基因工程实验操作.docx

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基因工程实验操作

基因工程综合实验操作

大肠杆菌常规培养

大肠杆菌在LB（Luria–Bertani）液体培养基中，37℃水浴摇床培养12-16小时。

在LB固体培养基中，置于37℃培养箱培养12-16小时。

如果培养用于提取具有氨苄青霉素（Amp）抗性基因质粒（如pUC18）的菌体，则需在培养基中加入100mg/ml的氨苄青霉素。

在重组子克隆的鉴定培养中，LB固体培养基中还要加入特定的生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖苷（X-gal），浓度为40mg/ml，以及诱导物异基硫代-b-D-半乳糖苷（IPTG），浓度为50mg/ml。

大肠杆菌染色体DNA的抽提

1.大肠杆菌传一代后30ml液体LB培养基以10%接种量培养6小时，6000rpm，4℃，离心10分钟收获菌体沉淀。

2.沉淀中加入3.6mlBufferA（含溶菌酶5mg/ml），旋涡振荡混匀，37℃保温30分钟。

3.加入400ml10%SDS使最终浓度为1%，混匀，37℃保温30分钟或澄清即可。

4.加入10ml20mg/ml的ProK至最终浓度为1mg/ml，60℃保温60分钟。

5.加入1ml预先冷冻的5mol/LNaCl至最终浓度为1mol/L，充分混匀后冰浴30分钟。

6.4℃，15000rpm，离心30min。

7.取上清加入等体积（5ml）的苯酚饱和溶液，充分混匀后4℃，15000rpm，离心30分钟。

8.取上清加入等体积的氯仿充分混匀后13000rpm，4℃，离心10分钟。

9.取上清加入0.8V（4ml）异丙醇充分混匀后-20℃放置30分钟以上，4℃，15000rpm，离心30分钟。

10.弃上清，沉淀用3ml70%的冰乙醇洗涤，4℃，15000rpm，离心5分钟。

11.弃上清，沉淀于37℃凉干后，用1mlddH2O溶解并移入Eppendorf管中。

12.取5ml电泳。

BufferATris-HCl（pH8.0）10mM

EDTA（pH8.0）20mM

DNA酶切

在Eppendorf管中建立如下酶切反应体系：

置于37℃保温1.5小时，然后电泳检查

质粒DNA5ml

限制性内切酶1ml

10×酶切缓冲液1.5ml

无菌重蒸水8.5ml

总体积15ml

DNA琼脂糖凝胶电泳

1.用1×TAE–buffer配制0.7%的琼脂糖凝胶，在微波炉中加热至琼脂糖溶解。

2.待溶液冷却至60℃左右，加入溴化乙锭（用水配1mg/ml贮存液）至最终浓度为0.5mg/ml，充分混匀。

3.用透明胶封固玻璃板两头，在距底板0.5-1.0mm的位置上放置梳子，将温热的琼脂糖凝胶倒入胶模中，凝胶厚度

在3-5mm之间。

4.在凝胶完全凝固后，撕去透明胶，小心地将玻璃板移至装有1×TAE-buffer的电泳槽中，轻轻地拔去梳子，且使

缓冲液没过胶面约1mm。

5.DNA样品与溴酚蓝混合后，用微量取样器慢慢将混合物加至样品槽中。

6.盖上电泳槽并通电，使DNA向阳极（红线）移动。

采用100V电压进行电泳。

7.当溴酚蓝在凝胶中移出适当距离后（约半小时），切断电流，取出玻璃板，在紫外灯下观查凝胶。

50×TAE-buffer

Tris242g/l

冰醋酸57.1ml/l

EDTA0.4g/l

DIG分子杂交

I．DNA转移和固定

1.大肠杆菌染色体DNA（各1-2mg）分别用BamHI、EcoRI、PstI、HindIII酶切，电泳。

2.电泳拍照（胶边摆放尺以用于杂交阳性条带的定位），搭建转移台，在盛有0.4NNaOH的容器中依次摆放支架、玻板、普通滤纸、塑料薄膜（剪掉比凝胶尺寸略小一号的一块）、凝胶、尼龙薄膜和卷筒纸及500克重物，放置过夜。

