Na2MoO4·2H2O     0.25              2.5

      KI                 0.83              8.3

CoCl2·6H2O        0.025             0.25

      3．铁盐母液配制

按培养基配方需要量，将两种药品扩大10倍，用电子天平称取，分别在50ml烧杯中溶解后，再在100ml烧杯中混合，定容于100ml量筒（浓缩100倍），倒入棕色试剂瓶（因铁盐不稳定，易分解）中，贴上标签，置于冰箱中保存。

         表1-3      铁盐母液配制             mg/L

      化合物名称   培养基配方用量     扩大10倍称量      备注

   FeSO4·7H2O        27.8              278        定容至100ml

  Na2–EDTA         37.3              373        每次取用10ml

4．有机母液母液配制

按培养基配方需要量，将各种化合物扩大10倍，用电子天平称取，分别用50ml烧杯20ml蒸馏水溶解，在100ml烧杯中依次混合，100ml量筒定容（浓缩100倍），倒入试剂瓶中，贴上标签，置于冰箱冷藏备

表1-4       有机物母液配制            mg/L

 化合物名称   培养基配方用量    扩大10倍称量        备注

  甘氨酸                 2.0          20         定容至100ml

  盐酸硫胺素（维生素B1）   0.4           4         每升培养基取

  盐酸吡哆醇（维生素B6）   0.5           5         此液10ml

  烟酸                   0.5           5

  肌醇                  100          1000 

5．激素母液配制

各类激素用量较小，为了方便和准确，也配制成母液。

母液浓度可依需要和习惯灵活确定。

但注意各激素均不能直接用蒸馏水溶解，而用各种不同溶剂先溶解后再用蒸馏水定容。

例如2.4-D母液配制：

称取40mg2.4-D,用少量95%酒精或1NNaoH溶解后，再用蒸馏水定容至200ml，此时，该激素母液浓度为1mg/5ml。

一般地，NAA、IAA、IBA等生长素是醇溶性的，均可用少量95%酒精先溶后再蒸馏水定容，而KT、6BA、ZT等细胞分裂素可先用少量1NHCl或1NNaoH溶解后再用蒸馏水定容。

冰箱保存。

上述各种母液冰箱保存均不宜时间过长，储藏中如发现母液中出现沉淀或霉团时，应弃之。

三、需用的仪器或试剂等

1．用具器材  

电子天平（感量0.1g、0.001g）、粗天平（感量0.5g）、冰箱、烧杯（1000ml、400ml、100ml、50ml）、量筒（1000ml、100ml、50ml）、试剂瓶（1000ml、250ml、150ml）、药勺、玻璃棒等。

2．药品试剂

蒸馏水、1NHCl、1NNaOH、95%酒精、各种所需化学药品（分析纯）

四、实验步骤

确定培养基称量溶解贴标签母液分装定容保存于冰箱冷藏

五、教学方式：

教师讲解原理，示范，学生独立操作。

六、考核要求：

写出你所配制的各种母液配方。

七、实验报告要求

1．认真操作，如实记录

2．说明准确，层次清晰

3．格式规范，表述科学

实验三培养基配制与灭菌

一、实验的目的和要求

学习掌握培养基配制方法与灭菌操作。

二、实验内容：

1．培养基配制 

2．培养基灭菌

三、需用的仪器或试剂

1．用具器材

电子天平、高压灭菌锅、PH仪、塑料量杯、烧杯（500ml、100ml）、量筒（100ml、25ml、10ml）、移液管（5ml、1ml）、三角瓶（50ml）、玻璃棒、药勺、pH试纸（5.4-7.4）、橡皮吸球、橡皮筋、吸水纸、羊皮纸、防潮纸

