整理蛋白纯化protocol.docx

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整理蛋白纯化protocol

常见的实验注意事项

●贵重的亲和层析树脂经常发生结块该怎么办？

可用0.1NNaOH/0.1%SDS洗结块

●Ni-chelating错用DTT后发生黑色沉淀该怎么办？

尽快用0.1NHCl冲洗

●Nandrop:

帐号李大伟老师（lidw）密码：

62732710

●自己的超声波：

用大10头,功率600W；用小3头,功率不大于200W

●如果pcr不成功,可能是pfu出了问题，也许是pfu没有活力（太多，太少或者buffer不对）

●做酶切回收的质粒一定要用kit提

●质粒连不上可能是胶回收问题，最好加异丙醇，终浓度可达50％

●做SDS-PAGE的30％丙烯酰胺一定要过滤

●蛋白质离心浓缩一定要用水平转子

●蛋白质纯化一定用milliQ的水，最好每步都加1mMDTT

●所有的FPLC柱子和填料一定要用20%乙醇保存

●monoQ结合蛋白质洗脱不下来,可能都被monoQ吸附上杂质或长菌,可能是柱子上滤膜出了问题

MonoQ洗柱子的方法:

（实在不行重新灌柱）isopropanol10vol；1MNaCl10vol；0.5MHCl,饱和EDTA,0.5%triton,一些CTAB,10vol；1MNaCl10vol；0.0MNaCl10vol每周都要洗一次

Superpose6洗柱子的方法:

（实在不行重新灌柱）isopropanol10vol；1MNaCl10vol；0.5MHCl,饱和EDTA,0.5%triton,一些CTAB,10vol；1MNaCl10vol；0.0MNaCl10vol

pH8调到用1M溶液调pH值pH6.01:

4,一般是1:

10

pet15b加上MetMGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM共21个氨基酸

pet32b除去trxMHHHHHHSSGLGGENLYFQGS共21个氨基酸

300ml10NNaOH非精制胰蛋白胨/L

370ml10NNaOH精制胰蛋白胨

Trx:

14.6kDapI5.9

Tev：

pI8.5

◆可溶于碱的污染物

0.1mol/LNaOH洗涤Milli-Q纯化的蒸馏水洗涤结合缓冲液洗涤

可以除去诸如脂类、蛋白质和核酸这类的污染物。

◆对于疏水性污染物

乙醇溶液（如70%的乙醇）或非离子型的去污剂洗涤

可以除去脂类和其他的疏水性物质。

◆金属污染物

EDTA饱和的10mmol/LHCl（即pH=2）处理柱子

◆沉淀物杂质

去污剂、尿素和盐酸胍，可将柱子在6mol/L的尿素中平衡和温育，然后用去离子水和缓冲液洗涤

Centrifugesamplestoavoidtheriskofnon-specificbindingofthetargetmoleculetoa

filter.Samplessuchasserumcanbefilteredthroughglasswooltoremoveremaininglipids.

Non-specificcause:

proteinsbindingtomediumand/ortotheplastictubesorthepresence

ofproteinaggregatesthatco-precipitatewiththeimmunecomplex

ItisreportedthatCHAPSstabilizesGRandpreventsnon-specificadsorptionofGRtotubesandmono-beads[6and7.T.M.Fletcher,B.S.Warren,C.T.BaumannandG.L.Hager.MethodsMol.Biol.176（2001）,p.55.FullTextviaCrossRef|ViewRecordinScopus|CitedByinScopus

（1）7].

载体：

7.5ul

NEBbuffer21ul

BSA0.25ul

T4dnapol0.25ul

100mmdttp0.5ul

100mmDtt0.5ul

反应体系于22℃30min后，75℃20min将酶灭活。

（另：

一个文献上没有说明的优点，NEBT4DNAPOL在普通的限制性内切酶Buffer中的活性为100%，也就是说，载体酶切后不用乙醇沉淀，就可以直接用于T4处理，简化了实验流程，节省时间pfu也可以，

实验室协议

前期工作

1．进www.rcsb.org查是否已经有结构发表，特别注意unreleased部分

2．进cn.expasy.org搜索目标基因，输入基因名，找出对应的种属

把之下载，看看这个蛋白质的基本性质，如是否有发表的结构、功能、是否有跨膜区、所含的domain（可以进入InterPro、pfam和smart看看）、氨基酸序列、mRNA或genomicDNA序列等。

3．找出蛋白所对应的mRNA序列

如果基因是从别人获得，直接向别人要mRNA序列或DNA序列

如果基因是从库中PCR获得，那么从ncbi（http:

//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?