注：

在摆放过程中要防止气泡的产生

3.次日取出尼龙膜，在槽口处用圆珠笔标记后，在6×SSC中洗涤30s，放于牛皮纸上，于80℃烘2h，放入保鲜膜内于–20℃存放或立即杂交。

II．oligonucleotidetailing

1.用无菌水溶解oligonucleotide至适当浓度。

2.在插入冰中的管中混合：

oligonucleotide100pmol

反应缓冲液（vial1）4ml

CoCl2溶液（vial2）4ml

DIG-dUTP溶液（vial3）1ml

dATP溶液（vial4）1ml

TdT（50units）（vial5）1ml

加无菌水至终体积20ml。

3.37℃保温15min，然后置于冰中，加入2ml糖原溶液（1mlvial9+200ml0.2MEDTA，pH8.0）。

4.终止标记反应后，加入2.5ml4MLiCl，75ml乙醇（-20℃预冷），沉淀oligonucleotide。

5.至少在-70℃放置30分钟或-20℃放置2h，15000转/分离心20min。

6.沉淀用50ml70%乙醇洗涤、晾干，用适当体积的无菌水溶解，保存于-20℃。

III．预杂交和杂交

1.把尼龙膜放入杂交管中，按20ml/100cm2加入预杂交液，于杂交炉中68℃保温至少1h。

2.将DIG标记的DNA探针（5~25ng/ml）煮沸10min，迅速插入盐冰中变性。

3.弃此预杂交液，按2.5ml/100cm2膜加入含5-25ng/ml标记探针的杂交液。

4.膜在杂交温度保温6-16hr。

5.在杂交温度洗涤：

a至少50ml/100cm22×SSC，SDS，0.1%（w/v）5min2次

b0.1×SSC，SDS，0.1%（w/v）5min2次

6.膜可立即检测或晾干后保存。

IV.免疫检测

1.杂交后严格洗涤，把膜直接浸入Washingbuffer中1-5min。

2.在100mlBlockingsolution（1×conc）放置30min。

3.用BlockingSolution（1×Conc把anti-DIG-APconjugate稀释至150mU/ml，50ml中有10mlanti-DIG-APconjugate）。

