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微生物培训笔记

细菌检验基础知识

1、分类

细菌属于原核细胞型微生物。

最精确的方法为遗传学分类方法。

最常用的是经典传统分类法：

按照细菌的亲缘关系，界门纲目科属种型株分类。

科：

由共同情书关系的属组成，如肠杆菌科；

属：

是种的高一级分类单位，通常包含有共同特征或关系密切的种，用以描述微生物的主要特征，如埃希氏菌属；

种：

是分类等级的基本单位，同一种微生物形态、生理学特征和组成成分基本相同，用以描述微生物的次要特征，如大肠埃希氏菌；

菌株或品系：

同一种微生物中不同来源的纯培养物，如大肠埃希氏菌CGMCC1.3373。

2、细菌形态学及形态学检查法

细菌形态结构主要指细菌的大小、形状、排列及超微结构。

细菌结构与其生理功能、致病性、免疫性有关。

2.1形态结构

2.1.1基本形态3类：

球菌、杆菌、螺旋菌，杆菌是最常见的形态。

2.1.2大小

测量细菌大小的单位为微米μm。

球菌以直径表示大小，杆菌以长与宽表示大小，

同一种细菌在不同情况下大小形态也有差别：

涂片干燥、固定、染色时细菌收缩；快速生长的球菌往往呈短杆状。

菌龄与细菌大小的关系受许多因素影响，主要与代谢废物的积累及培养基中渗透压上升等因素有关。

2.1.3结构

基本结构：

细胞壁、细胞膜、细胞质、核质；

特殊结构：

鞭毛、菌毛、荚膜、芽孢等。

菌毛是什么？

-菌毛（Pilus）许多革兰氏阴性菌菌体表面遍布的比鞭毛更为细、短、直、硬、多的丝状蛋白附属器，也叫做纤毛（Fimbriae）。

其化学组成是菌毛蛋白（Pilin），菌毛与运动无关。

菌毛可分为普通菌毛（Commonpilus）和性菌毛（Sexpilus）两种。

普通菌毛长0.3～1.0um,直径7nm。

具有粘着细胞（红细胞、上皮细胞）和定居各种细胞表面的能力，它与某些细菌的致病性有关。

无菌毛的细菌则易被粘膜细胞的纤毛运动、肠蠕动或尿液冲洗而被排除，失去菌毛，致病力亦随之丧失。

性菌毛有的细菌还有1～4根较长的性菌毛，比普通菌毛而粗，中空呈管状。

性菌毛由质粒携带的一种致育因子（Ferilityfactor）的基因编码，故性菌毛又称F菌毛。

带有性菌毛的细菌称为F+菌或雄性菌，无性菌毛的细菌称为F-菌或雌性菌。

F+菌体内的质粒或染色体DNA可通过中空的性菌毛进入F-菌体内，这个过程称为接合（conjugation）。

细菌的毒性及耐药性等性状可通过此方式传递，这是某些肠道杆菌容易产生耐药性的原因之一。

（摘自XX）

2.2形态学检查法

分为不染色标本检查法和染色标本检查法。

不染色标本检查法：

依靠普通显微镜，虽可观察细菌大小、形态，但主要用于观察细菌的动力。

观察细菌有动力时，应选用新鲜的幼龄培养物（幼到啥程度？

-对数期），并在20℃以上室温中进行，同时应掌握区别细菌真正运动与溶胶的布朗运动。

常用的方法有压滴法、悬滴法、暗视野映光法等。

染色标本检验法：

分为单染色法、复染色法、特殊染色法。

观察细菌菌毛应使用鞭毛染色法。

细菌学中最常用的鉴别染色法是革兰氏染色法。

基本步骤为：

涂片→干燥→固定→染色

革兰氏染色的结果与培养基成分、培养条件及操作技术等有着密切关系。

酒精脱色为关键步骤。

3、细菌生理学

3.1化学组成

水、蛋白质、糖类、脂类、无机盐、核酸、维生素，各种组成随细菌种类、菌龄、细菌所处环境不同而有差异。

固形成分占菌体质量15%~25%，其中碳、氢、氧、氮四种元素占90%~97%，其他元素占3%~10%。

水分：

占细菌质量75%~85%，芽孢约40%。

