利用重组酵母菌生产人胰岛素.docx

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利用重组酵母菌生产人胰岛素

利用重组酵母菌生产人胰岛素

摘要利用套叠PCR技术合成重组人胰岛素基因，并在A链和B链之间加入Kex2酶切α位点。

将合成的重组人胰岛素基因以正确的阅读框插入到组成型分泌表达载体pGAPZ-A的

αα-factor信号肽序列的下游，构建成pGAPZ-A/Insulin重组分泌表达载体。

表达载体用BlnI线

性化处理后电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞，构建成分泌型表达Insulin的工程菌。

SDS2PAGE和Native2PAGE的分析表明:

蛋白在分泌表达过程中，加入Insulin的A链

（2.4k）和B链（3.4k）之间的Kex2酶切位点发挥了作用，Kex2蛋白酶将A链和B链切

开，在α-factor信号肽的作用下通过分泌途径将A链和B链分泌到胞外，同时A链和B链又

以二硫键形成了高级结构。

WesternBlot结果表明:

重组蛋白能够与鼠抗人Insulin抗体发生特

异性反应，具有与天然Insulin相同的免疫原性。

通过单因素分析和正交实验法对巴斯德毕赤

酵母的高密度发酵培养基进行了筛选和优化;对高效表达人生长激素的培养条件进行了优

化;根据优化的摇瓶发酵结果进行了补料分批发酵;对表达产物进行了初步鉴定。

关键词:

重组人胰岛素，毕赤酵母，分泌表达，培养基优化，晶体收集

Abstract:

UsenestedPCRsynthesisofrecombinanthumaninsulingene,joinKex2cleavagesitesbetweentheAandBchains.ThesyntheticrecombinanthumaninsulingeneinthecorrectreadingframewasinsertedintotheconstitutivesecretoryexpressionvectorpGAPZα-Aα-factor

signalpeptidesequencePreparationtheconstructpGAPZα-A/Insulinrecombinantsecretory

expressionvector.TheexpressionvectorlinearizationBlnItreatedelectroporationcompetentcellsofPichiapastorisGS115constructedexpressionofsecretoryInsulinengineeredbacteria.TheanalysisSDS2PAGEandNative2PAGEshowedthat:

theproteinintheprocessofsecretionexpressionaddedInsulinAchain（2.4k）andKex2cleavagesitesbetweentheB-chain（3.4k）playedarole,Kex2proteaseoftheAandBchainscutthroughthesecretorypathwayintheroleoftheα-factorsignal

peptideoftheaandBchainssecretedintotheextracellulardomain,whilethea-chainandB-chaindisulfidebondformationYouyiadvancedstructure.WesternBlot:

Theresultsshowthattherecombinantproteinwasabletospecificallyreactwithmouseanti-humanInsulinAntibodieshavingthesamenaturalInsulinimmunogenicity.BysinglefactoranalysisandorthogonalexperimentmethodofhighdensityfermentationofPichiapastorismediumscreeningandoptimization;optimizedcultureconditionsofthehigh-levelexpressionofhumangrowthhormone;accordingflaskfermentationoptimizationresultsthefed-batchfermentation;preliminaryidentificationoftheexpressionproduct.

Keywords:

recombinanthumaninsulin,Pichiapastoris,secretionofexpression,mediaoptimization,crystalcollection

胰岛素是治疗糖尿病的常用特效药物，有很大的市场需求，以往主要是从猪、牛胰脏中提

取，近年来重组人胰岛素已占领了市场的大部分份额。

人胰岛素是首先在微生物中表达的蛋白

之一。

从1977年以后，在大肠杆菌和酵母中表达的重组人胰岛素在治疗中就取代了动物胰岛

素。

在大肠杆菌中表达的人胰岛素表现为单链或胰岛素原，它通常形成包涵体，在发酵后会变

性和重折叠。

在酵母中，能表达胰岛素单体或是二聚体，通过二硫键的正确配对形成正确折叠

的产物，后经过酶切转化成人胰岛素。

巴斯德毕赤酵母以其独特的生物学和遗传学特征成为当

今一种诱人的的外源基因表达系统，本文对人胰岛素的性质、巴斯德毕赤酵母基因表达系统的特点、菌体的大规模培养、研究进展及其对胰岛素基因的表达作一简要综述。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1质粒和菌种pGAPZα-A表达载体、E.coliTopl0F′、E.coliDH5α、P.pastorisGSll5均为Invitrogen公司产品，pMD18-TEasyVector购自Takara公司。

