三唑类杀菌剂对意大利蜜蜂经口毒性测试本科毕业论文.docx

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三唑类杀菌剂对意大利蜜蜂经口毒性测试本科毕业论文

三唑类杀菌剂对意大利蜜蜂经口毒性测试

说明

一、指导教师评语根据学生实习及撰写论文情况进行评定：

1、对待实习的态度及实习纪律的遵守情况；

2、能否准确熟练地进行观察记载、搜集整理、查阅资料及运用数据的水平；

3、能否准确熟练地进行各项操作，并运用所学知识解决实际问题；

4、能否很好地完成任务书规定的工作量。

二、评阅教师意见参照以下几方面进行评定：

1、论文选题的实用性、分析的科学性和体系的完整性；

2、获取资料是否丰富，处理资料是否科学、严谨；

3、综合运用基础理论和专业知识的深度、归纳、概括及运算的能力；

4、文字表达能力，文章的逻辑性。

三、论文答辩成绩由答辩小组根据学生语言表达能力及回答问题的准确性进行评定。

四、论文综合评定成绩按优秀、良好、中等、及格和不及格五级计分。

五、毕业论文的成绩评定按照《毕业论文评分标准》综合评定。

六、论文由学生本人按照《毕业论文（设计）规范》用计算机排版、打印，一律使用统一封面（16K）。

七、学生的论文文本（含任务书、图片等）由学院按学校规定存档。

目录

中文摘要…………………………………………………………………………………6

英文摘要…………………………………………………………………………………6

1前言7

1.1意大利蜜蜂简介8

1.1.1意大利蜜蜂的基本特征8

1.1.2意大利蜜蜂的经济意义9

1.2农药对蜜蜂的风险评价及生物毒性测试方法10

1.3蜜蜂农药中毒的表现12

1.4供试药剂简介13

2.1试验药剂14

2.2试验蜜蜂及来源14

2.3试验方法15

2.3.1试验条件15

2.3.2蜜蜂饲养及适应期15

2.3.3试验设备15

2.3.4试验染毒浓度和分组15

2.3.5试验方法选择16

2.3.6染毒方法16

2.3.7症状观察与数据记录16

2.4数据处理16

2.5质量控制16

3结果与结论17

3.1质量控制实际测量数据17

3.2中毒症状17

3.3结果17

3.4结论18

4附表：

19

参考文献25

致谢26

Directory

Chineseabstract…………………………………………………………………….6

Englishabstract……………………………………………………………………..6

1Introduction……...……………………………………………..……………….……7

1.1ItalianbeesIntroduction…………………………………………………………8

1.1.1basiccharacteristicsoftheItalianbee…………………………………….....8

1.1.2Italianbeeseconomicsignificance…………………………………………..9

1.2pesticideriskassessmentandbiologicaltoxicitytestmethodbees…………….10

1.3Beepesticidepoisoningsymptoms……………………………………………...12

1.4fortestpharmaceuticalAbout…………………………………………………...13

2Materialsandmethods………………………………………………………………14

2.1ExperimentalPharmacy…………………………………………………………..14

2.2testbeesandsources…………………………………………………………...…15

2.3TestMethod……………………………………………………………………….15

2.3.1Testconditions………………………………………………………………..15

2.3.2beebreedingandadaptationof……………………………………………….15

2.3.3Thetestequipment……………………………………………………………15

2.3.4testexposureconcentrationandgrouping…………………………………….15

2.3.5Testmethodtoselect………………………………………………………….16

2.3.6exposuremethod………………………………………………………………16

2.3.7symptomsofobservationanddatarecording..…………………………….….16

2.4DataProcessing…………………………………………………………………….16

2.5QualityControl……………………………………………………………………..16

3Resultsandconclusions………………………………………………………...……...17

3.1Qualitycontroloftheactualmeasurementdata…………………………………....17

3.2Thesymptomsofpoisoning………………………………………………..………17

3.3theresultsof………………………………………………………………………..17

3.4Conclusion………………………………………………………………………….18

4Schedule:

..……………………………………………………………………………..19

Reference………………………………………………………………………………25

Acknowledgements…………………………………………………………………….26

六种三唑类杀菌剂对意大利蜜蜂经口毒性评价

作者：

郑玉涛（09级制药2班）

指导教师：

姜兴印副教授

摘要：

本试验以意大利蜜蜂为试材，利用经口法测定了10%苯醚甲环唑微乳剂、250克/升丙环唑乳油、25%戊唑醇水乳剂、20%戊菌唑水乳剂、25%氟环唑悬浮剂、8％氟硅唑微乳剂六种药剂对蜜蜂的经口毒性，实验结果得：