繁殖体内主要是游离水，芽孢内主要是结合水。

结合水不易蒸发，不冻结，不能作为溶剂，也不能渗透。

蛋白质：

分布在菌体各个组成部分，占菌体固形成分50%~80%。

除少量白蛋白、球蛋白等单纯蛋白质外，绝大部分与其他物质结合成复合蛋白质，如核蛋白、糖蛋白、脂蛋白等，其中核蛋白含量最高。

蛋白质是维持细菌生命活动的最基本物质，是细菌酶类的主要组成部分。

核酸：

分RNA（细胞质、细胞膜中，约占固形成分10%）与DNA（染色体、质粒中，占固形成分3%左右）两种。

糖类：

占固形成分10%~30%，主要以多糖形式存在，如荚膜多糖、纤维素、淀粉、糖原等。

脂类：

细菌体内能量储存场所。

无机盐类：

调节剂渗透压和维持酶活性的作用。

其他：

生长因子主要是B族维生素，大多数是菌体内的辅酶成分。

色素种类很多，一般都是含氮的有机物。

3.2物理性状

带电现象：

菌体蛋白质由许多氨基酸组成。

氨基酸是兼性离子，在等电点时，其所带正电荷与负电荷相等。

革兰氏阳性菌pH2~3，革兰氏阴性菌pH4~5。

一般培养、染色、血清学试验中，多数为中性或弱碱性环境，pH值高于细菌等电点，均带负电荷。

环境中pH值越高所带负电荷越多。

带电现象与细菌的染色反应、凝集反应、抑菌、杀菌作用等都有密切关系。

多相胶体：

原生质中具有多种蛋白质，成分结构各不相同，为多相胶体，因此可同时进行各种性质不同的生化反应。

细胞外浓度较低的化学物质可被原生质中的某一相选择性的吸收浓缩于细胞内。

表面积：

单位体积的表面积比其他大生物的表面积大。

每立方厘米葡萄球菌的表面积为60000cm2。

因而细菌代谢活跃，繁殖速度很快，同样对外界环境因素的影响也十分敏感。

布朗运动：

在溶液中，因受到分散酶分子的撞击，发生不移动位置的颤动，叫做布朗运动。

光学性质：

菌体呈半透明状态，光线照射菌体时，一部分光被吸收，一部分光发生散射，所以细菌悬液呈现浑浊现象。

渗透性：

细菌的细胞壁和细胞膜都有半渗透性，吸收营养和代谢产物均依赖于这种通透作用。

细菌具有坚韧的细胞壁，除能耐受菌体内部的高渗透压外，还能保护细菌在渗透压较低的环境中不致破裂，但在纯水中也不免吸收水分而胀裂。

3.3代谢

细菌为了生长繁殖，必须从环境中吸取营养物质作为能源和基本原料，并排出不需要的产物，这些生化过程称为细菌的代谢，包括分解代谢和合成代谢。

3.3.1分解代谢及生化反应

定义：

将复杂的营养物质分解为简单的化合物，一方面提供合成菌体成分的原料，一方面从物质分解中获得能量。

（1）糖类：

大多数细菌能利用糖，由于各种细菌所具有的酶系统不同，故分解糖类的能力也不同。

基本的糖代谢过程：

多糖→单糖→丙酮酸，而丙酸酮进一步分解的后续过程则因各种细菌而异。

1）糖发酵试验：

经常用于细菌的鉴别。

如大肠埃希氏菌，使丙酮酸生成甲酸，并由甲酸解氢酶分解甲酸生成CO2和H2，所以分解葡萄糖时产酸产气；而伤寒杆菌只有使丙酮酸生成甲酸的能力，分解葡萄糖只能产酸不能产气。

2）V-P试验：

产气杆菌能使丙酮酸脱羧，生成中性乙酰甲基甲醇。

乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被大气中的氧分子氧化，生成红色化合物，这一反应成为V-P试验阳性。

大肠埃希氏菌不生成乙酰甲基甲醇，故阴性。

该实验肠道菌必做。

3）甲基红试验：

在上述产气杆菌培养液中，由于2个分子的丙酮酸已变为1个分子的中性乙酰甲基甲醇（位于有氧无氧分解的交界点上），生成的酸量就相应减少，故pH值相应较高（pH5.4以上），用甲基红做指示剂时，培养液呈现橘黄色，称为甲基红试验阴性。