4.膜在50ml抗体溶液中放置30min。

5.100mlWashingbuffer洗膜15min×2次。

6.膜在20mlDetectionbuffer中平衡2-5min。

7.膜在新配的10mlColor-substratesolution中放置5min（置于黑暗中），注意在显色过程中不要摇动。

8.几分钟后有色物质开始生成，反应一般在16h后达到完全。

9.颜色达到一定强度后，可用50mlH2O洗膜5min来终止反应。

10.结果拍照保留。

20×SSC

NaCl3mol/l

Na-citrate0.3mol/lpH7.0

Buffer1

Maleicacid0.1mol/l

NaCl0.15mol/lpH7.5用固体NaOH调节

10×Blocking

Blockingreagent10%溶于Buffer1，灭菌后存于4℃

杂交Buffer用于寡核苷酸探针的杂交

5×SSC

Blockingreagent1%使用前加入polyA（vial11）

N-lauroylsarkosine0.1%终浓度为0.1mg/ml

SDS0.02%

2×预杂交液用于DNA片段探针的杂交

12×SSC使用时加入SDS，终浓度为0.5%

10×Denhardts试剂

鲑鱼精子DNA碎片200mg/ml

WashingBuffer

Tween200.3%加入Buffer1中

Detectionbuffer

Tris-HCl0.1mol/l显色中每10ml加入200µl

NaCl0.1mol/lNBT/BCIPstocksolution

MgCl250mmol/l

pH9.5

PCR法体外扩增phoA（碱性磷酸单脂酶基因）

1.按如下体积加入各反应物：

总体积50ml

ddH2O20.5ml

10×buffer5ml

Mg2+（2.5mM）5ml

dNTP（2.5mM）4ml

Primer1（10pmol/ml）10ml

Primer2（10pmol/ml）10ml

染色体DNA（约100ng/ml）5ml

Taq酶（5U/ml）0.5ml

2.充分混匀后按下列条件进行反应：

　　　　　　　　97℃　5min　　　　　　　　　

　　　　　　　　95℃　30s　　　　　　　　

　　　　　　　　57℃　1min30个循环　　　　　　

　　　　　　　　72℃　2min　　　　　　

　　　　　　　　72℃　10min　　　　　　　

　　　　　　　　4℃　∞　　　　　　　　　

　3.取50％采用琼脂糖凝胶电泳检查产物情况，扩增产物集中于1.5kb片段的位置附近，割下该位置的凝胶进行外源DNA的回收。

　4.回收的PCR扩增产物直接与pMD18-T载体连接，连接反应如下：

SolutionIPMD18-TPCR产物∑

5ml1ml4ml10ml

5.16℃连接1h以上，用于转化。

DNA的琼脂糖凝胶回收

1.用手术刀在DNA紫外检测仪下切割下含有所要DNA片段的凝胶块置于Eppendorf管中，加入100ml重蒸水。

2.用牙签将凝胶块尽量捣碎，剪去管的上部，用烧红的针头在管底扎几个微孔，孔径越细越好。

3.将管套入另一个Eppendorf管中，常温下，15000rpm离心10分钟。

4.将上清液吸到收集管中，向沉淀中加入100ml重蒸水。

5.重复步骤

（2）、（3）、（4）各一次，见图。

6.收集的上清液加入0.1V的KAc（PH5.5，3M）和2.0-2.5V的无水乙醇，充分混匀后-20℃放置30min，取

出15000rpm，4℃离心30min。

7.弃上清，加入400ml70％的乙醇，15000rpm，4℃离心5min。

8.弃上清，沉淀凉干后用20mlddH2O溶解待用。

大肠杆菌感受态细胞的制备