24h后，10%苯醚甲环唑微乳剂经口LC50值为1322.60a.i.mg/L，95%置信限为988.82-2035.11a.i.mg/L,250克/升丙环唑乳油经口LC50值为1306.38a.i.mg/L，95%置信限为966.94-2052.08a.i.mg/L,25%戊唑醇水乳剂经口LC50值为778.34a.i.mg/L，95%置信限为641.42-983.79a.i.mg/L,20%戊菌唑水乳剂经口LC50值为1375.02a.i.mg/L，95%置信限为1012.38-2188.84a.i.mg/L,25%氟环唑悬浮剂经口LC50值为293.97a.i.mg/L，95%置信限为224.86-431.13a.i.mg/L,8％氟硅唑微乳剂经口LC50值为103a.i.mg/L，95%置信限为83.7-135a.i.mg/L。

根据《化学农药环境安全评价试验准则》可得出结论：

10%苯醚甲环唑微乳剂、250克/升丙环唑乳油、25%戊唑醇水乳剂、20%戊菌唑水乳剂药剂对蜜蜂的经口毒性均为低毒,25%氟环唑悬浮剂、8％氟硅唑微乳剂对蜜蜂的经口毒性为中毒。

关键词：

三唑类杀菌剂，意大利蜜蜂，经口毒性，安全性评价

SixthreetriazolefungicideontheItalianbeeoraltoxicityevaluation

Author:

ZhengYuTao（09pharmaceuticalengineering2classes）

Instructor:

associateprofessorofJiangXingYin

Abstract:

Inthistest,theItalianbeesastestmaterials,usethetagmethodforthedeterminationof10%difenoconazoleME,250g/Lpropiconazole,EC,25%tebuconazoleEW,20%penconazoleEW25%epoxiconazoleSC,8%flusilazoleME,sixthreetriazolefungicideontheItalianbeeoraltoxicityevaluation,theexperimentalresultsmeasured:

24hlater10%difenoconazoleMEoralLC50were1322.60a.i.mg/L,the95%confidencelimitwere988.82-2035.11a.i.mg/L,250g/Lpropiconazole,ECoralLC50were1306.38a.i.mg/L,the95%confidencelimitwere966.94-2052.08a.i.mg/L,25%tebuconazoleEWoralLC50were778.34a.i.mg/L,the95%confidencelimitwere641.42-983.79a.i.mg/L,20%penconazoleEWoralLC50were1375.02a.i.mg/L,the95%confidencelimitwere1012.38-2188.84a.i.mg/L,25%epoxiconazoleSCoralLC50were293.97a.i.mg/L,the95%confidencelimitwere224.86-431.13a.i.mg/L,8%flusilazoleMEoralLC50were103a.i.mg/L,the95%confidencelimitwere83.7-135a.i.mg/L.Underchemicalpesticideenvironmentalsafetyevaluationcriteriacanbeconcludedthat:

10%difenoconazoleME,250g/Lpropiconazole,EC,25%tebuconazoleEW,20%penconazoleEWoraltoxicityofthefourkindsofpesticidesonbeesarelowtoxicity,25%epoxiconazoleSC,8%flusilazoleMEaremoderatetoxicity.

Keywords:

threetriazolefungicide,Italianbees,oraltoxicity

1前言

蜜蜂是一种重要的经济昆虫，可为人类提供大量蜂产品，如蜂蜜、花粉、王浆、蜂胶和蜂蜡等。

除此之外，蜜蜂对人类的最大贡献在于其是一种重要的传粉昆虫，全世界有上万种植物可靠蜜蜂进行传粉。

[1]自2006年冬以来，欧美相继出现蜂群大量减少的情况，科学家们称之为蜂群崩溃失调病（ColonyCollapseDisorder，简称CCD），如在2006—2007年冬，估计在美国有65.1～87.5万蜂群消失，而这之前有240万蜂群。

引起蜂群衰退的因素有很多，其中农药的大量使用被认为是一个重要诱因，如早在1993年，法国西南部就发现用吡虫啉处理向日葵种子后导致大量蜜蜂死亡的情况，并在后来取消其在向日葵上的使用。

Frazier等从108份蜂花粉中检测出46种不同的农药及6种农药代谢产物，其中在1份样品中最多检测出17种农药，平均每份样品中检出5种农药，只有3份样品中未检测出农药残留，由此可见农药已对蜜源造成了广泛而严重的污染，势必会影响蜜蜂的健康。