而大肠埃希氏菌因分解丙酮酸时不产生乙酰甲基甲醇，产生的酸较多，故培养液的pH值下降到4.5或更低，因此甲基红指示剂呈红色反应，即阳性。

（2）蛋白质：

蛋白质分子量大，不能被菌体直接吸收作为营养基质，有必要先通过细菌的胞外酶，如蛋白酶，把蛋白质分解成为能透进细胞壁与细胞膜的多肽或氨基酸，才能运转入菌细胞内被利用。

细菌分解蛋白质的过程一般为：

蛋白质→蛋白䏡（音“示”）→蛋白胨→多肽→氨基酸。

不同细菌分解蛋白质的能力不同，可用明胶液化试验或蛋白质消化试验来鉴别细菌的种类。

氨基端进一步分解主要分三种方式进行：

脱氨基作用、脱羧基作用、其他分解作用（生成吲哚、生成硫化氢、分解尿素）。

（3）枸橼酸盐利用试验：

产气杆菌能利用枸橼酸盐作为碳源，因而在仅含枸橼酸盐而不含其他碳源的培养基上生长，分解枸橼酸盐生成碳酸盐，使培养基由原来的中性变为碱性，以溴麝香草酚蓝为指示剂可显示出培养基由绿色变为深蓝色，即枸橼酸盐阳性。