1.用牙签挑取少许宿主菌保藏液稀释划线于LB固体培养基上，37℃下隔夜培养。

2.挑取单菌落接种于30mlLB液体培养基中，37℃下隔夜培养。

3.按1%的接种量将大肠杆菌菌液接种于30mlLB培养基中。

4.在37℃的水浴摇床中培养1.5小时，OD600接近0.5。

5.4℃，6000rpm离心10分钟收获菌体。

6.上述得到的菌体沉淀用10ml的10mmol/LCaCl2（冰冻）悬浮，4℃，6000rpm离心10分钟。

7.弃上清，将沉淀用1ml的75mmol/lCaCl2（冰冻）重新悬浮并转入无菌Eppendorf管中。

8.冰水浴中放置8h即可使用。

大肠杆菌的转化

1.取一管已制备好的大肠杆菌感受态细胞置于冰水浴中。

2.吸取90ml感受态细胞悬浮液至无菌Eppendorf管中，加入10mlDNA溶液，轻轻混匀，在冰水浴中放置30分钟。

3.42℃水浴中脉冲2分钟，快速转移至冰水浴中，加入900mlLB培养基，37℃水浴摇床培养1-1.5小时。

4.吸取100ml已转化的感受态细胞涂布于100mg/mlAp和40mg/mlX-gal的LB平板上。

5.37℃下倒置培养12-16小时，挑选单菌落划线扩增培养。

沸水浴法快抽大肠杆菌质粒DNA

1.在Eppendorf管中加入110ml的STET（使用前加入溶菌酶至终浓度为5mg/ml）溶液，挑入米粒大小的菌团，充

分悬浮并混匀。

2.上述菌体悬浮液沸水煮30秒。

3.迅速放置于常温下15000rpm离心15分钟。

4.用牙签挑去菌体碎片（白色沉淀），在上清液中加入100ml的异丙醇，充分混匀后4℃，15000rpm离心20分钟。

5.弃上清液，加入70%冰乙醇400ml，4℃，15000rpm离心5分钟。

6.沉淀凉干后用50ml无菌重蒸水溶解。

7.取5ml电泳检测。

STET：

蔗糖8％

TritonX-1005％

Tris-HCl（PH8.0）50mM

EDTA（PH8.0）50mM

碱溶法制备大肠杆菌质粒DNA

1.1.5ml培养物6000rpm，4℃离心10分钟，弃去上清液。

2.加入100ml溶液I悬浮菌体，室温放置5分钟。

3.加入200ml溶液II，立即轻轻混匀，室温放置至溶液几乎澄清。

4.加入150ml溶液III，轻轻混匀，冰浴30分钟。

5.4℃，15000rpm离心20分钟，收集上清液。

6.上清液中加入等体积的苯酚饱和溶液（400ml）氯仿，充分混匀，4℃，15000rpm离心20分钟，将上清液转移至另一离心管。

7.在上清液中加入400ml氯仿溶液，混匀，10000rpm离心10分钟，将上清液转移至另一离心管。

8.在上清液中加入400ml异丙醇，–20℃放置30分钟，4℃，15000rpm离心20分钟。

9.用400ml75%的冰乙醇洗涤一次，凉干。

10.加入50ml无菌重蒸水溶解质粒DNA。

11.取2ml作酶切电泳检查。

溶液I

D-Glucose50mmol/L

Tris-HCl（pH8.0）50mmol/L

EDTA（pH8.0）10mmol/L

121℃消毒20分钟，使用时加入溶菌酶，终浓为5mg/ml

溶液II

SDS1%

NaOH0.2mol/L

溶液III

KAc（pH5.5）3mol/L

工程菌发酵

1.挑取少量pET11a-phoA/BL21（DE3）菌体接种于含Ap（终浓度100mg/ml）的30mlLB液体培养基中，于37℃培养过夜；以相同条件接种pET11a/BL21（DE3）为对照。

2.以1%的接种量将上述一级培养物接种于含Ap（终浓度100mg/ml）的100mlLB液体培养基中，恒温培养2h后（OD600约为0.5），加入诱导剂IPTG终浓度1mM，继续37℃培养。

