腺病毒包装注意事项.docx

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腺病毒包装注意事项

在293细胞中大量扩增腺病毒

一旦重组病毒已被纯化和鉴定，即可在293细胞中进行大量扩增。

本手册提供了递增培养规模和腺病毒感染周期的基本方法，按这一方法最终得到的病毒量约为3×1011～3×1012。

由于一个细胞中所含的病毒颗粒为1000～10000，因此1L培养细胞可得到约5×1012病毒颗粒。

如果要把病毒用氯化铯梯度离心纯化，则必须至少3×108的细胞，这样才能正确分辨出病毒带。

对于蛋白表达，则根据需要可在任何一步扩增步骤中停止，离心沉淀细胞后按照适当的操作方法进行蛋白抽提（根据蛋白类型的不同抽提上清或细胞沉淀）。

为优化时间进程，每个感染周期必须与下一次细胞扩增培养同步。

如果由于各种原因不能同步，则必须将病毒冻存，直至下一次细胞培养开始后再融化病毒。

注意每次扩增都将会剩下一些病毒，这些病毒先不必丢弃，以便下一步扩增失败时备用。

每次扩增最好都用最低代的病毒颗粒，这样产生突变型病毒的可能性会大大降低。

操作步骤：

1在100mm培养皿或75cm2培养瓶中加入10mlDMEM5%培养5×106293细胞。

2取0.5ul首次扩增的病毒保存液，加入DMEM5%至1ml，混匀，这样稀释得到的MOI值约为5。

3移去培养液，小心加入病毒混合液，切勿破坏细胞单层，十字形慢慢晃动3次，37℃CO2孵箱中培养90分钟。

4加入9mlDMEM5%。

5再培养72小时，这时在10ml溶液中大约有5×109～5×1010个病毒颗粒，进行MOI测定以估计病毒颗粒。

注：

如果此时得到的病毒量已足够，可立即进行病毒滴度测定。

收集细胞，600×g离心5分钟沉淀细胞，去上清后加入最小体积（一般为原始体积的1/10即1ml）病毒保存溶液重悬细胞。

-200C/370C冻融3次，台式离心机上以最大速率离心去除细胞碎片，收集上清，然后进行病毒滴定。

1-20℃/37℃冻融3次。

2转入15ml无菌离心管中，台式离心机上以最大速率离心10分钟，收集上清冻存于-20℃或-80℃。

33个175cm2培养瓶中各加入107293细胞进行培养。

4将3ml细胞裂解液上清加入12mlDMEM5%中，混匀。

移去细胞培养液，每瓶小心加入5ml混合液，十字形慢慢晃动混匀3次，370C5%CO2孵箱中培养90分钟。

此时MOI值约为25。

5加入DMEM5%至30ml。

6再培养48～72小时。

此时10ml培养液病毒量约为3×1010～3×1011。

若需要，进行MOI测定以估计病毒滴度。

注：

如果此时病毒量已可以满足实验所需，则可立即进入病毒滴定步骤。

600×g离心5分钟收集细胞，弃上清，加入1/10原始体积的溶液重悬细胞。

-200C/370C冻融3次，台式离心机上以最大速率沉淀细胞碎片，收集上清，进行病毒滴定。

12.移入50ml离心管中，台式离心机上最大速率离心10分钟，取出上清保存。

13.30瓶175cm2培养瓶中每瓶各加入107293细胞。

14.将45ml细胞裂解液上清加入105mlDMEM5%混匀，从培养瓶中移去培养液，加入5ml混合液感染细胞，十字形缓慢晃动3次混匀，370C培养90分钟。

此时MOI值约为25。

15.加入DMEM5%至30ml/瓶。