相反，大肠杆菌不能利用枸橼酸盐为唯一碳源，故不能在此培养基上生长，培养基颜色不变，为阴性反应。

3.3.2合成代谢及其产物

（1）毒素与侵袭性酶：

细菌产生的内毒素和外毒素均有强烈毒性，尤以外毒素为甚。

内毒素为革兰氏阴性菌的细胞壁成分，即脂多糖，其毒性存在于脂类A部分，当菌体死亡崩解后才游离出来。

其性质稳定，加热至160℃2~4h或用强酸、强碱或强氧化剂加温煮沸30min才灭活。

外毒素是蛋白质，在细菌生活过程中即可释放出菌体。

产生外毒素的细菌大多是革兰氏阳性菌，但也有少数革兰氏阴性菌。

其性质不稳定，易被热（50~60℃20~120min）破坏。

某些细菌还能产生具有侵袭性的酶，能损伤机体组织，如产气荚膜梭菌的卵磷脂酶、链球菌的透明质酸酶等。

（2）热原质：

许多革兰氏阴性杆菌能产生一种多糖，将它注入人体或动物体内能引起发热反应，故称热原质。

121℃20min也不能破坏。

用吸附剂和特制石棉滤板可除去输液中的大部分热源质，玻璃器皿上的热原质则需在250℃高温下干烤才能破坏（时间？

）。

如变形杆菌、铜绿假单胞菌（旧称绿脓杆菌）。

（3）色素：

有些细菌在一定条件下（氧气充足、温度适宜或暴露阳光）能产生各种颜色的色素。

产生的色素有的能溶于水而扩散至周围环境中，另一些色素为脂溶性不溶于水仅使菌落本身有色。

（4）抗生素：

主要是由某些微生物在代谢过程中产生的一种抗生物质，能抑制或杀死某些生物细胞（主要是微生物和肿瘤细胞）。

抗生素主要由放线菌和真菌产生，由细菌产生的较少，只有多黏芽孢杆菌产生的一组多肽类抗生素（多黏菌素）和由第一芽孢杆菌产生的多肽类抗生素（杆菌肽）等少数几种。

（5）细胞素：

某系细菌种株间产生的一类具有抗菌作用的蛋白质。

与抗生素不同，其抗菌范围狭窄，仅对产生与细胞素的菌株有近缘关系的细菌才有抑杀作用。

由于其具有特异性，已用于细菌种内的分型。

（6）维生素：

维生素是细菌必须的生长因子，有些细菌能自己合成，除供菌体本身所需外，也能分泌至菌体外。

人体肠道内的大肠埃希氏菌能合成维生素B6、B12、K2等，可供人体所需。

4、细菌的培养和分离技术

4.1用途

通过细菌培养可以研究细菌的形态、代谢活动、生化反应、抗原结构及致病力等，并且对细菌进行鉴定。

细菌培养应用于食品和环境等样品的细菌学检验，以评价食品或环境的卫生情况。

对患者或带菌者体内（代谢物）的病原菌进行培养，鉴定其种属并对病原菌进行药物敏感性试验，从而做出确切的病原学诊断，选择有效药物进行治疗。

4.2培养所需条件

4.2.1培养基：

细菌培养所使用的培养基应满足细菌生长和鉴别所需要的条件，选择相应的营养要素和基质成分。

按其用途可分为六大类：

基础培养基、营养培养基、选择培养基、鉴别培养基、特殊培养基和厌氧培养基。

现使用的商业化的培养基为干燥培养基，其中含有培养基的各种成分，使用时只要按一定比例加入适量水分即可，具有节省制备时间、质量稳定、携带方便等优点。

4.2.2细菌培养的其他条件

合适的酸碱度：

对细菌的生长繁殖影响很大。

多数病原菌最适宜的酸碱度在pH7.2~7.6之间，个别细菌如霍乱弧菌可在碱性pH8.4~9.2环境中生长。

许多细菌在培养过程中因分解糖类而产酸，影响了本身的生长，因此有时需在培养基中加入磷酸氢二钾、磷酸氢二钠等缓冲剂，防止溶液pH值波动过大。

适宜的温度：

一般细菌在15~40℃都能生长，但多数病原菌的最适生长温度为36~37℃。

一定的湿度：

细菌生长需要一定的水分，以利于营养物质的渗透。

干燥不利于细菌的生长。

必要的气体环境：

需氧菌须在有氧环境下生长，厌氧菌须在无氧条件中才能生长。

牛布鲁氏菌及脑膜炎球菌初分离时，必须在培养环境的大气中增加5%~10%的CO2。

4.3细菌培养法

根据对氧气需求不同可分为需氧培养和厌氧培养。

根据培养基的物理状态不同分为液体培养、固体培养、半固体培养。

4.3.1液体培养：

不同类型的细菌在液体培养基中会出现不同的生长现象。

（1）浑浊：

细菌向四周均匀扩散，出现肉眼可见的不同程度的均匀浑浊生长。

（2）沉淀：

少数排列成链状的细菌可呈沉淀式生长，沉淀物上面的液体清澈，如链球菌。

（3）菌膜：

专性需氧菌多生长在液体表面，形成菌膜，如枯草杆菌。

4.3.2固体培养

将检材中的目标对象菌用人工培养法分离出来成为纯种，称为分离培养。