1.1.2生化试剂抗生素zeocin为Invitrogen公司产品，TaqDNA聚合酶、10×Taqbuffer、限制性内切酶（BlnI、XhoI和XbaI）以及T4DNA连接酶均购自TaKaRa公司。

DNA回收试剂盒、DNAMarker购自Tiangen。

蛋白质分子质量标准购自Solarbio公司。

一抗ratanti-human

Insulin购自北京赛驰生物科技有限公司，二抗goatanti-ratIgG-HRP购自Tiangen公司。

其它试剂均为国产分析纯。

1.1.3培养基细菌培养基为LB培养基，酵母平板培养基为YPD培养基，酵母种子培养基为BMGY培养基，酵母分批发酵培养基，酵母补料生长培养基，酵母诱导培养基，酵母鉴定培养基。

固体培养基为在液体培养基中加入1.5%的琼脂粉。

121?

高温灭菌20min。

考马斯亮蓝试剂:

考马斯亮蓝G-250100mg溶于50mL95,乙醇中，加入100mL85,磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL，滤纸过滤，最终试剂中含0.01,（w,v）考马斯亮蓝G-250，4.7,（w,v）乙醇，8.5,（w,v）磷酸。

标准蛋白质溶液:

结晶牛血清蛋白用0.15mol,LNaCl配成lmg,mL蛋白溶液。

1.1.4器材

分析天平、高压灭菌锅、恒温震荡培养箱、12.8L搅拌发酵罐、分光光度计、精密pH仪、高速冷冻离心机、生化培养箱、超级工作台、电泳仪、尾气分析仪、紫外检测仪、凝胶成像系统、FlexStand中空纤维中试切向流系统、QuixStand中空纤维切向流系统

1.2方法

1.2.1Insulin基因片段的合成及连接

1.2.1.1基因片段及引物设计与合成根据In2sulin氨基酸序列，选用毕赤酵母偏爱密码子，分3段合成Insulin基因:

（1）Insulin基因片段1（Ins1）:

5′-tttgtgaaccagcatttgtgtggttctcatctggtggaagctttgtacctcgtgtgtggtgag-3′;

（2）Insulin基因片段2（Ins2）:

5′-ttgctccacgatacctctttggtcttaggagtgtagaaaaaccctctctcaccacacacgag-3′;Kex2

（3）Insulin基因片段3（Ins3）:

5′-gttacagtagttttccagttggtagagagaacagatagaggtgcaacatt

gctccacgatacc-3′;

（4）引物1（P1）:

5′-tactcgagaaaagatttgtgaaccagcatttgt-3′;

XhoIKex2

（5）引物2（P2）:

5′-gaggtgcaacattgctccacgatacc-3′;

（6）引物3（P3）:

5′-gctctagactattagttacagtagttttccagt-3′;

XbaI

Ins1片段斜体划线部分与Ins2片段斜体划线部分互补，引物P1和P3分别引入XhoI和XbaI酶切位点，在P1和Ins2中各引入1个Kex2蛋白酶切位点。

基因片段及引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.1.2套叠PCR连接Ins1和Ins2基因片段利用Ins1和Ins2部分互补及引物P1、P2进行PCR反应，PCR采用25μl反应体系，10×Taqbuffer（含200mmol/LTris-HClpH8.4;200mmol/L

KCl;100mmol/L（NH4）SO;15mmol/LMgCl2.5μl，特异引物P1、P2和Insulin基因片段242

Ins1、Ins2（浓度为25μmol/L）各0.5μl，Taq酶1.25U，2.5mmol/LdNTP2μl，最后加ddHO将2体积调整为25μl。

在同一个PCR反应中，采用不同的退火温度，先使Ins1和Ins2退火延伸，再用P1和P2进行扩增，得到Ins1-Ins2片段。

PCR程序如下:

94?

5min;94?

300s，43?

30s，72?

30s，10个循环;94?

30s，47?

30s，72?

30s，20个循环;72?

，7min;4?

保存。

回收PCR产物，用于下步实验。

1.2.1.3套叠PCR连接Ins1-2和Ins3基因片段利用Ins1-2和Ins3两个片段的互补及引物P1、P3，反应体系同1.2.1.2，采用不同的退火温度扩增得到Insulin全长。

PCR程序如下:

94?

5min;94?