2．药品试剂

蒸馏水、蔗糖、琼脂、1NNaOH、1NNCl、各种培养基母液。

四、实验步骤

1．培养基配制  （以MS1升培养基为例）

（1）称琼脂7g（琼脂浓度0.7-0.8﹪）溶于2/3或一半以上所需培养基体积即700ml左右的蒸馏水中，用电饭锅（或微波炉）煮融。

另称取蔗糖30g（糖浓度3%），待琼脂完全煮融断电后趁热加入，并搅拌使之溶解。

煮琼脂的同时，可用量筒或移液管依次量取各种母液混合于一烧杯中：

无机大量母液100ml，无机微量、有机物、铁盐母液各10ml，激素母液种类及取量依不同培养基配方临时确定。

（2）将上述两种液体混合，并用蒸馏水定容为1000ml。

    用1NNaOH或1NNCl调pH值至5.8，调时应不断用玻璃棒搅动，并用PH仪或pH试纸测试。

（3）趁热将培养基分装于约30个三角瓶（50ml）中，每瓶约30ml。

分装时应避免把培养基倒在瓶口上，否则易引起杂菌污染。

（4）用羊皮纸、橡皮筋封口，并可在纸盖上用铅笔写明培养基代号。

2．培养基灭菌

把分装好的培养基、无菌水及无菌纸放入高压灭菌锅内，锅外层加水后，拧紧锅盖，关闭放气阀和安全阀，接通电源，开始加热，当温度上升指针移至0.5kg/cm时，开气阀排除冷气，使压力表指针复零位，按同样方法再排一次冷气，关好放气阀继续加热至1.1-1.2kg/cm时，保持该压力15-20分钟（温度为121-126℃）后切断电源，打开放气阀，慢慢放热气，锅内蒸汽完全放出，气压归零后打开锅盖，趁热将培养基取出，待冷却后使用。

五、教学方式：

教师讲解原理，示范，学生独立操作。

六、考核要求：

请写出你所配置培养基的主要步骤和过程

七、实验报告要求

1．规范操作，如实记录

2．说明准确，层次清晰

3．格式规范，表述科学

实验四 植物器官愈伤组织的诱导、增殖、分化

第一步：

愈伤组织的诱导

一、实验的目的和要求

1．了解无菌培养对实验材料消毒、接种的要求

2．初步掌握植物外植体材料灭菌方法及接种操作技术

3．了解外植体愈伤组织诱导过程

二、实验内容

1．接种前准备

2.培养材料灭菌

3．接种

4.培养与观察

三、需用的仪器或试剂

1．用具器材

超净工作台、枪形镊、解剖刀、酒精灯、酒精缸、玻璃记号笔、脱脂棉、火柴、加盖小烧杯、废液杯、刀片

2．药品试剂

70%酒精、灯用酒精、0.1%升汞溶液、已灭菌培养基及无菌水、无菌纸

3．实验材料

新鲜胡萝卜或水稻稻种（带谷壳）等

四、实验步骤

1．接种前准备

（1）按本实验目的事先配好培养基

胡萝卜愈伤组织诱导培养基：

MS+2.4-D2mg/L+KT0.2mg/L

其他接种材料培养基：

MS+2.4-D2mg+6BA0.2mg

（2）接种室准备 打开超净工作台开关（接种前开机15-30分钟），拖地板减低室内灰尘，台内用70%酒精棉球擦拭干净（或喷雾消毒），台面上放置以下用具：

酒精灯、70%酒精缸、酒精棉球瓶、加盖小烧杯、废液杯、枪式镊子、解剖刀、无菌水、无菌纸、培养基、新鲜材料。

2.培养材料灭菌

培养材料灭菌，是组培技术中的重要环节，一方面要考虑灭菌剂的杀伤效力，同时，也要考虑植物材料的受损情况。

所以灭菌时间长短很重要。

灭菌时，将选出的健壮无病、幼嫩的茎叶材料稍处理至能放入加盖小烧杯中，玉米将籽粒剥下、胡萝卜用刀片刮去皮切成小块、水稻剥去谷壳后均放入小烧杯中，倒入升汞盖盖灭菌10分钟（具体时间依材料而定），其间稍加摇动以充分灭菌。