常用的分离方法有平板划线分离法和涂布法。

分离培养可使细菌在平板培养基表面生长。

如果接种的细菌能适当的分开，经一定时间培养后，便形成单一菌落。

菌落的大小、形状、色泽、边缘、透明度、湿润度、溶血现象等特点则因细菌的种类和所用培养基不同而异。

菌落的这些特征是识别细菌的重要依据。

当细菌在固体培养基表面密集生长时，多个菌落融合在一起，称为菌苔。

4.3.3半固体培养

细菌在半固体培养基中生长时，无鞭毛的细菌沿着穿刺线生长，有鞭毛的细菌，除了沿穿刺线生长外，还可看见从穿刺线向外扩散生长的趋势。

因此，以穿刺法将细菌接种于半固体培养基中有助于鉴别细菌是否有动力，是否有鞭毛。

5、细菌的生物化学试验

利用生物化学的方法来检查这些代谢产物以鉴别细菌的方法称为细菌的生物化学试验，简称生化试验。

5.1糖类代谢试验

5.1.1糖（醇）类发酵试验

不同细菌含有发酵不同糖（醇）的酶，因而发酵糖（醇）的能力各不相同。

即使某些能发酵同样的糖（醇），但其产物也不同，有的产酸产气，有的产酸不产气，可根据这些特点来鉴别细菌。

大致可分为：

液体发酵管：

无糖肉汤或蛋白胨水中，加入1%糖（醇）类指示剂，一支小玻管，经灭菌后备用。

若被检细菌对营养要求较高时，则在试验前加入2%~5%无菌血清。

半固体发酵管：

在液体糖（醇）发酵培养基中，加入0.3%~0.5%琼脂，溶化后分装试管，灭菌后让试管直立，使琼脂凝固，做成高层培养基，接种细菌应用接种针穿刺接种。

固体发酵管：

此类培养基一般不常用，仅用于营养要求较高的某些细菌，在含糖类及5%~10%血清琼脂斜面上进行发酵试验。

另外固体高层糖发酵管，可用于厌氧细菌糖发酵试验，如产气荚膜杆菌在含糖的固体高层发酵管中出现汹涌发酵（产生大量气体）。

双糖（或三糖）高层斜面发酵管：

这种培养基含有葡萄糖和乳糖（或再加蔗糖），这两种糖（或三种糖）混在一起，制成高层斜面（有没有直径与高的比例？

），其中葡萄糖和乳糖（或蔗糖）比例为1:

10。

各种糖（醇）发酵管含糖（醇）的浓度，一般为0.5%~1%，有时可达2%。

经121℃20~30min灭菌，容易水解变质，特别是在碱性溶液中更易破坏。

故糖（醇）发酵培养基常用高压蒸汽115℃15min灭菌。

应用的糖（醇）种类很多：

单糖：

葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、木胶糖、半乳糖；

双糖：

乳糖、麦芽糖、蔗糖、覃糖（啥糖？

-音qin2，应该是海藻糖）；

多糖：

菊糖、肝糖、糊精、淀粉；

醇：

甘露醇、卫矛醇、山梨醇、侧金盏花醇、肌醇、丙三醇（甘油）；

糖苷：

水杨苷等。

最常用的指示剂有酚红、溴麝香草酚蓝、溴甲酚紫、酸性复红。

前两者颜色反应较敏感，但稳定性差，后二者比较稳定。

特别是一些迟缓发酵的细菌，培养时间长，应用后二者指示剂。

酚红pH6.8（黄色）~pH8.4（红色）

5.1.2甲基红试验（methylred）

甲基红指示剂变色范围是pH4.4（红色）~pH6.2（黄色），产气肠杆菌分解葡萄糖产生丙酮酸，但又很快将丙酮酸脱羧，转化成醇等物质，则培养液的pH值仍在6.2以上，故此时加入甲基红指示剂，培养液呈黄色，此为阴性对照菌。

阳性对照菌是大肠埃希氏菌，呈现红色为阳性。

5.1.3V-P试验

伏-普试验，目的是检查细菌是否能分解葡萄糖，产生乙酰甲基甲醇。

阳性对照菌是产气肠杆菌，分解葡萄糖（被检细菌接种到葡萄糖蛋白胨水中，36℃18~24h）产生丙酮酸，再将丙酮酸脱羧形成乙酰甲基甲醇，在碱性条件下（乙液-40%KOH溶液），被氧化为二乙酰，与培养基蛋白胨中精氨酸等所含的胍基（甲液-6%α-萘酚酒精溶液？

）结合，通常在10min内形成红色化合物。

若不显色，放置于50℃水浴2h，或放置于37℃培养箱中4h，充分摇动，观察培养液反应结果，不显红色为阴性，阴性对照菌是大肠埃希氏菌。

5.1.4ONPG试验

邻硝基酚-β-D-半乳糖苷的缩写，利用该试剂可以检查被检细菌有无β-半乳糖苷酶和渗透酶，发酵乳糖的细菌具有这两种酶。

渗透酶将乳糖分子带入菌细胞内，而β-半乳糖苷酶可将乳糖的β-半乳糖苷链切断，产生葡萄糖和半乳糖。

迟缓发酵乳糖的细菌，缺乏渗透酶，而ONPG渗入菌细胞内，被β-半乳糖苷酶分解产生邻位硝基苯酚，一般在20~30min内显黄色，为阳性，对照菌为枸橼酸盐杆菌和亚利桑那菌。