30s，37?

30s，72?

30s，10个循环;94?

30s，47?

30s，72?

30s，20个循环;72?

7min;4?

保存。

PCR扩增结束后，在2.0%琼脂糖凝胶中进行电泳并回收扩增产物，获Ins1-Ins2-Ins3即Insulin全长基因。

PCR产物回收后与克隆载体pMD18-TVector连接，用αCaCl法转化感受态细胞E.coliDH5，筛选得到的阳性克隆由TaKaRa公司测序鉴定。

2α1.2.2表达载体pGAPZ-A/Insulin的构建经测序鉴定后的质粒pMD18-TVector/Insulin

α和组成型分泌表达载体pGAPZ-A分别用XhoI和XbaI双酶切，然后将双酶切后的Insulin基

α因与表达载体pGAPZ-A用T4DNA连接酶在16?

连接过夜。

产物用CaCl法转化感受态细胞2

E.coliTopl0F′，转化子在含有25μg/mlzeocin的低盐LB平板上初筛，并通过提质粒双酶切鉴定筛选阳性克隆。

筛选的阳性克隆由TaKaRa公司测序鉴定。

α1.2.3工程菌GS115/pGAPZ-A/Insulin的构建及筛选参照PichiapastorisExpressionKit

α手册，表达载体pGAPZ-A/Insulin用BlnI线性化，然后用电转化法转化PichiapastorisGS115感受态细胞，转化参数为:

电压1500V，电容25μf，电击时间10ms。

转化子在含有100μg/mlzeocin的YPD平板上初筛，28?

培养2,3d长出单菌落，然后通过菌落PCR筛选阳性克隆。

1.2.4发酵及表达产物的SDS-PAGE分析在转化平板上挑取单菌落于10mlYPD+Zeocin（100μg/ml）培养基中，28,30?

，250r/min振荡培养至OD600为2,6;吸取0.1ml菌液到50mlYPD+zeocin（100μg/ml）培养基中，继续培养5d。

收集菌液，4?

，12000r/min，离心10min，取上清;取1.5ml加入5倍体积的丙酮，-20?

放置过夜;4?

，12000r/min，离心10min，弃上清，风干;加入150μlddHO溶解后作为SDS-PAGE分析样品。

以Tricine-尿素-2

SDS-PAGE对发酵产物进行分析。

1.2.5发酵产物的浓缩及Native-PAGE分析取10ml发酵液离心，600r/min，5min，去除沉淀下的细胞，取上清，并测量上清液的体积;缓慢加入（NH4）SO，使其浓度达到65%24

（0.43g/ml）;离心，12000r/min，15min，取上清;缓慢加入（NH）SO。

使其浓度达到95%424

（0.71g/ml）;离心，12000r/min，15min，取沉淀;将（NH4）SO沉淀后的蛋白利用透析袋24

（透析袋规格:

截留分子质量Mr=3500）进行透析。

将透析后的发酵产物进行Native-PAGE分析。

α1.2.6Westernblotting分析取GS115、GS115/pGAPZ-A和工程菌的培养上清进行SDS-PAGE，然后将蛋白从凝胶中经电转移至硝酸纤维素膜上，先用1%的BSA封闭1h，用鼠抗人胰岛素抗体为一抗（抗体稀释比例为1?

300），山羊抗鼠IgG-HRP为二抗（抗体稀释比例为1?

250），Tiangen底物显色试剂盒显色，做蛋白印迹检测。

Tiangen底物显色试剂盒显色，检

α测重组蛋白的抗原特异性，分析时设GS115和GS115/pGAPZ-A的培养上清液作为阴性对照。

1.3菌体培养

1.3.1摇瓶培养方法

温度30?

，摇床转速230r,min，摇瓶装液量30mL,300mL三角瓶。

1.3.1.1单因素实验设计

分别以葡萄糖、甘油作为碳源，对比两者培养效果，利用SPSS软件对实验数据进行分析处理，选取培养效果好的作为碳源;分别以硫酸铵、酵母粉作为氮源，对比两者培养效果，选取效果好的作为氮源。

然后对碳源的九个水平（10、15、20、25、30、35、40、45、50g,L）、氮源的九个水平（4、6、8、10、12、14、16、18、20g,L）、0.1mol,L磷酸盐缓冲液的九个水平（10、20、30、40、50、60、70、80、90mUL）、MgS04?

