实时定量PCR.docx

实时定量PCR.docx

《实时定量PCR.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实时定量PCR.docx（20页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

实时定量PCR

实时定量PCR

一、基本原理

所谓实时定量PCR（real-timePCR）技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

在实时定量PCR技术中，有一个很重要的概念，即：

Ct值（C代表Cycle，t代表threshold），Ct值的含义是：

每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。

利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。

因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

实时定量PCR中所使用的荧光化学可分为两种：

荧光探针和荧光染料。

（1）TaqMan荧光探针：

PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

（2）SYBR荧光染料：

在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地参入DNA双链后，发射荧光信号，而不参入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

图2-3-4用于检测MicroRNA前体的实时定量PCR引物设计

（引自SchmittgenTD,JiangJ,LiuQ,YangL.Ahigh-throughputmethodtomonitortheexpressionofmicroRNAprecursors.NucleicAcidsRes.2004;32（4）:

e43.）

最初，实时定量PCR被用于定量检测小RNA前体的表达（图2-3-4）。

与杂交方法相比，PCR方法可以高度灵敏地检测出低丰度表达的靶分子，并适于高通量筛选。

PCR扩增前的逆转录反应可以使用随机引物或基因特异的引物，简要过程如下：

首先将纯化的小分子量RNA与引物混合，经变性、复性过程使引物与模板配对；然后加入逆转录酶、底物、DTT、以及RNA酶抑制剂的混合物逆转录生成cDNA；再以cDNA为模板进行实时定量PCR。

PCR引物设计遵循以下几个原则：

（1）上下游引物都定位于小RNA前体的茎环结构上；

（2）假设小RNA前体的3’或5’端与成熟小RNA相同（允许向假设的小RNA前体的末端扩充多至4个核苷酸）；（3）引物长度在18—24个核苷酸之间，退火温度在49—59℃之间，3’端不要出现GC等。

图2-3-5TaqMan成熟miRNA实时定量PCR示意图

（引自ChenC,RidzonDA,BroomerAJ,ZhouZ,LeeDH,NguyenJT,BarbisinM,XuNL,MahuvakarVR,AndersenMR,LaoKQ,LivakKJ,GueglerKJ.Real-timequantificationofmicroRNAsbystem-loopRT-PCR.NucleicAcidsRes.2005;33（20）:

e179.）

现在，成熟小RNA的表达测定亦可通过实时定量PCR进行（图2-3-5），其与前体小RNA的实时定量PCR检测最主要的区别在于它的反转录引物具有茎环结构并且含有一段共有序列，能高效结合于成熟小RNA3’末端进行反转录反应，从而定量检测成熟小RNA的表达。

成熟小RNA商品化的检测试剂盒已被应用于研究中，如ABI公司的miVrna。

应用PCR方法既可检测小RNA前体又可检测成熟小RNA的表达，这对研究小RNA的表达调控具有重要的意义。

研究者可以根据发育过程中不同阶段小RNA的表达差异准确观察存在于小RNA基因转录水平或其后两种RNA酶Ⅲ（Drosha和Dicer）作用过程的调控，从而帮助我们深入了解小RNA的起源和发生。