方法：

将被检细菌接种到1%的乳糖肉汤琼脂培养基上，37℃培养过夜。

取菌苔接种于0.25ml生理盐水中做成悬液。

加入1滴甲苯，并充分振摇，使酶释放。

在悬液中再加入ONPG液0.25ml，混匀，置于37℃培养箱或水浴箱中，分别在20min和3h后观察培养液反应结果

不出现黄色者为阴性，对照菌是沙门氏菌。

5.1.4氧化发酵试验

测定糖类的氧化或发酵及糖类未被利用的代谢类型。

氧化型：

细菌在分解葡萄糖过程中，必须有氧分子参加。

无氧环境中不能分解葡萄糖。

发酵型：

在分解葡萄糖的过程中，可以进行无氧降解。

发酵型细菌无论在有氧或无氧的环境中都能分解葡萄糖。

产碱型：

不分解葡萄糖的细菌。

将待检菌同时穿刺接种两支HL培养基，其中一支培养基滴加无菌的液体石蜡油，高度不少于1cm，37℃培养48h或更长，观察反应结果。

培养基变黄色为产酸。

两支培养基均产酸为发酵型细菌，仅不加石蜡的培养基产酸的是氧化型细菌，两支培养基均不变化的为产碱型细菌。

5.2蛋白质、氨基酸及含氮化物代谢试验

5.2.1苯丙氨酸脱氨酶试验

原理：

某些细菌具有苯丙氨酸脱氨酶，可使苯丙氨酸脱氨形成苯丙酮酸，苯丙酮酸与三氯化铁发生螯合作用，形成绿色络合物。

方法：

将被检细菌的斜面培养物（先增菌）大量移种到苯丙氨酸琼脂斜面上，37℃培养18-24h，再从斜面上滴加10%三氯化铁溶液4-5滴，使其自斜面培养物上缓缓流下（？

多慢，快了会怎样？

），观察结果。

结果：

溶液出现绿色为阳性，对照菌是变形杆菌；不变色为阴性，对照菌是产气肠杆菌。

5.2.2脱羧酶试验

原理：

某些细菌具有某种氨基酸的脱羧酶，可使氨基酸脱去羧基产生胺和二氧化碳，胺使pH值>7，此时指示剂溴麝香草酚蓝由绿色变为蓝色。

溴麝香草酚蓝酸性显黄色，碱性显紫色。

方法：

将被检细菌接种到两支脱羧酶培养基中，其中一支不加氨基酸，另一支加赖氨酸/精氨酸/鸟氨酸，再在培养基上覆盖一层灭菌的液体石蜡，37℃培养18-24h，观察结果。

结果：

两管培养基均含有葡萄糖，产酸，溴麝香草酚蓝由蓝变黄。

含有氨基酸的一管出现脱羧基降解作用，产生碱性反应，溴麝香草酚蓝再由黄变蓝，为阳性。

鸟氨酸阴性对照菌为阴沟肠杆菌，显黄色。

5.2.3靛基质（吲哚）试验

原理：

某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，产生靛基质（吲哚），靛基质与对二甲氨基苯甲醛结合，形成玫瑰红色化合物。

方法：

将被检细菌接种到胰蛋白胨水培养基中，37℃培养24-48h后，滴加数滴试剂于培养基液面，轻轻摇动（不可剧烈振动），观察结果。

结果：

出现红色为阳性，对照菌是大肠埃希氏菌；出现黄色为阴性，对照菌是产气肠杆菌。

5.2.4硫化氢试验

原理：

某些细菌能分解含硫的氨基酸（胱氨酸、半胱氨酸等），产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铅盐或铁盐反应，形成黑色沉淀硫化铅或硫化铁。

方法：

将被检细菌以接种针穿刺接种于醋酸铅或双糖铁培养基（哪双糖？

-乳糖+葡萄糖）中，37℃培养24h，观察结果。

结果：

有黑色出现为阳性。

说明：

在硫化氢试验的培养基加入硫代硫酸钠的作用是还原作用，以保持培养基处于还原状态，是产生的硫化氢不被氧化。

产硫化氢较少的菌种可在试管口放置醋酸铅试条。

5.2.5尿素酶试验

原理：

某些细菌具有尿素酶，在含有尿素的培养基中，分解尿素产生氨，使培养基呈碱性，此时培养基中的酚红指示剂显红色。

方法：

将被检细菌接种的尿素固体斜面培养基上，36℃培养4h检查一次，再每天检查一次，培养5天，观察结果。

结果：

出现红色为阳性，对照菌为变形杆菌；变色为阴性，对照菌是大肠埃希氏菌。

5.3枸橼酸盐利用试验

原理：

枸橼酸盐培养基系一综合性培养基，其中枸橼酸钠为碳的唯一来源，磷酸二氢铵是氮的唯一来源。

有的细菌能利用枸橼酸钠为碳源，能在培养基上生长，并且能分解枸橼酸盐，最后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。