71-120的九个水平（8、9、10、11、12、13、14、15、16g,L>、初始pH值的九个水平（5.0、5.3、5.5、5.7、6.0、6.3、6.5、6.7、6.9）等进行单因素分析，用单因素试验筛选出四个因素的三个最佳水平，作为正交试验的因素和水平。

1.3.1.2正交试验设计

4用L（3）表安排四因素三水平实验，以甘油用量为A因素（水平为30g,L，35g,L，9

40g,L），酵母粉用量为B因素（水平为l2g,L，14g,L，16g,L），0.1mol,L磷酸盐缓冲液用量为C因素（水平为40mL,L、50mL,L、60mL,L），MgS0?

7HO为D因素（水平为42

13g,L，14g,L，15g,L）进行实验，共九个组合，每个组合设三次重复。

1.3.2分批补料发酵方法

1.3.2.1种子液制备

从新鲜YPD平板上挑取单菌落，接入含BMGY培养基50mL,300mL的摇瓶，30?

、230r,min下培养20h，作为一级种子。

再以10,的接种量接入BMGY培养基50mL（10瓶），同样条件下培养18h，至OD600为20左右，作为发酵罐种子液。

分批补料发酵1.3.2.2

培养在12.8L全自动发酵罐中进行，发酵罐中装入改良BSM培养基6L，按8,接种，培养过程中通气量不小于10L,min，通过改变搅拌转速保持溶氧水平不低于30,，用氨水调节pH至6.6。

菌种生长初期DO较高，随着茵体的生长，耗氧量增加，DO不断下降。

待DO降到30以下时，提高转速，当搅拌速率达到800r,min，解除溶氧搅拌关联。

当DO陡然上升（表明甘油已经耗尽，耗时约16h），开始补加50,甘油（含12mL,LPTMl），并控制流加速度维持DO在30,-40,，当发酵液的OD600至300左右时，开始加入甲醇（含12mL,LPTMl）诱导，甲醇补加速率由低到高，甘油补加速率逐渐降低最后停止，该过度阶段约维持4-6h。

根据溶氧的变化及尾气分析仪在线检测到的C0变化情况及时调整甲醇和氮源补加速率，适时放罐。

2

1.3.3分析测定方法

1.3.3.1实验数据分析方法

单因素分析与正交试验数据用SPSS统计软件进行分析处理。

1.3.3.2细胞光密度分析

菌液稀释后于波长600nm处以去离子水为对照进行比色测定，OD600=OD读数X稀释倍数。

1.3.3.3温度、pH、转速、溶氧及补料速度检测

瑞士Bioengineering公司L1523型12.8L自动控制发酵罐，在线检测。

1.3.3.4表达产物分析

发酵液置于低速冷冻离心机内以5000r,min恒温4"C离心10min，取上清液于一80?

冻存备用。

凝胶电泳（分离胶15,，浓缩胶5,SDS（PAGE），以rhGH标准品为对照，电泳凝胶经UVP公司UVTransilluminator凝胶成像系统扫描后由Labwork4.0图像分析软件定量分析。

SDS-PAGE凝胶电泳方法:

按照参考文献配置分离胶和浓缩胶，先将分离胶注入长、短玻璃板

间的缝隙内，以水封。

待其聚合后倾去水，注入浓缩胶。

轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，静置使凝胶聚合。

在每个凹形加样槽内只加一种样品或分子量标记。

向电极槽中倒入电极缓冲液，以50V恒压电泳至染料前沿迁移至胶板底边1,1.5cm处，停止电泳。

取下胶板，用固定液固定过夜，染色2小时后脱色。

凝胶电泳板脱色后，用凝胶成像系统（uvTransilluminator）进行分析可得到类rhGH的含量，再乘以总蛋白浓度即为rhGH浓度。

1.3.3.5总蛋白测定:

考马斯亮蓝染色法

考马斯亮蓝法

（1）蛋白质标准曲线的制定

取10支试管，在分光光度计（595nm）上测定吸收度。

（2）蛋白质含量的计算

精确称取样品，以O（15mol,LNaCl为溶剂配成5mg,mL溶液，按标准曲线制作方法操作，测定不同浓度下光密度（OD595）值，对照标准曲线，得出样品的蛋白质含量，按下述公式计算出样品中蛋白质百分含量。

