整理蛋白纯化protocol.docx

1、整理蛋白纯化protocol常见的实验注意事项 贵重的亲和层析树脂经常发生结块该怎么办？ 可用 0.1 N NaOH / 0.1% SDS 洗 结块 Ni-chelating错用DTT后发生黑色沉淀该怎么办？ 尽快用0.1 N HCl冲洗 Nandrop: 帐号 李大伟老师(li d w) 密码： 62732710 自己的超声波： 用大10头, 功率 600W；用小3头, 功率不大于 200W 如果pcr不成功,可能是pfu出了问题，也许是pfu没有活力（太多，太少或者buffer不对） 做酶切回收的质粒一定要用kit提 质粒连不上可能是胶回收问题，最好加异丙醇，终浓度可达50 做SDS-PA

2、GE的30丙烯酰胺一定要过滤 蛋白质离心浓缩一定要用水平转子 蛋白质纯化一定用milli Q的水，最好每步都加1mM DTT 所有的FPLC柱子和填料一定要用20%乙醇保存 mono Q 结合蛋白质洗脱不下来, 可能都被mono Q吸附上杂质或长菌,可能是柱子上滤膜出了问题Mono Q洗柱子的方法: (实在不行重新灌柱) isopropanol 10 vol； 1MNaCl 10 vol； 0.5M HCl, 饱和EDTA, 0.5% triton, 一些CTAB, 10 vol；1M NaCl 10 vol；0.0 M NaCl 10 vol 每周都要洗一次Superpose 6洗柱子的方法

3、: (实在不行重新灌柱) isopropanol 10 vol； 1MNaCl 10 vol； 0.5M HCl, 饱和EDTA, 0.5% triton, 一些CTAB, 10 vol；1M NaCl 10 vol；0.0 M NaCl 10 volpH 8 调到 用1M溶液调pH值 pH6.0 1:4, 一般是1:10pet 15b 加上Met MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM 共21个氨基酸pet 32b 除去 trx MHHHHHHSSGLGGENLYFQGS 共21个氨基酸300ml 10N NaOH 非精制胰蛋白胨/L370ml 10N NaOH 精制胰蛋白胨Trx: 1

4、4.6kDa pI 5.9Tev ： pI 8.5可溶于碱的污染物 0.1 mol/L NaOH洗涤 Milli-Q纯化的蒸馏水洗涤 结合缓冲液洗涤 可以除去诸如脂类、蛋白质和核酸这类的污染物。对于疏水性污染物 乙醇溶液（如70%的乙醇）或非离子型的去污剂洗涤可以除去脂类和其他的疏水性物质。金属污染物 EDTA饱和的10 mmol/L HCl（即pH=2）处理柱子沉淀物杂质去污剂、尿素和盐酸胍，可将柱子在6 mol/L 的尿素中平衡和温育，然后用去离子水和缓冲液洗涤Centrifuge samples to avoid the risk of non-specific binding of t

5、he target molecule to afilter. Samples such as serum can be filtered through glass wool to remove remaining lipids.Non-specific cause: proteins binding to medium and/or to the plastic tubes or the presenceof protein aggregates that co-precipitate with the immune complexIt is reported that CHAPS stab

6、ilizes GR and prevents non-specific adsorption of GR to tubes and mono-beads 6 and 7. T.M. Fletcher, B.S. Warren, C.T. Baumann and G.L. Hager. Methods Mol. Biol. 176 (2001), p. 55. Full Text via CrossRef | View Record in Scopus | Cited By in Scopus (1)7.载体： 7.5 ulNEB buffer 2 1ulBSA 0.25ulT4 dna pol

7、 0.25ul100mm dttp 0.5ul100mm Dtt 0.5 ul反应体系于22 30min后，75 20min将酶灭活。（另：一个文献上没有说明的优点，NEB T4 DNA POL在普通的限制性内切酶Buffer中的活性为100%，也就是说，载体酶切后不用乙醇沉淀，就可以直接用于T4处理，简化了实验流程，节省时间 pfu也可以，实验室协议 前期工作1 进 www.rcsb.org 查是否已经有结构发表，特别注意 unreleased 部分2 进 cn.expasy.org 搜索目标基因， 输入基因名， 找出对应的种属 把之下载，看看这个蛋白质的基本性质，如是否有发表的结构、功能、

8、是否有跨膜区、所含的domain（可以进入InterPro、pfam和 smart看看）、氨基酸序列、mRNA或genomic DNA序列等。3 找出蛋白所对应的mRNA序列如果基因是从别人获得，直接向别人要mRNA序列或DNA序列如果基因是从库中PCR获得，那么从ncbi (http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene) 中输入基因名， 找出对应的种属。点击进入，里面有很多文献，介绍内容比较全面，找出mRNA and Protein(s) 点击找出 mRNA序列或genomic DNA序列结构预测1 cn.expasy.org 中找