由于实时定量PCR的高度灵敏性（可检测到总量低至纳克级的样品），Tang等使用该技术对单个人胚胎干细胞中220个小RNA的表达谱进行了考察。

这种在单个细胞水平的检测方法的建立对于研究小RNA在那些数量有限的细胞群体（例如：

原始生殖细胞等）中的作用有重要意义。

一、microRNA实时定量PCR操作步骤：

（一）总RNA提取

总RNA提取对于后续实验至关重要，高质量的RNA将确保小分子RNA不会丢失。

目前，多个公司开发出RNA提取试剂盒，可获得高质量RNA。

但是常规的Trizol方法也可获得较好的结果。

1.材料

1）Trizol（Invitrogen,Carlsbad,CA）

2）氯仿

3）异丙醇

4）75%乙醇（预冷）

5）无水乙醇

6）去离子甲酰胺（sigma）

7）3M醋酸钠

8）DEPC水（DEPCsigma产品）

9）10хMOPS缓冲液（200mMMOPSpH7.0；10mMEDTA；50mM醋酸钠）

10）5хRNA上样缓冲液（35%去离子甲酰胺；4хMOPS缓冲液；4mMEDTA；0.9M甲醛；0.16%溴酚蓝与二甲苯青；2μg/mlEB）

11）1.2%琼脂糖凝胶（含1хMOPS缓冲液；2%（v/v）12.3M甲醛）

12）20mg/ml糖原（Roche,Indianapolis,IN）

13）组织、细胞

14）无RNA酶枪头、离心管（Axygen）

15）冷冻离心机等

注：

未标明产品来源的试剂均为国产分析纯。

2.操作步骤

1）取适量组织或细胞，加入合适体积的Trizol（1mlTrizol/100mg组织或107细胞），充分裂解变性，室温放置3～5min。

组织需经研磨、破碎，以达到充分变性的目的。

2）1ml组织或细胞裂解物移至1.5ml离心管，加入200μl氯仿，充分混匀后于室温放置3～5min。

3）12000g于4℃离心15min。

4）取离心后的上清移至新的离心管中，加入500μl异丙醇，充分混匀后于室温放置3min。

5）12000g于4℃离心10min。

6）弃上清后加入预冷的75%乙醇（DEPC水配制），洗涤沉淀。

7）7500g于4℃离心5min。

8）弃上清后，晾干沉淀，加入适量体积DEPC水溶解。

9）取适量体积总RNA加入5хRNA上样缓冲液，70℃变性5min，冰浴后进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，鉴定质量。

10）浓度测定后于-80℃保存备用。

若长期保存需置于无水乙醇中于-80℃保存。

（二）小分子RNA分离纯化及富集（可选择）

PAGE方法是用于小分子RNA分离纯化的首选技术，且易于操作。

根据分子量选择合适凝胶部位，切下后洗脱获得所需片段。

1.材料

1）PAGEmini胶装置（Bio-Rad）

2）15%-8M尿素变性胶（丙烯酰胺、尿素为sigma产品）

3）电泳仪（Bio-Rad）

4）10XTBE缓冲液（890mMTris-borate；20mMofEDTA）

5）上样缓冲液（去离子甲酰胺18mMEDTA（pH8.0）；0.025%二甲苯青；0.025%溴酚蓝.）

6）RadiolabeledDecade™RNA分子量标准（Ambion,Austin,TX）

7）荧光成像仪（AmershamBiosciences,Pittsburgh,PA）

8）SYBRGreenII（Invitrogen,Carlsbad,CA）

9）磷屏成像仪（AmershamBiosciences）

10）0.3M醋酸钠（DEPC水配制）

11）无水乙醇

12）Elutrap®Electroelution系统（Schleicher&Schuell,Dassel,Germany）

13）20mg/ml糖原（Roche,Indianapolis,IN）

14）75%乙醇（预冷）

注：

未标明产品来源的试剂均为国产分析纯。

2.步骤

1）取500μg总RNA，加入等体积上样缓冲液，于90℃加热5min。

2）将凝胶预热至45℃后加入样品，同时在样品旁的加样孔中加入RNAmaker与合成的对照品。

避免三者之间交叉污染。

3）于40℃～45℃恒温进行电泳。

4）待溴酚蓝行至凝胶底部，取下凝胶以SYBRGreenII（以0.5XTBE缓冲液1:

10,000稀释）进行染色，并通过荧光成像仪分析结果。

5）以荧光成像仪所得结果对比凝胶，选定18～24nt分子范围，以备回收小RNA分子。

6）切下合适范围内的凝胶片段以被动洗脱或电洗脱，其中电洗脱是首选的方法。

7）选用被动洗脱时，以0.3M醋酸钠覆盖凝胶片段，95℃加热5min，于4℃孵育过夜。

8）选择电洗脱时，切下1cm凝胶片段，以Elutrap®Electroelution系统进行洗脱。

9）于4W运行45min后，电极反转运行运行20s。

10）收集洗脱液置于离心管中，调整为0.3M醋酸钠体系。

11）被动洗脱或电洗脱所得洗脱液均加入2.5倍体积的无水乙醇，于-20℃孵育过夜。

加入20μg糖原可提高RNA沉淀效率。

12）14,000g于4℃离心20min。

13）以预冷的75%乙醇洗涤沉淀，离心弃上清后，空气浴干燥沉淀。

14）以合适体积的DEPC水溶解沉淀，并测定RNA浓度。

（三）逆转录反应

1.材料

1）10xRTbuffer

2）RNasinRNA酶抑制剂

3）10mMdNTPs

4）序列特异性的逆转录引物（依据不同的microRNA序列）

2.步骤

snoU6作为内参（snoU6和miRNA的反转录引物可以同时加入逆转录体系中）

逆转录产物加入80l水，备用作为模板。

实时定量PCR（以TaKaRaSYRB®PremixExTaqTM为例）

1．材料

1）SYBRMmix

2）仪器：

IQ5

2．步骤

2xSYBR10l

cDNA2l

Forwardprimer（10M）0.4l

Reverseprimer（10M）0.4l

RNase-FreeH2Oupto20l

充分混匀注意避免形成气泡，尽量小心准确移液，而且因为要避免荧光干扰，污染，PCR管应不与他物接触，把反应管放入仪器。

编辑热学过程：

Stage1：

95℃10s,预变性；95℃5s，60℃34s,共40个循环Stage2：

62oC～92oC缓慢升温，产生熔点曲线（meltingcurve，或称解离曲线，dissociationcurve）。

保存设置，点击“Run”，整套设备开始自动运行。

PCR开始并且荧光数据被收集。

查看分析结果，作出标准曲线，计算待测microRNA拷贝数。

参考文献

1.ChenC,RidzonDA,BroomerAJ,ZhouZ,LeeDH,NguyenJT,BarbisinM,XuNL,MahuvakarVR,AndersenMR,LaoKQ,LivakKJ,GueglerKJ.Real-timequantificationofmicroRNAsbystem-loopRT-PCR.NucleicAcidsRes,2005,33（20）:

e179

2.ChoongML,YangHH,McNieceI.MicroRNAexpressionprofilingduringhumancordblood-derivedCD34cellerythropoiesis.ExpHematol.2007Apr;35（4）:

551-64.

3.JiangJ,LeeEJ,GusevY,SchmittgenTD.Real-timeexpressionprofilingofmicroRNAprecursorsinhumancancercelllines.NucleicAcidsRes,2005,33（17）:

5394～5403.

4.LaoK,XuNL,SunYA,LivakKJ,StrausNA.RealtimePCRprofilingof330humanmicro-RNAs.BiotechnolJ.2007Jan;2

（1）:

33-5.

5.LiangRQ,LiW,LiY,TanCY,LiJX,JinYX,RuanKC.AnoligonucleotidemicroarrayformicroRNAexpressionanalysisbasedonlabelingRNAwithquantumdotandnanogoldprobe.NucleicAcidsRes,2005,33:

e17

6.MishimaT,MizuguchiY,KawahigashiY,TakizawaT,TakizawaT.RT-PCR-basedanalysisofmicroRNA（miR-1and-124）expressioninmouseCNS.BrainRes.2007Feb2;1131

（1）:

37-43.

7.NelsonPT,BaldwinDA,ScearceLM,OberholtzerJC,TobiasJW,MourelatosZ.Microarray-based,high-throughputgeneexpressionprofilingofmicroRNAs.NatMethods,2004,1

（2）:

155～161.

8.SchmittgenTD,JiangJ,LiuQ,YangL.Ahigh-throughputmethodtomonitortheexpressionofmicroRNAprecursors.NucleicAcidsRes,2004,32（4）:

e43.

9.TangF,HajkovaP,BartonSC,LaoK,SuraniMA.MicroRNAexpressionprofilingofsinglewholeembryonicstemcells.NucleicAcidsRes,2006,34:

e9.

10.TangF,HajkovaP,BartonSC,O'CarrollD,LeeC,LaoK,SuraniMA.220-plexmicroRNAexpressionprofileofasinglecell.NatProtoc.2006;1（3）:

1154-9.