蛋白质含量,=测得蛋白含量/500×100,

1.4菌体收集

菌体收集单元操作是原核胞内表达蛋白，如重组人胰岛素生产的常规步骤。

相比传统离心操作，中空纤维膜过滤技术具有处理速度快、寿命长、设备日常维护简单、可直接线性放大等特点，可以更好的满足重组胰岛素药物生产过程中数十吨级规模发酵液菌体收集对生产工艺重复性、工艺可放大性和经济性的要求。

1.5晶体收集

多步层析精细纯化得到的胰岛素在冷冻干燥之前，常采用多次结晶和洗涤工艺进一步去除杂质、提高产品纯度。

相比传统晶体沉降或离心收集工艺，中空纤维0.45微米滤膜可以有效截留胰岛素晶体，快速减小样品体积，从而实现高效的胰岛素晶体收集。

此外，封闭的操作系统最大程度避免敞口操作，保证终产品质量安全。

本研究采用中空纤维0.45μm微滤膜进行重组胰岛素蛋白晶体快速收集，成功实现50倍以上浓缩，显微镜观察显示所得晶型完好。

2预期结果

2.1套叠PCR连接Insulin基因片段及克隆载体的构建

回收套叠PCR产物（183bpInsulin基因片段），与载体pMD18-Tvector连接构建成克隆载

α体pMD18-T-Insulin，转化大肠杆菌DH5后，通过PCR及双酶切验证阳性克隆，确定阳性克隆插入序列正确。

α2.2分泌型表达载体pGAPZ-A-Insulin的构建

用XhoI/XbaI双酶切pMD18-T-Insulin后回收Insulin基因，然后与同样经XhoI/XbaI双酶

αα切回收的pGAPZ-A载体片段连接，构建成表达载体pGAPZ-A-Insulin，菌落PCR和双酶切鉴定以及测序分析以确定表达载体已构建成功。

α2.3工程菌GS115/pGAPZ-A/Insulin的构建与筛选αpGAPZ-A/Insulin表达载体经BlnI线性化后，利用电转化法转化毕赤酵母GS115感受态细胞。

转化培养2,3d长出单菌落后，利用菌落PCR和SDS-PAGE筛选阳性克隆。

2.4不同培养时间对重组Insulin表达的影响

分别分析工程菌摇瓶培养1,5d的培养基上清，先观察重组蛋白在24h时的表达量，然后随着培养时间的延长观察表达量的变化，可能表达量会升高，也有有可能在升高到一定程度后

开始降解。

综合考虑以上因素，确定在本实验条件下，工程菌目的蛋白可获得最高的表达所需要的培养时间。

2.5发酵产物的Native-PAGE电泳检测

将发酵产物通过（NH4）SO盐析分级沉淀和透析袋透析后所获得的蛋白产物以human24

Insulin的标准蛋白为对照进行Native-PAGE电泳。

通过电泳，可以检验不同培养时间下蛋白产物表达量的高低以及A、B链是否通过二硫键连接而未分开。

2.6Westernblotting分析

工程菌培养上清能与鼠抗人Insulin抗体发生抗原抗体反应，呈现两条特异条带，而阴性对

α照GS115和GS115/pGAPZ-A在相应的位置没有特异条带。

由此确定表达的蛋白确实是humanInsulin。

2.7菌种发酵条件的选择

通过单因素实验设计和正交试验设计方法确定最佳的碳源和氮源，pH等的最佳发酵条件，按照测得的条件进行发酵获得产物。

2.8产物收集

使用选择的新型分离方法进行产物收集纯化，与传统收集方式进行比较。

3讨论

19世纪80年代以来，人们希望能在细菌中表达胰岛素和胰岛素原，包括独立表达A链和B链[6]，以及完整的胰岛素原[7,8]，但效果不好，这是因为细菌中的蛋白水解作用而引起

）缺少蛋白翻译后修饰和加工;外源蛋白N2末端降解。

而且这一系统表现出若干缺陷:

（1

（2）表达的蛋白多以包涵体形式存在，需要经过复杂的复性才能恢复构象和活性;（3）背景杂蛋白很多,纯化起来麻烦。

在用巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）表达系统生产人胰岛素的过程中，常用的方法是在Pichiapastoris中表达猪胰岛素前体[9]、胰岛素原[10]、B1-29-A-A-K-A1-21[11,12]，这样得到的猪胰岛素前体需要经过转肽操作，才能获得重组人胰岛素结晶，获得的胰岛素原和胰岛素原类似物在纯化后还需要通过酶切去除C