也可在此之前先用70%酒精浸30秒或1分钟表面消毒后，再用升汞灭菌。

10分钟后，倒去升汞溶液，用无菌水反复冲洗材料3遍以上，将升汞溶液及废水倒入废液杯中。

3．接种

（1）接种前用肥皂洗手（穿工作服，戴口罩和工作帽），然后用70%酒精棉球擦手表面消毒。

（2）将超净工作台上三角瓶的封口橡皮筋打开，整齐排列在接种台左侧。

（3）点燃酒精灯，将所用镊子、刀在酒精缸内沾以70﹪酒精后，在酒精灯火焰上灼烧灭菌，灼烧灭菌后放在支架上以防再污染。

在整个接种过程中，应每隔一段时间便将刀、镊子沾酒精灼烧一下灭菌，冷却后再用。

（4） 用镊子打开无菌纸包装，夹出几张无菌纸置于台中央。

（5） 外植体处理：

用无菌镊子取出外植体，置于纸上吸水并进行切割。

茎段切成1cm左右长，嫩叶切成1cm2大小。

玉米粒用无菌解剖刀和镊子轻轻剥去果皮（也是种皮），小心切下胚（白色），去掉胚乳（黄色）。

水稻完整籽粒在无菌纸上沥干水分即可。

胡萝卜块用解剖刀切成一系列1mm左右厚的薄片，每片切成通过形成层的5mm见方的小块，这样每块外植体都包含韧皮部、形成层和木质部三部分，其外植体大小及厚度尽量一致。

（6） 在酒精灯上方，左手握住三角瓶，右手轻轻打开并拿掉包头纸，将纸盖外面朝上置于台面上。

右手用镊子将茎段、叶或胡萝卜片平摆放于培养基表面，玉米胚或水稻籽粒平放或斜插均可，轻轻按住外植体使其接触培养基。

注意接种材料要摆放均匀且保持一定密度，完毕后将三角瓶瓶口在酒精灯火焰上灼烧一下，然后用瓶盖封口，扎好橡皮筋，并用玻璃记号笔在瓶下方注明材料代号、培养基代号、接种日期及姓名等。