PAGE/NorthernBlot的实验步骤

microRNAPAGE/NorthernBlot易于操作，且可有效检测目的RNA基因。

实验流程简介如下：

（一）总RNA提取

总RNA提取对于后续实验至关重要，高质量的RNA将确保小分子RNA不会丢失。

目前，多个公司开发出RNA提取试剂盒，可获得高质量RNA。

但是常规的Trizol方法也可获得较好的结果。

1.材料

16）Trizol（Invitrogen,Carlsbad,CA）

17）氯仿

18）异丙醇

19）75%乙醇（预冷）

20）无水乙醇

21）去离子甲酰胺（sigma）

22）3M醋酸钠

23）DEPC水（DEPCsigma产品）

24）10хMOPS缓冲液（200mMMOPSpH7.0；10mMEDTA；50mM醋酸钠）

25）5хRNA上样缓冲液（35%去离子甲酰胺；4хMOPS缓冲液；4mMEDTA；0.9M甲醛；0.16%溴酚蓝与二甲苯青；2μg/mlEB）

26）1.2%琼脂糖凝胶（含1хMOPS缓冲液；2%（v/v）12.3M甲醛）

27）20mg/ml糖原（Roche,Indianapolis,IN）

28）组织、细胞

29）无RNA酶枪头、离心管（Axygen）

30）冷冻离心机等

注：

未标明产品来源的试剂均为国产分析纯。

2.操作步骤

11）取适量组织或细胞，加入合适体积的Trizol（1mlTrizol/100mg组织或107细胞），充分裂解变性，室温放置3～5min。

组织需经研磨、破碎，以达到充分变性的目的。

12）1ml组织或细胞裂解物移至1.5ml离心管，加入200μl氯仿，充分混匀后于室温放置3～5min。

13）12000g于4℃离心15min。

14）取离心后的上清移至新的离心管中，加入500μl异丙醇，充分混匀后于室温放置3min。

15）12000g于4℃离心10min。

16）弃上清后加入预冷的75%乙醇（DEPC水配制），洗涤沉淀。

17）7500g于4℃离心5min。

18）弃上清后，晾干沉淀，加入适量体积DEPC水溶解。

19）取适量体积总RNA加入5хRNA上样缓冲液，70℃变性5min，冰浴后进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，鉴定质量。

20）浓度测定后于-80℃保存备用。

若长期保存需置于无水乙醇中于-80℃保存。

（二）样品处理

1.材料

1）上样缓冲液（50%甘油、0.25%二甲苯青、0.25%溴酚兰、10mMEDTA）

2）去离子甲酰胺（Sigma产品）

3）45%聚丙烯酰胺储存液（Sigma产品）

4）尿素（Sigma产品）

5）过硫酸铵（APS）（Sigma产品）

6）TEMED（Invitrogen,Carlsbad,CA）

7）5хTBE储存液

8）0.2MEDTA（缓冲液均以DEPC水配制）

9）尼龙膜（Millipore）

10）同位素γ-32P

11）T4多核苷酸激酶（NewEnglandBiolabs,Ipswich,MA）

12）10%SDS（Sigma产品）

13）20хSCC

14）10mmol/LTris-HCl（pH7.4）

15）X-胶片及片盒等

注：

未标明产品来源的试剂均为国产分析纯。

2.步骤

样品处理

1）选择适量RNA样品，加入上样缓冲液及去离子甲酰胺，后者占终体积1/2。

2）样品混匀并于55℃孵育30min，冰浴5min后PAGE分离.

PAGE分离、转膜和固定：

3）15%PAGE配制（10ml）：

DEPC水,1ml;5хTBE,2ml;45%聚丙烯酰胺,3.33ml;尿素,4.8g;10%APS,75μl;TEMED,4μl.