9、出 Proteomics and sequence analysis tools 下的 Secondary里面的内容很全， 有计算 Compute pI/Mw 计算等电点和分子量PeptideCutter 预测蛋白酶可能的酶切位置Tertiary structure prediction 在我们关心的 Secondary structure prediction 下 主要是 PSIpred 最有名，也是最常用的 当然还有 PredictProtein 也偶尔用一下2. 另外一个预测的站点： http:/bioinf.cs.ucl.ac.uk/dompred/DomPredform.html这个

10、站点可以预测蛋白质的各个domain的可能位置，可以大概告诉我们在哪里把蛋白切掉比较合适，里面的结果也含有PSIpred的结果。1.进 www.rcsb.org 查是否有发表的结构时，发现有很多没有unreleased 部分。这是否代表结构已经解出，我要放弃这个蛋白 ？ 差不多可以这么说。 不过还要看情况， 如果别人解出的蛋白质仅是部分序列，那如果做别的片段或者全长就可以做。还是就是如果做复合物也还是可以做。2.很多蛋白查出是做了某个domain和DNA或肽段的复合物或者整个蛋白和别的蛋白某个domain的复合物，这种情况下还可以做这个蛋白的结构吗？如果做得和别人的不一样，也是可以做的。 如果

11、很类似的话， 发文章就很难发好杂志。 3.有些蛋白在搜索结果是No exact matches found, so fuzzy search used，这是否代表没有做出结构？ 差不多可以这么说。3. 寻找同源的结构:http:/www.ebi.ac.uk/blast2/index.html在 Uniprot Knowledgebase 中选择 Protein structure sequence. 再输入序列即可运行.一般认为 最小的E()大于0.01(或同源性低于30以上；有时 e-20,有时也可以 0.01), 就认为没有同源的结构被解出.E()越小, 差异越小.设计引物我最常用的软件的

12、 generunner, 下面是我按generunner的内容来介绍如何设计引物1 实验室常用的载体：gstmt（载体模板是pgex-4T-2, TEV，通过LIC方法连接, GST tag,氨苄抗性）32bmt（载体模板是pet32b, TEV，通过LIC方法连接, His tag和Trx tag,氨苄抗性）32bsumomt（载体模板是pet32b, TEV，通过LIC方法连接, sumo tag和两个His tag,氨苄抗性）2 实验室常用的菌种： 克隆菌种： DH5 表达菌种： BL21(DE3), Rosetta 2 (DE3), Rosetta gami B plys (DE3)

13、更多的见另外一个表3 设计 primer 一般是在上述的二级结构预测的基础上进行的，有点常见的要求：a: 一般匹配的碱基18个左右， 我主要是根据匹配碱基的温度大于等于54度。 温度A或T含量2 G或C含量4b: 把酶切位点加在匹配的碱基的5端，注意不要错位防止产生乱码。c: 如果不想通过T载体连接，一般要求在酶切位点外加34个保护碱基。d: 要仔细查所设计的酶切位点，防止所表达的蛋白碱基也有设计的酶切位点e: 最好在设计之后再仔细检查所有的引物一遍。 The protocol of express geneLIC Protocol1. 载体(一定要用kit提质粒, 必须是从无甲基化菌种提的质

14、粒, 无dcm，dam甲基化)用STU I单酶切(buffer M, takara), PCR产物(PCR尽量少用Taq)分别用凝胶回收 (一定要回收)后，载体（可以不用凝胶回收，直接乙醇沉淀即可）重溶20-40ul, PCR重溶30-50ul.2. pfu末端处理Fragment(PCR) 7ul Pfu(一定是原液 2.6mg/ml) 0.25 dATP(10mM) takara 0.5 pfu Buffer(10 无Mgcl2) 1 25mM Mgcl2 0.25H2O 1 Total 10ul72度反应30minFragment(Vector) 7ulPfu（一定是原液 2.6mg/m

15、l） 0.25uldTTP(10mM) 0.5ulpfu Buffer(10 无Mgcl2) 1 25mM Mgcl2 0.25H2O 1 Total 10ul72度反应30min72度反应30min 3. 连接Fragment（PCR） 10ulFragment（Vector） 5ulT4 ligase 0.5ulT4 ligase Buffer 2ulH2O 2.5ul不用调pH直接连接有点， 不加连接酶不行16度放置2-20小时, 加入 感受态细胞DH5alpha 或top10，置于冰上30min, 42度热激90s, 冰上放置5min, 将菌液涂于相应抗性的Amp平板上。4. 把平板放