16.再培养48-72小时，此时约有3×1011～3×1012个病毒。

若需要，进行MOI测定估计病毒滴度。

如果要收集病毒颗粒，先收集被感染细胞，然后重悬在5mlDMEM5%中。

-200C/370C冻融3次，离心沉淀细胞碎片。

此时5mlDMEM5%中3×1011～3×1012个病毒颗粒，浓度为6×1010～6×1011vp/ml。

然后测定病毒滴度，或者用标准的氯化铯密度梯度离心法纯化病毒。

在109细胞中扩增病毒可获得大量病毒保存液，而在1010细胞中扩增则有一定技术性。

切勿将扩增后的病毒保存液再用来感染细胞，因这会大大增加RCA产生量。

有时不得不使用纯化空斑以最大可能降低RCA产量。

如果已没有纯化的空斑，那么就不得不重新空斑纯化重组病毒，鉴定克隆后再进行扩增。

如果需要大于扩增4轮后的病毒量，注意请用早期的病毒作为扩增源。

比如，用第2代病毒产生第3代病毒。

如果没有第2代病毒，那么必须用第1代病毒来产生新的第2代病毒。

按这个原则进行扩增可使RCA水平尽可能低。

如果用于表达蛋白，则可以收集细胞后根据蛋白特点选择适当方法抽提蛋白。

细胞沉淀中一般可提取1-5mg蛋白，建议在小规模扩增后先测定感染后抽提蛋白的最佳时间，然后再大量扩增蛋白。

2.5.2转染

具体操作按TransFastTMTransfectionReagent（Promega）的操作手册进行。

转染在24孔细胞板上进行，在转染的前一天，消化HEK-293A细胞，用10%的新生牛血清DMEM（不含抗生素）稀释细胞，使其密度达到2.5×105个细胞/mL，在24孔细胞板上每孔接种1.0mL，5%CO2、37℃饱和湿度下培养；在转染前4h，把24孔细胞板的营养液更换为新的营养液；取出－20℃保存的转染试剂，室温融化并涡漩；在灭菌的玻璃瓶中先加入200µL37℃预热的OPTI-MEM无血清培养基（或不含血清的DMEM），然后加入1.0µg的DNA，混匀后加入3.0µL的TransFastTMTransfectionReagent（使lipid∶DNA的体积/µL与质量/µg比为1∶1）后立即涡漩，在室温温育TransFastTMTransfectionReagent/DNA混合物l0～15min；从二氧化碳细胞培养箱中取出细胞板，弃去上清；再一次短暂涡漩TransFastTMTransfectionReagent/DNA混合物，把混合物轻轻加入到细胞面上，注意不要直接吹到细胞面上，以免细胞脱落；轻轻混匀，使脂质体/DNA混合物覆盖细胞面，然后立即把细胞板放入二氧化碳培养箱中；温育1.0h后，轻轻加入1.0mL37℃预热的完全生长液（或使血清浓度降到2～6%），把细胞放入二氧化碳培养箱，37℃培养7～14d。

2.5.3重组腺病毒的收获与增殖

当转染的细胞出现特征病变（局部细胞变圆、脱落，成网状）或细胞状态不足以维持时，－20℃冻存收获病毒。

冻融后接种长满293A细胞的6孔细胞板，37℃吸附1.0h，每孔加入2.0mL维持液（含2%血清的DMEM），增殖病毒。

线性DNA转染只有在包装成病毒后才能表达GFP，至少也得5d左右

一般短时间病毒可以保存在-20度，但是病毒最好在-80℃保存，特别是纯化之后。

在最佳的缓冲液（10mMTrisHClpH8.0,2mMMgCl2,4%sucrose）病毒会持续1-2年稳定性；病毒不能反复冻融；建议不要在-20℃下长期保存。