[2]保护环境中有益生物的安全,是农药使用中一项十分重要的任务。

为此,我们于2007年依据国家环保局颁布的《化学农药环境安全评价试验准则》的要求旨在为其合理评价与使用提供科学依据。

[3]以科学的方法研究农药对蜜蜂的毒性，并对其风险性作出评价，是农药安全使用的必要前提之一。

化学农药对蜜蜂的危害表现为急性毒性和慢性毒性两方面，常通过室内的毒力测定来完成对蜜蜂急性毒性的危害评价。

从急性经口和急性触杀两方面综述农药对蜜蜂的急性毒力测定方法和危害评价体系。

急性经口毒性的毒力测定方法也称摄入法，按给药时间通常可分为连续摄入和初始摄入两种，即连续摄入法和初始摄入法。

连续摄入法是基于中国国家环保总局1989年制定的《化学农药安全评价试验准则》中推荐的检测农药对蜜蜂的经口毒性的方法，该方法现已广泛应用于中国农药产品的登记试验。

具体做法是将一定量的农药溶于糖水或蜂蜜中，配制成不同浓度的药蜜混合液（简称药蜜），将药蜜分别浸渍在适量的脱脂棉中，装在10ml小烧杯内，杯口用纱网封住，通过网眼供蜜蜂摄取，定时观察蜜蜂摄食情况，随时添加药蜜。

记录24h内蜜蜂死亡数，求出相应的致死中量LD50或致死中浓度LC50。

对难溶于水的农药，可加少量助溶剂（如丙酮等）。

连续摄入法是在不考虑大田中推荐使用浓度的情况下测试农药对蜜蜂的急性毒性。

这种方法的优点是农药对蜜蜂的影响可以用LD50表示，并进行各农药间的毒力比较，将大田试验等实际应用中得来的数据和室内采用摄入法求出的LD50数据联系起来，可以推断农药在大田推荐浓度下对蜜蜂的影响．但这种方法本身存在缺陷：

在测试过程中，24h或者更长时间持续地接触一定浓度的农药，并没有客观、真实地反映出农药对蜜蜂的危害，而是放大了农药对蜜蜂的影响，因而，该方法不利于新农药的推广，但对于发展可持续农业和保护生态环境却大有裨益。

[4]

1.1意大利蜜蜂简介

1.1.1意大利蜜蜂的基本特征

意大利蜜蜂简称意蜂。

原产于意大利的亚平尼半岛，是典型的地中海型气候和生态环境的产物。

一些学者认为，意大利蜂是亚平宁半岛上原有的欧洲黑蜂与引进的塞浦路斯蜂长期自然杂交形成的。

亚平宁半岛的气候和蜜源条件的特点是：

冬季短、温暖而湿润；夏季炎热而干旱，蜜源植物丰富，花期长。

意大利蜂在类似上述自然条件下，可表现出很好的经济性状；但在冬季长而严寒、春季经常有寒潮袭击的地方，则适应性较差。

[5]

意大利蜂的体形比黑蜂略小，腹部细长，吻较长（6.3～6.6mm）；腹板几丁质颜色鲜明，在第2至第4腹节背板的前部具黄色环带。

但黄色区域的大小和色泽深浅有很大变化，有的蜂群较宽而浅，有的窄而深。

浅色的蜂种，常具有黄色的小盾片，类似塞普路斯蜜蜂。

意蜂的特浅色类型，就是众所周知的“黄金种蜜蜂”，仅在腹部末端具有黑色小斑。

意蜂的绒毛亦具黄色，这在雄蜂上特别易于区别。

其覆毛短，绒毛带宽而密。

肘脉指数中等或偏高，平均为2.2～2.5。

[6]

1.1.2意大利蜜蜂的经济意义

蜜蜂是对人类有益的昆虫类群之一，通常广泛指的是生产用蜂种：

西方蜜蜂和中华蜜蜂。

它为农作物、果树、蔬菜、牧草、油茶作物和中药植物传粉。

蜂蜜是人们常用的滋补品，有“老年人的牛奶”的美称；蜂花粉被人们誉为“微型营养库”，蜂王浆更是高级营养品，不但可增强体质，延长寿命，还可治疗神经衰弱、贫血、胃溃疡等慢性病；蜂毒对风湿、神经炎等均有疗效；蜂蜡和蜂胶都是轻工业的原料。