16、置在37度培养箱中,一般培养12-20小时.挑选克隆小摇并进行验证.5. Transformed the right plasmid to expression cell (BL21(DE3), Rossetta(DE3), ER2566) and express the target.6. The express cell was added to LB buffer contain the right resistance, and shake at 37 degree. When the OD600 reach at 0.6-0.8, add IPTG to the LB buffer

17、make the final concentration of IPTG is 0.1-1mM, and shake 3-5h at 37 degree or 25 degree overnight.7. Centrifuged the cell at 4000rpm 15 min, collect the precipitation. GST蛋白的纯化方法所有的水必须是Mill Q的水! 蛋白纯化过程尽量减少泡沫11/20-1/50体积的缓冲液(20mM Tris pH 7.3 and 500mM NaCl, 0.1-1mg/ml lysozyme，1mM DTT后加， 0.1%-1% tr

18、iton X-100（一般在最后用于长晶体的蛋白时不要）)搅起细胞, 经常要用研磨器把大跎的菌体分散，一般加入1mM PMSF, 4度放置30分钟，再4度冰上超声破碎细胞（6min, 2 sec on, 4 sec off, 30%功率）。2. 4度12000rpm离心1 小时. 如果蛋白是可溶的，收集上清。如果不可溶，则收集沉淀，另外用别的方法处理包涵体，有时要留样跑胶。3.对上清合并，把溶液调为Tris pH 7.3，可以上GST beads(见后面如何平衡的柱子)4. 用恒流泵循环过GST beads 3次，每次流速约2ml/min.5.用buffer(20mM Tris pH 7.3

19、and 500mM NaCl，1mM DTT)洗柱子10个柱体积，把液体流尽。下面的方法选一个6a. 可用1-2柱体积的buffer(20mM Tris pH 7.3 and 150mM NaCl，这时pH值或盐浓度可以改变，1mM DTT)，再加1/100体积的TEV蛋白酶4度过夜切。第二天收集液体。柱子可以用(0.1 M sodium acetate + 0.5 M NaCl, pH 4.5)的溶液洗，或下面的溶液洗。如果是第一次做，最好先保存，等SDS-PAGE结果出来后再说。6b. 用含10mM GSH(还原型的谷胱甘肽) 的buffer(20mM Tris，150mM NaCl，1m

20、M DTT，这时一定要调pH值，保证pH值要对，因为谷胱甘肽很酸)。如果保存的话,要加甘油至最终10-15%的甘油并保存在-86度。最后GST beads保存20乙醇中，在4度的冰箱中保存。GST beads的再生方法：washing the gel with 2-3 bed volumes of alternating high pH (0.1 M Tris-HCl + 0.5 M NaCl, pH 8.5) and low pH (0.1 M sodium acetate + 0.5 M NaCl, pH 4.5) buffers. This cycle should be repeate

21、d 3 times GST beads的平衡方法： equilibration with 3-5 bed volumes of缓冲液(20mM Tris pH 7.3 and 500mM NaCl,1mM DTT)His蛋白的纯化方法所有的水必须是Mill Q的水! 蛋白纯化过程尽量减少泡沫11/20-1/50体积的缓冲液(20mM Tris pH 8.0 and 500mM NaCl, 0.1-1mg/ml lysozyme，5-20mM 咪唑，0.1%-1% triton X-100（一般在最后用于长晶体的蛋白时不要）)搅起细胞, 经常要用研磨器把大跎的菌体分散，一般加入1mM PMSF,

22、 4度放置30分钟，再4度冰上超声破碎细胞（6min, 2 sec on, 4 sec off, 30%功率）。2. 4度12000rpm离心1 小时. 如果蛋白是可溶的，收集上清。如果不可溶，则收集沉淀，另外用别的方法处理包涵体。3.对上清合并，一般情况下不用调溶液的pH值，可以上已经平衡好的His beads(见后面的平衡方法)4. 用恒流泵循环过His beads 3次，流速约2 ml/min.5.用buffer(20mM Tris pH 8.0 and 500mM NaCl，20mM 咪唑)洗柱子10个柱体积，把液体流尽。这一步骤从实验的结果来看还是要的.6.用buffer(20mM

23、Tris pH 8.0 and 500mM NaCl，60mM 咪唑这个浓度可以改)洗柱子10个柱体积，把液体流尽。有时这个步骤会洗下目标蛋白。7.用buffer(20mM Tris pH 8.0,(这时pH可以根据蛋白质的等电点改变), 150mM NaCl，250mM500mM 咪唑)或者用不含咪唑的、低pH如4的溶液或者EGTA或 EDTA洗脱 洗脱柱子12个柱体积，收集保存。8. 最好通过浓缩的办法把上述收集液体中的咪唑去掉.如果保存的话,要加甘油至最终10-15%的甘油并保存在-86度.最后His beads保存20乙醇中，在4度的冰箱中保存。His beads的再生方法：washi