培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。

不能利用枸橼酸盐为碳源的细菌在该培养基上不生长，培养基不变色。

方法：

将被检细菌的菌悬液（啥是菌悬液？

-挑取菌苔后，洗至生理盐水中）接种到枸橼酸盐培养基上，37℃培养24h，观察结果。

结果：

培养基上有菌生长，培养基变为深蓝色为阳性，对照菌是产气肠杆菌；若培养基不变色，则继续培养7天，培养基仍不变色者为阴性，对照菌为大肠杆菌。

5.4呼吸酶类试验

5.4.1氧化酶试验

原理：

某些细菌具有氧化酶，能将二甲基对苯二胺或四甲基对苯二胺试剂氧化（先使细胞色素C氧化，电子传递体）成红色醌类化合物。

方法：

取白色洁净滤纸蘸取待测菌落，加盐酸二甲基对苯二胺溶液1滴；Ewing氏改进法，再加α-萘酚溶液1滴。

结果：

阳性者立即出现粉红色，并逐渐加深，变为淡紫色，再到深紫色，Ewing氏改进法阳性于0.5min内呈现鲜蓝色，对照菌为绿脓杆菌（铜绿假单细胞菌）；阴性者颜色无变化，Ewing氏法阴性为2min内不变色，对照菌为大肠杆菌。

1%盐酸二甲基对苯二胺溶液要避免接触含铁物质，防止出现假阳性反应。

此试剂应少量新鲜配制，于冰箱内避光保存，也可购置氧化酶试条。

该实验用于分辨革兰氏阴性杆菌中的肠杆菌科（阴性）与弧菌科（阳性）。

5.4.2触酶活力试验

原理：

具有触酶的细菌能催化过氧化酶，放出生态氧，继而形成氧分子，出现气泡。

方法：

取3%过氧化氢0.5ml，滴加到不含血液的被检细菌琼脂培养物上，或滴加到不含血液的肉汤培养物中，观察结果。

结果：

培养物出现气泡者为阳性。

说明：

过氧化氢浓度过高（30%）会产生气泡出现假阳性；血液中含有触酶，容易出现假阳性。

5.4.3硝酸盐还原试验

原理：

某些细菌能将培养基中的硝酸盐还原为亚硝酸盐，亚硝酸盐与醋酸作用生成亚硝酸，亚硝酸与试剂中的对氨基苯磺酸作用生成重氮苯磺酸，再与α-萘胺结合，生成N-α-萘胺偶氮苯磺酸（红色）。

方法：

将被检细菌接种于硝酸盐培养基中，37℃培养1~4天，每天吸取培养物2ml，加甲液（对氨基苯磺酸0.8g，5mol/L醋酸100ml）和乙液（α-萘胺0.5g，5mol/L醋酸100ml）各数滴，同时以为接种细菌的培养基作对照，观察结果。

结果：

出现红色为阳性。

说明：

亚硝酸盐在自然界分布很广，容易污染试剂，硝酸盐不纯或保管不妥也可能含有亚硝酸盐，因此必须做空白对照；繁殖迅速而还原硝酸盐能力强的细菌如果培养时间过久，可能将亚硝酸盐全部分解为氨和氮，出现假阴性反应，故需每天试验，空白对照。

5.5毒性酶类试验

5.5.1溶血试验

原理：

某些细菌在代谢过程中，产生溶血素，能使人或动物的红细胞发生溶解。

方法：

1）平板法：

将被检细菌接种到血液琼脂平板培养基上，37℃培养24h。

2）试管法：

取被检细菌16-18h肉汤培养物若干，加等量经生理盐水洗涤三次的2%羊红细胞悬液，置于37℃水浴箱中，30min后观察结果。

结果：

1）平板法：

若菌落周围出现透明的溶血环，为完全溶血（β溶血），菌落周围出现绿色溶血环