db=gene）中输入基因名，找出对应的种属。

点击进入，里面有很多文献，介绍内容比较全面，找出mRNAandProtein（s）点击找出mRNA序列或genomicDNA序列

结构预测

1cn.expasy.org中找出Proteomicsandsequenceanalysistools

下的Secondary

里面的内容很全，有计算ComputepI/Mw计算等电点和分子量

PeptideCutter预测蛋白酶可能的酶切位置

Tertiarystructureprediction

在我们关心的Secondarystructureprediction下

主要是PSIpred最有名，也是最常用的

当然还有PredictProtein也偶尔用一下

2.另外一个预测的站点：

http:

//bioinf.cs.ucl.ac.uk/dompred/DomPredform.html

这个站点可以预测蛋白质的各个domain的可能位置，可以大概告诉我们在哪里把蛋白切掉比较合适，里面的结果也含有PSIpred的结果。

1.进www.rcsb.org查是否有发表的结构时，发现有很多没有unreleased部分。

这是否代表结构已经解出，我要放弃这个蛋白？

 差不多可以这么说。

不过还要看情况，如果别人解出的蛋白质仅是部分序列，那如果做别的片段或者全长就可以做。

 还是就是如果做复合物也还是可以做。

        2.很多蛋白查出是做了某个domain和DNA或肽段的复合物或者整个蛋白和别的蛋白某个domain的复合物，这种情况下还可以做这个蛋白的结构吗？

如果做得和别人的不一样，也是可以做的。

如果很类似的话，发文章就很难发好杂志。

       3.有些蛋白在搜索结果是Noexactmatchesfound,sofuzzysearchused，这是否代表没有做出结构？

 差不多可以这么说。

3.寻找同源的结构:

http:

//www.ebi.ac.uk/blast2/index.html

在UniprotKnowledgebase中选择Proteinstructuresequence.再输入序列即可运行.

一般认为最小的E（）大于0.01（或同源性低于30％以上；有时e-20,有时也可以0.01）,就认为没有同源的结构被解出.

E（）越小,差异越小.

设计引物

我最常用的软件的generunner,下面是我按generunner的内容来介绍如何设计引物

1．实验室常用的载体：

gstmt（载体模板是pgex-4T-2,TEV，通过LIC方法连接,GSTtag,氨苄抗性）

32bmt（载体模板是pet32b,TEV，通过LIC方法连接,Histag和Trxtag,氨苄抗性）

32bsumomt（载体模板是pet32b,TEV，通过LIC方法连接,sumotag和两个Histag,氨苄抗性）

2．实验室常用的菌种：

克隆菌种：

DH5α

表达菌种：

BL21（DE3）,Rosetta2（DE3）,RosettagamiBplys（DE3）

更多的见另外一个表

3．设计primer一般是在上述的二级结构预测的基础上进行的，有点常见的要求：

a:

一般匹配的碱基18个左右，我主要是根据匹配碱基的温度大于等于54度。

温度＝A或T含量×2＋G或C含量×4

b:

把酶切位点加在匹配的碱基的5’端，注意不要错位防止产生乱码。

c:

如果不想通过T载体连接，一般要求在酶切位点外加3－4个保护碱基。

d:

要仔细查所设计的酶切位点，防止所表达的蛋白碱基也有设计的酶切位点

e:

最好在设计之后再仔细检查所有的引物一遍。

Theprotocolofexpressgene

LICProtocol

1.载体（一定要用kit提质粒,必须是从无甲基化菌种提的质粒,无dcm，dam甲基化）用STUI单酶切（bufferM,takara）,PCR产物（PCR尽量少用Taq）分别用凝胶回收（一定要回收）后，载体（可以不用凝胶回收，直接乙醇沉淀即可）重溶20-40ul,PCR重溶30-50ul.

2.pfu末端处理

Fragment（PCR）7ul

Pfu（一定是原液2.6mg/ml）0.25

dATP（10mM）takara0.5

pfuBuffer（×10无Mgcl2）1

25mMMgcl20.25

H2O1

Total10ul

72度反应30min

Fragment（Vector）7ul

Pfu（一定是原液2.6mg/ml）0.25ul

dTTP（10mM）0.5ul

pfuBuffer（×10无Mgcl2）1

25mMMgcl20.25

H2O1

Total10ul

72度反应30min

72度反应30min

3.连接

Fragment（PCR）10ul

Fragment（Vector）5ul

T4ligase0.5ul

T4ligaseBuffer2ul

H2O2.5ul

不用调pH直接连接有点，不加连接酶不行

16度放置2-20小时,加入感受态细胞DH5alpha或top10，置于冰上30min,42度热激90s,冰上放置5min,将菌液涂于相应抗性的Amp平板上。

4.把平板放置在37度培养箱中,一般培养12-20小时.挑选克隆小摇并进行验证.

5.Transformedtherightplasmidtoexpressioncell（BL21（DE3）,Rossetta（DE3）,ER2566）andexpressthetarget.