蜂胶还被称为“紫色黄金”，在全世界的产量比黄金还少。

蜜蜂既能酿蜜，又能为植物传粉。

在农副业生产中，它具有相当的经济价值。

然而，在整个生态系统中，由于农药的广泛使用，对蜜蜂安全的威胁亦不可避免。

因此农药对蜜蜂安全性的评价，是农药开放中不可缺少的组成部分。

我国饲养蜂群约700万群，其中意大利蜂约500万群，是蜂业生产的支柱，也是作物授粉的主力军。

由于农药的大量使用，引起蜜蜂中毒事件逐年增加，使养蜂业蒙受重大的经济损失，也使一些农作物因为得不到充分授粉而导致产量降低和品质下降，影响农业的收益。

[7]

意蜂产蜜能力强，生产王浆的能力强，是蜜浆兼产型的理想品种，而且也是花粉生产的理想品种，还可用其进行蜂胶生产。

正因为如此，意蜂的饲养范围早已远远超出了原产地，成为受到普遍欢迎的世界性品种。

蜂毒为蜜蜂螫刺腺体中的毒液。

又名蜜蜂毒素。

其采收有几种方法，最好用电刺激取蜂毒法：

将电取蜂毒器置于蜂箱巢门口，当蜜蜂触及电网时就会螫刺其下面的取蜂毒蜡纸，并将蜂毒排出在蜡纸背面。

蜜蜂拔出螫针后能够继续工作。

王浆为工蜂咽腺的分泌物，是蜂王及早期幼虫的饲料。

又名蜂乳、王乳、蜂王浆、蜂皇浆、皇浆。

在移虫后48～72小时，检查产浆群，如发现蜡杯都已由工蜂改成王台，王台里的幼虫也已长大，即可取浆。

取浆应在清洁的室内进行，并穿工作服，带口罩。

先取下各段板条，用小镊子移出幼虫，再用牛角匙或竹制小匙（不要用金属匙）挖出王浆，立即放入带色的玻璃瓶内。

将所采王浆，密闭低温（不超过4℃）保存或送去做成制剂。

蜂蜡为蜜蜂分泌的蜡质，经加工而成的块状物。

又名蜜蜡。

将要用于制蜡的蜂巢除去蜂蜜，放入水中，加热熔化，静置放冷，蜡层即浮于水面。

取出此蜡块再熔化，并保温放置，待其中杂质沉淀后，将上层经滤过倒入模型中固化而成。

蜂胶为蜜蜂用来修补蜂箱隙缝，涂搽巢房和封闭蜂箱内异物用的粘性物质。

每10天左右采收一次，选择天气暖和，蜂胶柔软时用刮刀将蜂胶刮起，并立即捏成团块，用蜡纸或油纸包好，以防硬化，放凉暗处贮存备用。

蜂毒主要用于与疼痛有关的各种疾病的治疗，如风湿热、风湿性及类风湿性关节炎、各种周围神经炎及神经痛、肌痛、腰肌劳损及其他周围神经障碍。

此外用于眼科疾病、早期高血压、荨麻疹及神经官能症等。

[8]

1.2农药对蜜蜂的风险评价及生物毒性测试方法

1996年USEPA下属防治农药和毒性物质办公室结合“污染防治与毒性物质办公室”、“联邦管理条例”等相关实验要求，在USEPA原有工作基础上制订了蜜蜂急性经口毒性实验导则、叶面残留蜜蜂毒性实验导则以及传粉昆虫田间实验导则，这些导则包含实验室毒性实验、模拟实验及田间实验，基本构成了USEPA农药对蜜蜂生物安全性研究的多层次实验体系。

农药对蜜蜂的影响是环境生态风险评价的一个重要组成部分,目前大多引用USEPA的经典生态风险评价程序来进行。

美国于1998年发布的最新生态风险评价程序中将生态风险评价过程分为3个主要阶段,即问题表述、问题分析和风险表征。

而陆生生物的生态风险评价规程则由美国生态委员会生态风险评价陆生生物工作组（TheEcologicalCommitteeonFIFRARiskAssessmentMethodsTerrestrialWorkGroup）在1997年的工作报告中提出,共包括问题表述、饮食途径暴露和效应评价、风险表征几个部分。

目前USEPA主要是通过急性接触毒性试验（LD50值）来估计农药施通过叶面暴露试验估计蜜蜂直接摄取或暴露于叶面残留农药时的致死效应。

农药对蜜蜂的风险评价主要包括以下3个过程:

①农药对蜜蜂的危害分析:

确定危害存在与否,制定风险分析计划。

②农药对蜜蜂的风险分析与估算:

农药自身的毒性,通常用LD50值来表示;确定农药暴露浓度,估算产生危害影响的剂量水平。

③风险表征:

表征一种农药对蜜蜂的影响。

如果生态系统中各种浓度下的暴露均不会引起危害,则认为这种农药不会对蜜蜂造成有害影响;如果怀疑或已经产生了危害,则需进行田间风险评用时药液与蜜蜂身体直接接触的毒性危害,同时评价,以便进一步了解风险并将其降低到可以接受的水平。

[9]

目前，应用最多、最完善的农药对蜜蜂生物安全性评价体系是由洲-地中海植物保护组织经过几十年的研究逐渐形成的。

该组织成立于1951年，主要围绕农药对环境生物安全性评价问题，开展农药对环境生物毒性测试方法及安全性风险评价技术研究，EPPO的农药对蜜蜂生态风险评价体系被其成员国如荷兰、德国、法国及其他非该组织成员国如新西兰等国家广泛采用。

农药对蜜蜂生态风险评价体系包括毒性数据与实验、暴露评价以及风险评价等部分。

蜜蜂急性毒性试验是农药对蜜蜂生物毒性等级评价的划分依据，通常以半致死浓度/剂量（Sub-LethalConcentrationorDose，LC50/LD50）表示，即实验条件下受试农药引起50%实验蜜蜂死亡所对应的浓度或剂量[10]。

根据农药对蜜蜂的不同暴露途径，蜜蜂急性毒性实验可分为接触暴露毒性试验（接触法）和经口暴露毒性实验（摄入法）。

1998年经济合作与发展组织（OrganizationforEconomicCo-operationandDevelopment,OECD）制定了农药和其他化学品对蜜蜂经口急性毒性实验导则“Honeybees.Acuteoraltoxicitytest.OECD’sGuidelinesfortheTestingofChemical.TGNo.213”及接触毒性实验导则Honeybees.Acuteoraltoxicitytest.OECD’sGuidelinesfortheTestingofChemical.TGNo.214”。

OECD蜜蜂摄入法毒性实验采用饲喂管法，即将含有受试药液的蔗糖溶液注入尖嘴玻璃管中（50mm×Φ10mm，Φ2mm），然后将其安装在蜂笼顶部，蜂笼内蜜蜂通过口器深入管内趋势含药溶液；接触法则是将蜜蜂夹于两层纱网中，通过网孔用微量注射器对准蜜蜂中胸背板出点滴一定浓度的受试药液，待蜂身晾干后，将蜜蜂转入实验蜂笼正常饲喂。

实验条件通常为温度（25±2）℃，相对湿度50%—70%，避光黑暗，实验周期为24—96h。

[10]

农药对蜜蜂的毒性研究，有实验室研究和大田试验两种，后者更接近实际，但工本高，显然不可能对所有的农药都进行大田试验，根据Atkins等人的研究，只有经实验室研究接触毒性LD50＞10μg/蜂（以有效成分计）的农药，才需考虑进一步开展大田试验。

供测定农药毒性用的蜜蜂，一般有东蜂（本地蜂）和西蜂二个品系，西蜂主要以意大利蜂为代表。

由于意大利蜂具有个大体壮、产蜜量高、蜜质好、性情较温和便于管理等优点，现已在全世界普遍养殖。

因此一般都用意大利成年工蜂作试验蜂种。

根据以上情况，农药对蜜蜂急性毒性试验按接触、摄入和熏蒸三种染毒方法分别进行。

农药对蜜蜂的毒性等级划分为四级，

（1）触杀毒性：

LC50＞11.0μg/蜂为低毒，2.0～11.0μg/蜂为中毒，0.001～2.0μg/蜂为高毒，LC50≤0.001μg/蜂为剧毒；

（2）摄入毒性：

LC50＞200mg/L为低毒，20~200mg/L为中毒，0.5~20mg/L为高毒，LC50≤0.5mg/L为剧毒。

1.3蜜蜂农药中毒的表现

蜜蜂突然大量死亡，蜂群越强，死蜂越多。

死蜂多为采集蜂，不少采集蜂死于蜂场附近和蜂箱周围，有的死蜂后足还带有花粉团。

中毒蜂在地上翻滚、打转、痉挛、爬行，身子不停地颤抖，最后麻痹死亡。

死蜂腹部内弯，翅膀张开呈“K”字形，吻伸出。

蜜蜂采集秩序混乱、漫天飞舞、追蜇人畜。

开箱检查，箱底有大量死蜂，箱内蜜蜂性情暴躁，爱螫人，提脾检查，可见大量蜜蜂无力附脾而掉落箱底；巢房内的大幼虫“跳子”至巢房口或脱落出来。

中毒严重的蜂群，有的全