24、ng the gel with 2-3 bed volumes of 50mM EDTA溶液至beads完全变为白色, 接着用2-3 bed volumes of水洗，再加2-3 bed volumes of 50mM NiCl2溶液beads完全变为兰色.His beads的平衡方法： equilibration with 3-5 bed volumes of缓冲液(20mM Tris pH 8.0 and 500mM NaCl,1mM DTT)破细胞溶液: 20mM Tris pH 8, 0.5% triton, 10mM 咪唑 500mM NaCl, 没有加 pmsf. 用60mm咪唑,

25、 20mM Tris pH 8, 500mM NaCl 漂洗, 最后用 20mM Tris pH 8, 250mM 咪唑,300mM NaCl洗脱; 浓缩时一定加盐所有的水必须是Mill Q的水!如果是TA克隆转的T载体，平板不长菌，一般有几种原因：1、感受态的转化效率；2、操作的原因3、SOC培养基4、抗性是否正确你可以参考以上几点找找原因。片段加A后需要进行纯化，纯化在与载体连接。4、 取10ul 连接产物（如果做电转化，连接产物需要纯化）加入至100ul 化学转化感受态细胞（DH5或JM109 等感受态细胞，转化效率在5106 cfu/ug pUC19 DNA 以上）中冰浴15 分钟。5

26、、 42 度热击70-90 秒（根据离心管厚薄调整时间）后，再在冰浴15 分钟。6、 加入890 ul SOC 培养基，37振荡 ( 150rpm/min ) 培养1 小时2、 为什么PCR 产物难以插入载体？A、 确认PCR 反应使用的Taq 酶在PCR 产物的3端是否附加了“A”。高保真Taq 酶扩增的PCR 产物是平端，不能直接用于TA 克隆；PCR 产物保存时间不要过长，长时间保存的PCR 产物会脱去末端的“A”碱基。B、 胶回收时PCR 产物不要在紫外线下暴露时间太长。C、 确认感受态细胞的转化效率，使用的感受态细胞1ng pUC18 质粒至少应得到1000 个以上的转化子，如有问题

27、，重新制备感受态细胞。D、 确认抗生素使用是否正确，pBM-T 载体为Amp 抗性，工作浓度100ug/ml。E、 最好使用新配制的平板培养基。F、连接中使用了不恰当的载体：插入片段比例，对于极小的PCR 产物进行克隆，很可能因为PCR 产物严重过量，导致无菌落或菌落极少存放：超级感受态细胞必须从干冰运送包装箱取出直接放入80C冰箱的底部。一定不要用液氮来存感受态细胞。存放条件：超级感受态细胞对微小的温度改变也极度敏感，因此必须存放在80C冰箱的底部。即使是将细胞从一个冰箱转移到另一个冰箱也会导致转化效率的损失。采用BD Falcon 的14ml聚丙烯圆底试管：在转化实验中使用圆底14-ml

28、BD Falcon聚丙烯试管（货号 #352059）也是关键之一。一般的试管容易被b-巯基乙醇降解。而极为重要的热激步骤的操作也是根据这种型号的试管优化的。分装细胞：分装细胞时务必保持置于冰上。将聚丙烯管放置在冰上等待细胞融化，分装的细胞装入预冷的试管中。而且，每次转化都用100 ml细胞也很重要，减少细胞体积必定减少转化效率。使用b-巯基乙醇(b-ME): 已经证明b-ME可以帮助提高转化效率。Stratagene提供的b-ME已经过稀释，可以直接使用。其它来源的b-ME使用时请参考相关文献。使用NZY+ 肉汤：Stratagene的超级、高级感受态细胞在热激处理后用NZY+ 培养基菌落生长

29、最好。用其它培养基替代往往会造成效率降低。I cant give a mechanism, but I can tell you that one major method of makinghigh-efficiency competent cells-and one of which there many variants-usesDMSO and DTT to achieve maxiumum efficiency. A possible mechanism would be that_if_ there were any periplasmic DNases, which are li

30、kely to possess disulfidebonds, the DTT (or BME) will inactivate them. DTT facilitates the inactivationof extracellular RNases for this reason.Add 7 ul DTT solution/200 ul culture, swirl and leave on ice for 5 mins.1.42 M -mercaptoethanolAdd 1.7 l of -mercaptoethanol provided with this kit or a fres

31、h1:10 dilution (of a 14.2 M stock) of -mercaptoethanol diluted indistilled water (dH2O) to the 100 l of competent cells, giving a finalconcentration of 25 mM.1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于的培养菌，最好从70或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,