6.TheexpresscellwasaddedtoLBbuffercontaintherightresistance,andshakeat37degree.WhentheOD600reachat0.6-0.8,addIPTGtotheLBbuffermakethefinalconcentrationofIPTGis0.1-1mM,andshake3-5hat37degreeor25degreeovernight.

7.Centrifugedthecellat4000rpm15min,collecttheprecipitation.

GST蛋白的纯化方法

所有的水必须是MillQ的水!

!

!

蛋白纯化过程尽量减少泡沫

1．1/20-1/50体积的缓冲液（20mMTrispH7.3and500mMNaCl,0.1-1mg/mllysozyme，1mMDTT后加，0.1%-1%tritonX-100（一般在最后用于长晶体的蛋白时不要））搅起细胞,经常要用研磨器把大跎的菌体分散，一般加入1mMPMSF,4度放置30分钟，再4度冰上超声破碎细胞（6min,2secon,4secoff,30%功率）。

2.4度12000rpm离心1小时.如果蛋白是可溶的，收集上清。

如果不可溶，则收集沉淀，另外用别的方法处理包涵体，有时要留样跑胶。

3.对上清合并，把溶液调为TrispH7.3，可以上GSTbeads（见后面如何平衡的柱子）

4.用恒流泵循环过GSTbeads3次，每次流速约2ml/min.

5.用buffer（20mMTrispH7.3and500mMNaCl，1mMDTT）洗柱子10个柱体积，把液体流尽。

下面的方法选一个

6a.可用1-2柱体积的buffer（20mMTrispH7.3and150mMNaCl，这时pH值或盐浓度可以改变，1mMDTT），再加1/100体积的TEV蛋白酶4度过夜切。

第二天收集液体。

柱子可以用（0.1Msodiumacetate+0.5MNaCl,pH4.5）的溶液洗，或下面的溶液洗。

如果是第一次做，最好先保存，等SDS-PAGE结果出来后再说。

6b.用含10mMGSH（还原型的谷胱甘肽）的buffer（20mMTris，150mMNaCl，1mMDTT，这时一定要调pH值，保证pH值要对，因为谷胱甘肽很酸）。

如果保存的话,要加甘油至最终10-15%的甘油并保存在-86度。

最后GSTbeads保存20％乙醇中，在4度的冰箱中保存。

GSTbeads的再生方法：

washingthegelwith2-3bedvolumesofalternatinghighpH（0.1MTris-HCl+0.5MNaCl,pH8.5）andlowpH（0.1Msodiumacetate+0.5MNaCl,pH4.5）buffers.Thiscycleshouldberepeated3times

GSTbeads的平衡方法：

equilibrationwith3-5bedvolumesof缓冲液（20mMTrispH7.3and500mMNaCl,1mMDTT）

His蛋白的纯化方法

所有的水必须是MillQ的水!

!

!

蛋白纯化过程尽量减少泡沫

1．1/20-1/50体积的缓冲液（20mMTrispH8.0and500mMNaCl,0.1-1mg/mllysozyme，5-20mM咪唑，0.1%-1%tritonX-100（一般在最后用于长晶体的蛋白时不要））搅起细胞,经常要用研磨器把大跎的菌体分散，一般加入1mMPMSF,4度放置30分钟，再4度冰上超声破碎细胞（6min,2secon,4secoff,30%功率）。

2.4度12000rpm离心1小时.如果蛋白是可溶的，收集上清。

如果不可溶，则收集沉淀，另外用别的方法处理包涵体。

3.对上清合并，一般情况下不用调溶液的pH值，可以上已经平衡好的Hisbeads（见后面的平衡方法）

4.用恒流泵循环过Hisbeads3次，流速约2ml/min.

5.用buffer（20mMTrispH8.0and500mMNaCl，20mM咪唑）洗柱子10个柱体积，把液体流尽。

这一步骤从实验的结果来看还是要的.

6.用buffer（20mMTrispH8.0and500mMNaCl，60mM咪唑这个浓度可以改）洗柱子10个柱体积，把液体流尽。

有时这个步骤会洗下目标蛋白。

7.用buffer（20mMTrispH8.0,（这时pH可以根据蛋白质的等电点改变）,150mMNaCl，250mM－500mM咪唑）或者用不含咪唑的、低pH如4的溶液或者EGTA或EDTA洗脱洗脱柱子1－2个柱体积，收集保存。

8.最好通过浓缩的办法把上述收集液体中的咪唑去掉.如果保存的话,要加甘油至最终10-15%的甘油并保存在-86度.

最后Hisbeads保存20％乙醇中，在4度的冰箱中保存。

Hisbeads的再生方法：

washingthegelwith2-3bedvolumesof50mMEDTA溶液至beads完全变为白色,接着用2-3bedvolumesof水洗，再加2-3bedvolumesof50mMNiCl2溶液beads完全变为兰色.