3.诱导后培养3h后收集菌体，4℃，6000rpm离心10min，弃上清液，菌体沉淀置于-20℃保存待用。

细胞裂解

1.以5ml碳酸钠-碳酸氢钠重新悬浮菌体沉淀，冰浴超声裂解细胞。

2.超声波裂解液于4℃，15000rpm离心30min，取上清液待用。

碳酸钠-碳酸氢钠溶液（0.1M，PH10.0）

Na2CO31.06%

NaHCO30.84％

碱性磷酸单酯酶的活力测定

1.以下列体系进行酶活测定的反应：

反应体系NPPBuffer酶液NaOH（0.5M）

3.0ml0.6ml1.2-XX1.2

2.底物NPP加入Buffer（碳酸钠-碳酸氢钠溶液）后，底物与酶分别于37℃预热3-5min，然后混合37℃保温30min，加入NaOH终止反应。

3.参比管预热后先加入NaOH再加入酶保温。

4.上述测活反应液与405nm测定吸收值。

SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳

1.安装玻璃板并确定所需凝胶溶液体积。

2.迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液约4.5ml，并于其上覆盖一层水。

3.分离胶聚合完全后（约20min），倾出覆盖液体。

4.在分离胶上层直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入梳子，避免产生气泡。

5.用LoadingBuffer处理样品菌体，在100℃加热5min左右，使蛋白质变性。

6.浓缩胶聚合后小心移出梳子，用无菌水洗涤加样槽以除去未聚合的丙烯酰胶后，按顺序加样。

7.接通电泳装置，凝胶上所加电压为8V/cm，当染料前沿进入分离胶后，电压提高到15V/cm，继续电泳至溴酚蓝到达分离胶底部。

8.卸下玻璃板，标记凝胶加样方位，用考马斯亮蓝染色液（StainingBuffer）对凝胶进行染色，至少1h以上。

9.移出凝胶，回收染色液，用DestainingBuffer进行脱色1-2小时，其间应更换脱色液三四次。

10.凝胶保存于水中，或把凝胶干燥成胶片保存。

　5×SDS-PAGEBufferSDS-PAGE电泳缓冲液，用时稀释5倍

Tris15.1g/l

甘氨酸94g/l

SDS（10%）50ml/l

SDS-PAGE分离胶（10ml）浓缩胶（5ml）

H2O3.7ml3.3ml

Acryl-bis（3.3c）3.6ml0.91ml

Tris-HCl2.5ml（1.5M，pH8.8）0.63ml（1.0M，pH6.8）

SDS（10%）0.1ml0.05ml

过硫酸铵（10%）0.1ml0.05ml

TEMED4ml5ml

2×LoadingBuffer

Tris-HCl100mM

SDS4%

溴酚蓝0.2%

甘油20%

SDS-PAGEStainingBufferDestainingBuffer

乙醇30%30%

乙酸10%10%

水60%60%

考马斯亮蓝0.25-0.5%

碱性磷酸单酯酶提取

试剂：

50mmol／LTris-HCl（pH7.0）

pH7.60.5mol/LTris-HCl

实验步骤：

1.将诱导表达的碱性磷酸酶的菌液以5000rpm离心15min，收集菌体；

2.将收集的菌体以10mL/g湿菌体的比例，用50mmol/LTris-HCl（pH7.0）悬浮，再用超声波破膜；

3.菌裂解液于4℃，15000rpm离心20min，取上清液。

4.上清液加入NaCl至终浓度为0.8mol/L，70℃水浴30min，12000rpm离心10min，丢弃沉淀；

5.上清液于0℃边搅拌边加入固体硫酸铵至60％饱和度，静置2-4h，12000rpm离心20min，弃上清液。

沉淀用1/10体积的pH7.60.5mol/LTris-HCl缓冲液溶解，于4℃对相同缓冲液透折。

直至透析袋内外平衡。

透析好的样品进行离子交换柱层析。

包涵体中碱性磷酸单酯酶提取

试剂：

50mmol/LTris-HClpH8.0

3mol/L脲（0.1mol/Tris-HClpH8.0）

TE缓冲液

0.5mmol/L氧化型谷胱甘肽

4mmol/L还原型谷胱甘肽溶液

实验步骤：

1.将诱导表达的碱性磷酸酶的菌液以5000rpm离心15min，收集菌体；

2.约每克湿菌加3ml的量悬浮于50mmol/LTris-HClpH8.0，含1mmol/LEDTA的缓冲液中进行超声破碎；

3.超声破菌后1200rpm，4℃离心30min进行固液分离，用TE缓冲液反复洗涤除去可溶性杂蛋白，核酸及外加溶质等；

4.用9倍量的变性剂3mol/L脲（0.1mol/Tris-HClpH8.0）和0.5%TrtonX-100的TE缓冲液分别洗涤；

5.将包涵体溶于变性液50mmol/LTris-HCl，1mmol/LLEDTA，8mmol/L脲（pH8.0），12000rpm离心30min；

6.取上清液，在0.25mmol/L氧化型谷胱甘肽和2mmol/L还原型谷胱甘肽溶液中，4℃透析过夜；透析液浓缩备用。

临用前加相应缓冲液至一定体积。

离子交换柱层析纯化碱性磷酸单酯酶

试剂DEAE-纤维素32

0.02mol/L对硝基酚磷酸二钠

pH7.60.5MTris-HCl缓冲液

pH7.60.5MTris-HCl（内含0.3NNaCl）缓冲液

pH10.00.1MNa2CO3-NaHCO3的底物缓冲液

实验步骤：

I．DEAE-纤维素预处理

1.称取5克DE-32，于小烧杯中，加入75毫升0.5mol/LHCl的烧杯中，于室温轻轻搅拌30分钟。

2.将糊状物移入布氏漏斗中，用蒸馏水淋洗并浸泡5分钟，不时轻轻搅拌，抽滤。

如此重复，每加一次去离子水，浸泡一段时间，再进行抽滤，至洗涤液pH等于4。

3.将糊状物移入烧杯中，加入75毫升0.5mol/LNaOH，于室温轻轻搅拌30分钟后，将交换剂移入布氏漏斗中，反复用去离子水淋洗、抽滤，直至洗涤液pH为8，抽干。

4.将DEAE-纤维素移入烧杯中，浸泡在150毫升去离子水中。

用0.5mol/LHCl把pH调至7.6左右（可在pH计上进行或用pH试纸调试），须使悬液最终pH在10分钟内无变化，然后抽滤。

5.将上述滤块置于100毫升烧杯中，加入75毫升pH7.60.5mol/LTris-HCl缓冲液轻轻搅拌之后，静置20分钟，用倾斜法除去上清液中细微粒子，如此重复若干次，最后上清液pH值与缓冲液几乎一致。

6.将含有1倍体积pH7.60.5mol/LTris-HCl缓冲液的DEAE-纤维素浆液含放在抽滤瓶中减压除尽气泡。

备用。

II.装柱

1.层析柱（1.0×20cm）清洗后，用去离子水洗涤一遍。

柱的下端联接好流出液引导塑料管，塑料管末端接上小乳胶管，在乳胶管上装上螺旋夹。

2.关紧螺旋夹。

柱内装入适量的pH7.60.5MTris-HCl缓冲液，微开螺旋夹。

让缓冲液缓慢流出，赶走层析柱的流出液引导塑料管内的气泡，柱中仍保留少量缓冲液，关紧螺旋夹。

3.将减压除尽气泡的DE