4）待凝胶聚合后点样并于电流20mA电泳分离。

5）电泳完毕于200mA转膜。

6）紫外交联固定RNA于膜上，待杂交。

寡核苷酸探针的制备

探针标记可选择放射性同位素或非放射性发光物，由于同位素敏感度高，故仅以放射性同位素标记为例，介绍标记过程。

7）取10μl10μM寡核苷酸探针，5μlT4多核苷酸激酶反应缓冲液，1μlT4多核苷酸激酶，5μl1μMγ-32P溶液混合。

8）样品混匀并于37℃孵育1h，无须再次纯化探针，即可加入杂交管内，进行杂交。

杂交、洗膜、压片和放射自显影

9）标记的特异探针于37℃杂交过夜。

10）取出杂交膜以洗膜液（0.1%SDS;1хSCC）于室温洗涤5min，重复2次。

11）杂交膜以漂洗液（0.1%SDS;2хSCC）于37℃洗涤5min。

12）在印迹纸上晾干膜，然后让膜于-70℃下在含增感屏的暗盒内对X线片（KodakXAR-5或相应的胶片）放射自显影24～48h或根据放射性强度调整自显影的时间。

13）杂交结果分析

提取高质量总RNA，通过PAGE/NorthernBlot分离，转膜、紫外交联固定RNA于尼龙膜上，进而与同位素标记的寡核苷酸探针杂交，压片放射自显影得到较为理想的结果

去除Northern印迹膜上的放射性

从固定有RNA的尼龙膜上洗去放射性标记的探针，可将膜在如下的任一溶液中温育1～2h：

14）大体积的10mmol/LTris-HCl（pH7.4），0.2%SDS，预热到70～75℃。

15）足量50%去离子甲酰胺，0.1хSCC，0.1%SDS，预热到68℃。

三、探针标记方法使用及讨论

（一）PAGE/NorthernBlot电泳中RNA量的标准化

对多个样品进行比较分析时，需使加入凝胶泳道中RNA的量相同，是一个十分棘手的问题。

有几种可行的方法，但各有其优缺点。

1.加入等量的RNA

在细胞或组织的总RNA样品中，rRNA是主要的成分，在紫外吸收的物质中超过75%。

等量总RNA的NorthernBlot分析表明了目标mRNA稳定状态的浓度如何随细胞rRNA的含量而变化，但是18S或28SrRNA的含量在不同的哺乳动物组织或细胞系差别不大，因此可用作标准化的参照物。

2.根据mRNA含量对样品标准化

内源性组成性表达的管家基因如亲环素、β-肌动蛋白、甘油-3-磷酸脱氢酶等三个基因以中等丰度水平表达。

对目的基因杂交信号强度总是相对这三者而言，但后来证实管家基因的表达水平在不同哺乳动物和不同细胞系中并不总是恒定的。

因此用作标准化参考物有一定缺陷。

3.加入等量的poly（A）+RNA对样品标准化

RNA样品中poly（A）+的含量可以通过和放射性标记的poly（dT）探针进行狭缝杂交或点杂交进行比较。

在每个泳道内加入等量的poly（A）+RNA，用以RNA上样标准化。

这是一个比较好的方法了，因为它可以测量细胞内特定mRNA的浓度相对于基因转录物总量的变化。

4.用合成的假基因对样品标准化

多家实验室采用体外合成的RNA作为外加标准来测量不同细胞RNA样本中目的基因的表达。

合成的假基因与野生型大小不同，在细胞裂解时以已知量加入，根据杂交信号强度估计内源性目的基因的表达。

样品标准化方法有多种，可根据实验需要选择最佳的方法。

（二）探针的分类及标记方法

核酸探针根据其性质，可分为DNA和RNA探针。

根据标记物是否具有放射性，可分为放射性标记探针和非放射性标记探针。

根据是否存在互补链，可分为单链和双链探针。

根据放射性标记物掺入情况，可分为均匀标记和末端标记探针。

下面简单探讨各种类型探针的标记方法。

1.双链DNA探针的标记方法

分子生物研究中，最常用的探针即为双链DNA探针，它广泛应用于基因的鉴定、临床诊断等方面。

双链DNA探针的合成方法主要有下列两种:

切口平移法和随机引物合成法。

切口平移法（nicktranslation）：

当双链DNA分子的一条链上产生切口时，E.coliDNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'羟基末端。

同时该酶具有从5'→3'的核酸外切酶活性，能从切口的5'端除去核苷酸。

由于在切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸，从而使切口沿着DNA链移动，用放射性核苷酸代替原先无放射性的核