Hisbeads的平衡方法：

equilibrationwith3-5bedvolumesof缓冲液（20mMTrispH8.0and500mMNaCl,1mMDTT）

破细胞溶液:

20mMTrispH8,0.5%triton,10mM咪唑500mMNaCl,没有加pmsf.用60mm咪唑,20mMTrispH8,500mMNaCl漂洗,最后用20mMTrispH8,250mM咪唑,300mMNaCl洗脱;浓缩时一定加盐

所有的水必须是MillQ的水!

!

!

如果是TA克隆转的T载体，平板不长菌，一般有几种原因：

1、感受态的转化效率；

2、操作的原因

3、SOC培养基

4、抗性是否正确

你可以参考以上几点找找原因。

片段加A后需要进行纯化，纯化在与载体连接。

4、取10ul连接产物（如果做电转化，连接产物需要纯化）加入至100ul化学转化感受态细

胞（DH5α或JM109等感受态细胞，转化效率在5×106cfu/ugpUC19DNA以上）中冰浴

15分钟。

5、42度热击70-90秒（根据离心管厚薄调整时间）后，再在冰浴15分钟。

6、加入890ulSOC培养基，37℃振荡（150rpm/min）培养1小时

2、为什么PCR产物难以插入载体？

A、确认PCR反应使用的Taq酶在PCR产物的3’端是否附加了“A”。

高保真Taq酶扩增

的PCR产物是平端，不能直接用于TA克隆；PCR产物保存时间不要过长，长时间保存

的PCR产物会脱去末端的“A”碱基。

B、胶回收时PCR产物不要在紫外线下暴露时间太长。

C、确认感受态细胞的转化效率，使用的感受态细胞1ngpUC18质粒至少应得到1000个以

上的转化子，如有问题，重新制备感受态细胞。

D、确认抗生素使用是否正确，pBM-T载体为Amp抗性，工作浓度100ug/ml。

E、最好使用新配制的平板培养基。

F、连接中使用了不恰当的载体：

插入片段比例，对于极小的PCR产物进行克隆，很可能

因为PCR产物严重过量，导致无菌落或菌落极少

存放：

超级感受态细胞必须从干冰运送包装箱取出直接放入–80°C冰箱的底部。

一定不要用液氮来存感受态细胞。

存放条件：

超级感受态细胞对微小的温度改变也极度敏感，因此必须存放在–80°C冰箱的底部。

即使是将细胞从一个冰箱转移到另一个冰箱也会导致转化效率的损失。

采用BDFalcon的14ml聚丙烯圆底试管：

在转化实验中使用圆底14-mlBDFalcon聚丙烯试管（货号#352059）也是关键之一。

一般的试管容易被b-巯基乙醇降解。

而极为重要的热激步骤的操作也是根据这种型号的试管优化的。

分装细胞：

分装细胞时务必保持置于冰上。

将聚丙烯管放置在冰上等待细胞融化，分装的细胞装入预冷的试管中。

而且，每次转化都用100ml细胞也很重要，减少细胞体积必定减少转化效率。

使用b-巯基乙醇（b-ME）:

已经证明b-ME可以帮助提高转化效率。

Stratagene提供的b-ME已经过稀释，可以直接使用。

其它来源的b-ME使用时请参考相关文献。

使用NZY+肉汤：

Stratagene的超级、高级感受态细胞在热激处理后用NZY+培养基菌落生长最好。

用其它培养基替代往往会造成效率降低。

Ican'tgiveamechanism,butIcantellyouthatonemajormethodofmaking

high-efficiencycompetentcells--andoneofwhichtheremanyvariants--uses

DMSOandDTTtoachievemaxiumumefficiency.Apossiblemechanismwouldbethat

_if_therewereanyperiplasmicDNases,whicharelikelytopossessdisulfide

bonds,theDTT（orBME）willinactivatethem.DTTfacilitatestheinactivation

ofextracellularRNasesforthisreason.

Add7ulDTTsolution/200ulculture,swirlandleaveonicefor5mins.

1.42Mβ-mercaptoethanol

Add1.7μlofβ-mercaptoethanolprovidedwiththiskitorafresh

1:

10dilution（ofa14.2Mstock）ofβ-mercaptoethanol[dilutedin

distilledwater（dH2O）]tothe100μlofcompetentcells,givingafinal

concentrationof25mM.

1.细胞生长状态和密度:

不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。

细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。

DH5α菌株的OD600为0.5时,细胞密度在5×107个/ml左右（不同的菌株情况有所不同）,这时比较合适。

密度过高或不足均会影响转化效率。

2.质粒的质量和浓度:

用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA（cccDNA）。

转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,