（7） 将培养基放入培养室指定培养架上培养。

注意：

在超净工作台上接种时，应尽量避免说笑，打喷嚏。

打开包头纸时，注意不要污染瓶口，并进行瓶口灭菌。

另外还应注意，手臂切勿从培养基、无菌材料、切割用的无菌纸、接种器械上方经过，以避免再度污染。

4.培养与观察

接种后一周内，如有污染情况即可观察到，真菌污染菌丝清晰可见，呈黑、白各色。

如细菌污染，为粉红、白色或黄色粘稠菌斑，发现污染应及时转移未污染材料或处理掉。

未污染培养2-4周后，可在外植体或其切口处观察到已长出的疏松呈颗粒状愈伤组织。

五、教学方式：

讲授主要的注意事项，示范接种的过程，学生动手操作。

六、考核要求：

记录接种情况并统计愈伤组织出愈率及污染情况。

七、实验报告要求

1．认真观察，如实记录：

污染情况把污染类型分开统计。

2．说明准确，层次清晰

3．格式规范，表述科学

第二步：

愈伤组织的增殖

一、实验的目的和要求

了解愈伤组织离体条件下增殖过程及条件。

二、实验内容

将水稻种胚诱导产生的愈伤组织或胡萝卜根外植体产生的愈伤组织在无菌纸上切割成5×5mm大小，转移至愈伤组织增殖培养基上培养。

三、需用的仪器或试剂

1．用具器材

超净工作台、枪式镊子、解剖刀、酒精灯、酒精缸、记号笔、脱脂棉、火柴、刀片

2．药品试剂

70%酒精、灯用酒精、0.1%升汞溶液、无菌纸、无菌水、已配制好的培养基（以下培养基配方供参考）

愈伤组织增殖培养基：

MS+2，4-D0.5mg/L+CH500mg/L+3%蔗糖+0.7%琼脂

 3．实验材料

各类已诱导产生的愈伤组织

四、实验步骤

1.增殖培养基的配制与灭菌

2.接种

3.培养与观察

五、教学方式：

学生动手操作。

六、考核要求：

记录每瓶培养基接种材料名称、外植体数，2-3周后统计愈伤组织生长情况。

七、实验报告要求

1．认真观察，如实记录：

愈伤组织生长情况用照片展示出现的各种典型状况。

2．说明准确，层次清晰

3．格式规范，表述科学：

用表格统计统计愈伤组织生长情况。

第三步：

愈伤组织的分化

一、实验的目的和要求

了解愈伤组织离体条件下形态发生、器官再生作用。

二、实验内容：

1．茎芽分化

2．胚胎发生

三、需用的仪器或试剂

1．用具器材

超净工作台、枪式镊子、解剖刀、酒精灯、酒精缸、记号笔、脱脂棉、火柴、刀片

2．药品试剂

70%酒精、灯用酒精、0.1%升汞溶液、无菌纸、无菌水、已配制好的培养基（以下培养基配方供参考）

水稻茎芽分化培养基：

MS+6BA2mg/L

胡萝卜胚胎发生培养基：

MS无激素培养基

MS+2.4-D5mg/L （对照）

3．实验材料

各类已增殖培养的愈伤组织

四、实验步骤

1．茎芽分化

将水稻种胚诱导产生的愈伤组织（或已继代）在无菌纸上切割成5×5mm大小，转移至MS+6BA2mg/L培养基上诱导成芽。

2．胚胎发生

将胡萝卜根外植体产生的愈伤组织（或已经继代）分别接种于无激素和含激素2.4-D培养基上，诱导胚状体形成。

五、教学方式：

讲授与实验。

六、考核要求：

记录每瓶培养基接种材料名称、外植体数，2-3周后统计水稻外植体发芽率及胡萝卜外植体胚状体诱导率。

比较胡萝卜愈伤组织在两种培养基中的生长和分化情况。

七、实验报告要求

1．认真观察，如实记录：

胡萝卜愈伤组织在两种培养基中的生长和分化情况用照片展示。

2．说明准确，层次清晰

3．格式规范，表述科学：

设计比较胡萝卜愈伤组织在两种培养基中的生长和分化情况的表格。

实验五植物快速繁殖培养

一、实验的目的和要求

1．了解离体无性繁殖器官发生方式中器官型的特点

2．进一步熟练掌握无菌操作过程

二、实验内容：

1．接种前准备

2.培养材料灭菌

3．接种

4.培养与观察

三、需用的仪器或试剂

1．用具器材  

超净工作台、枪形镊、解剖刀、酒精灯、酒精缸、脱脂棉、火柴、废液缸、记号笔、加盖小烧杯、刀片。

2．药品试剂

70%酒精、灯用酒精、0.1%升汞溶液、无菌纸、无菌水、已配制好的培养基（MS+6BA0.5mg/L）

3．实验材料

   新鲜百合或大蒜鳞茎、油菜花苔（某些植物的花葶）、草莓等。

四、实验步骤

1．灭菌

   将实验材料的外植体用自来水冲洗干净或直接用70﹪酒精擦洗干净，再用0.1﹪升汞溶液灭菌10分钟，无菌水反复冲洗3次以上，倒去水分。

2．接种

   将实验材料灭菌后的外植体，如百合鳞片切成1cm2左右大小，接种到培养基上，注意将鳞片凹面（里面）向上。

五、教学方式：

讲授操作要点，学生独立操作。

六、考核要求：

记录每瓶培养基接种材料外植体数，2-3周后统计外植体发芽率及污染情况。

七、实验报告要求

1．认真观察，如实记录

2．说明准确，层次清晰

3．格式规范，表述科学

实验考核

一、实验的目的和要求

1.了解学生对常用仪器设备的使用情况。

2.学生掌握植物细胞组织培养基本技能和操作要领。

二、实验内容：

实施对前次失败实验改进或进行成功实验的下一步。

三、需用的仪器或试剂

超净工作台、解剖镜（实体显微镜）、显微镜、解剖镊（针）、枪形镊、普通尖镊、酒精灯、酒精缸、各种玻璃器皿、记号笔、脱脂棉、火柴等。

四、实验步骤

1.根据实验操作内容，自己选取所需仪器设备及材料。

2.独立规范的完成实验操作。

五、教学方式实验操作。

六、考核要求：

实验设计（30分）、实验过程与方法（30分）、实验的科学精神与态度（20分）、实验效果与改进（20分）。

七、实验报告要求：

口述实验报告的基本模式。

六、实验教材及主要参考资料

教材：

《植物组织培养技术》，刘振祥廖旭辉，化学工业出版社，2019年7月第一版.

主要参考资料：

1.《高等植物组织离体培养的形态建成及其调控》黄学林李筱菊主编1995年，科学出版社

2.《植物细胞工程实验技术》孙敬三桂耀林主编1995,科学出版社

3．《植物体细胞胚胎发生的分子生物学》崔凯荣戴若兰主编，2000年12月，科学出版社

4.《植物原生质体培养和遗传操作》许智宏、卫志明主编2019年，上海科学技术出版社