病毒在DMEM中用血清保存的方式与纯化颗粒一致，但通常比在缓冲液中更加稳定。

可以在DMEM中用血清在4℃存储病毒一周以上而不需要反复冻融。

病毒在DMEM中可以反复冻融30次以上而滴度不会下降，在经过纯化的病毒的情况下，使用缓冲液存储于-80℃下滴度就会至少下降一个数量级（视保存缓冲液而定）。

缓冲液和精确的PH值对于滴度的保存是很关键的。

最佳的保持稳定性的储存方法建议使用以下缓冲液：

Tris10mM,pH8.0,2mMMgCl2，4%sucrose

一般转染后几天之内可以看到零星、散在的荧光，在转染后5d以后，如果有腺病毒包装，由于其感染周围的细胞，那么会在腺病毒包装的地方看到荧光数增加，聚集成一团的样子。

随着时间的延长，整个视野荧光数会逐渐增多。

转染后荧光数不增加或不明显，这与病毒包装的过程有关。

如果包装很快，那么很快就能看到明显的荧光。

毕竟不同转染条件、不同目的基因，包装速度是不一样的。

如果细胞没有CPE，细胞状态好的话，可以尽可能地将时间延长，一直维持就可以。

有时候第一代都看不到明显的CPE，等细胞不能维持时，冻融再接一代有时就明显了。

刚转染之后也能看到散在的荧光，包装成功是能看到成团的荧光，当然CPE是最确切的证实。

能否包装成功与目的基因也有很大关系，据不完全统计，在腺病毒包装公司，大约有将近10%是不能成功的。

当基因对腺病毒有害时常常会出现这种情况。

时间长短与你的转染量、转染效率、基因都有关系。

CPE的具体表现为：

细胞变圆、脱落，形成空斑。

有时候第一代很难看到，最后时间长了，与对照细胞差别不大，往往病变难以确定，需要传代一次才会变得明显。

液体变黄是正常的，只要感觉细胞还行就可以。

这个过程一般不需要换液，细胞好可以维持12d都可以。

如果觉得不能维持了，可以换液，因为此时上清的病毒很少（多的话，早就有CPE了）。

即使到后来，也是细胞中的病毒量高。

我的质粒提取方法

重组质粒的小量提取

1.挑取转化DH5a的单个菌落，接种于盛有3.0mL的含50µg/mL（或加倍）氨苄青霉素的LB培养基的试管中，37°C220rpm过夜振荡培养（一般12-16h，如果浓度低可适当延长时间）；

2.取1.5mL菌液，12000rpm离心30s，沉淀菌体（我一般重复2次，也就是3ml离心在一个EP管；试剂盒提我重复4次，也就是说6ml过一个柱子）；（不用担心裂解不开）

3.完全弃去上清后加入300µL4℃预冷的溶液I（50mmol/L葡萄糖；25mmol/LTris-Cl，pH8.0；10mmol/LEDTA）重悬细菌；

4.加入新配制的溶液II300µL（0.2mol/LNaOH；1%SDS），缓慢颠倒离心管数次，将离心管置于冰上；

5.加入225µL用冰预冷的溶液III（5mol/L乙酸钾60mL，冰乙酸11.5mL，水28.5Ml），盖紧管口，将管倒置后温和颠倒至蛋白变性成白色团块，置冰上3～5min；

6.12000rpm离心5min，将上清移至新的离心管中；

7.加入1-2µLRNaseA（10mg/mL），37℃作用30min或延长至60min；

8.加入600µL的酚∶氯仿，颠倒混匀后置室温5min，12000rpm离心5min；

9.取上清到新的离心管，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min；

10.12000rpm离心l0min，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，干燥，加入30µL双蒸水溶解；

11.琼脂糖凝胶电泳分析。

转染后48h看不到荧光也算是正常的，但是细胞第7天就死亡肯定是不正常的。

是不是转染量过大，导致脂质体太多，对细胞的毒性太大造成的，或者是细胞状态不好，没有转染的细胞对照是不是好的呢？

1）pacI酶切线性化的体系可以参照一般的酶切体系，我一般是30ul，效果挺好。

可以放大到50ul，但不宜过大，使得酶浓度降低；也不宜过小，以免有些成分抑制酶切。

一般在酶切3h（或者更长）后，取几微升（如3ul）与没有酶切的质粒一起跑电影，一看是否切成了2条带，二看质粒的带型还有没有，如果质粒的带子不见了，全部切成了大片段和小片段2条带，就认为酶切完全，此时可以再延长酶切一段时间。

2）50-70%汇片指的是细胞融合度在50-70%，这些都是凭感觉，时间长了就掌握了。

50-70%指细胞间隙还是比较大的，不知道你用的什么转染试剂，好像没见要求密度这么小的。

3）不同转染试剂的步骤一般都不一样，一般参考说明书就行。

条件允许，可以多转染几个孔，采用不同的细胞稀释度进行转染。

脂质体与DNA的比例一般采用推荐的就可以，当然也可以先用GFP质粒摸索一下。

这是我用的TransFastTMTransfectionReagent（Promega）的步骤：

2.5.2转染

具体操作按Tran